本發(fā)明屬于免疫診斷領(lǐng)域，具體涉及一種重組質(zhì)粒及其用途。
背景技術(shù)：
：雙鏈dna(dsdna)抗體是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(sle)的高度特異抗體，抗體水平變化與病情活動(dòng)相關(guān)，被稱為sle的“標(biāo)記抗體”，dsdna抗體對(duì)于sle的診斷和預(yù)后具有重要的指導(dǎo)意義。目前實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)dsdna抗體的方法主要有放免法、間接免疫熒光法、斑點(diǎn)免疫金滲濾法、免疫印記法和酶聯(lián)免疫(elisa)法。其中，elisa法檢測(cè)dsdna抗體具有無(wú)放射性同位素污染、操作便捷、靈敏度高、適用于高通量樣本測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)，在臨床上被廣泛使用，具有較好的市場(chǎng)價(jià)值。制備dsdna抗體檢測(cè)elisa試劑盒，主要的技術(shù)瓶頸是dsdna抗原，dsdna抗原選擇不當(dāng)，就無(wú)法制備出特異性強(qiáng)、結(jié)合良好的抗原包被板，不能保證elisa試劑盒檢測(cè)的準(zhǔn)確性。目前市場(chǎng)上檢測(cè)dsdna抗體使用的elisa試劑盒，幾乎全采用進(jìn)口原裝和分裝試劑盒，價(jià)格昂貴，檢測(cè)成本高。因此，臨床上仍急需開(kāi)發(fā)dsdna抗體的抗原及試劑盒。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種重組質(zhì)粒及其用途。本發(fā)明提供了一種重組質(zhì)粒，它是在pgex-6p-1質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)區(qū)引入2個(gè)seqidno：1所示的核苷酸序列構(gòu)建而成。其中，它是分別在pgex-6p-1質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)區(qū)的bamhi酶和ecori酶之間、ecori酶和xhoi酶之間引入seqidno：1所示的核苷酸序列構(gòu)建而成。其中，上述重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法如下：a、以人cdna為模板，以seqidno：2-3所示的核苷酸序列為引物，擴(kuò)增得到pcr產(chǎn)物，純化后用bamhi酶、ecori酶進(jìn)行雙酶切，得到片段1；b、對(duì)載體質(zhì)粒pgex-6p-1用bamhi酶、ecori酶進(jìn)行雙酶切；并與片段1連接，得到載體1；c、以人cdna為模板，以seqidno：4-5所示的核苷酸序列為引物，擴(kuò)增得到pcr產(chǎn)物2，純化后用ecori酶、xhoi酶進(jìn)行雙酶切，得到片段2；d、對(duì)步驟b得到的載體1用ecori酶、xhoi酶進(jìn)行雙酶切；并與片段2連接，即可。其中，所述質(zhì)粒為非甲基化狀態(tài)的質(zhì)粒。本發(fā)明還提供了上述重組質(zhì)粒在制備檢測(cè)雙鏈dna抗體的抗原中的用途。本發(fā)明還提供了一種重組菌，它包含上述的重組質(zhì)粒；優(yōu)選地，所述重組菌為大腸桿菌hst-04菌株。本發(fā)明還提供了一種雙鏈dna抗原包被板，它包被有權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的重組質(zhì)粒。本發(fā)明還提供了上述抗原包被板的制備方法，步驟如下：a、酶標(biāo)板的預(yù)處理：取聚丙乙烯板條，用hcl溶液浸泡1h，紫外線照射過(guò)夜；b、每孔加入1g/l魚(yú)精蛋白，4℃過(guò)夜；c、用洗滌液洗三次、拍干，每孔加入上述的重組質(zhì)粒，4℃過(guò)夜；d、用洗滌液洗三次、拍干，再用125u肝素或含5％bsa的pbs4℃封閉過(guò)夜；e、用洗滌液洗三次、拍干，即可；優(yōu)選地，所述洗滌液為含0.005％吐溫-20的pbst溶液；優(yōu)選地，每孔質(zhì)粒濃度為20ng。本發(fā)明還提供了一種elisa檢測(cè)試劑盒，它是檢測(cè)待檢樣品中的雙鏈dna抗體的elisa檢測(cè)試劑盒，以上述的重組質(zhì)粒為抗原；其中，它還包括洗滌液、酶標(biāo)二抗、顯色液以及終止液；優(yōu)選地，所述洗滌液為含0.05％吐溫-20的tris緩沖液；所述酶標(biāo)二抗為辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的人igg；所述顯色液為tmb顯色液；所述終止液為濃度為0.25mol/l的hcl溶液。本發(fā)明還提供了上述抗原包被板、elisa檢測(cè)試劑盒在制備檢測(cè)雙鏈dna抗體的試劑中的用途。seqidno：1mpo基因序列：atgggggttcccttcttctcttctctcagatgcatggtggacttaggaccttgctgggctgggggtctcactgcagagatgaagctgcttctggccctagcagggctcctggccattctggccacgccccagccctctgaaggtgctgctccagctgtcctgggggaggtggacacctcgttggtgctgagctccatggaggaggccaagcagctggtggacaaggcctacaaggagcggcgggaaagcatcaagcagcggcttcgcagcggctcagccagccccatggaactcctatcctacttcaagcagccggtggcagccaccaggacggcggtgagggccgctgactacctgcacgtggctctagacctgctggagaggaagctgcggtccctgtggcgaaggccattcaatgtcactgatgtgctgacgcccgcccagctgaatgtgttgtccaagtcaagcggctgcgcctaccaggacgtgggggtgacttgcccggagcaggacaaataccgcaccatcaccgggatgtgcaacaacagacgcagccccacgctgggggcctccaaccgtgcctttgtgcgctggctgccggcggagtatgaggacggcttctctcttccctacggctggacgcccggggtcaagcgcaacggcttcccggtggctctggctcgcgcggtctccaacgagatcgtgcgcttccccactgatcagctgactccggaccaggagcgctcactcatgttcatgcaatggggccagctgttggaccacgacctcgacttcacccctgagccggccgcccgggcctccttcgtcactggcgtcaactgcgagaccagctgcgttcagcagccgccctgcttcccgctcaagatcccgcccaatgacccccgcatcaagaaccaagccgactgcatcccgttcttccgctcctgcccggcttgccccgggagcaacatcaccatccgcaaccagatcaacgcgctcacttccttcgtggacgccagcatggtgtacggcagcgaggagcccctggccaggaacctgcgcaacatgtccaaccagctggggctgctggccgtcaaccagcgcttccaagacaacggccgggccctgctgccctttgacaacctgcacgatgacccctgtctcctcaccaaccgctcagcgcgcatcccctgcttcctggcaggggacacccgttccagtgagatgcccgagctcacctccatgcacaccctcttacttcgggagcacaaccggctggccacagagctcaagagcctgaaccctaggtgggatggggagaggctctaccaggaagcccggaagatcgtgggggccatggtccagatcatcacttaccgggactacctgcccctggtgctggggccaacggccatgaggaagtacctgcccacgtaccgttcctacaatgactcagtggacccacgcatcgccaacgtcttcaccaatgccttccgctacggccacaccctcatccaacccttcatgttccgcctggacaatcggtaccagcccatggaacccaacccccgtgtccccctcagcagggtcttttttgcctcctggagggtcgtgctggaaggtggcattgaccccatcctccggggcctcatggccacccctgccaagctgaatcgtcagaaccaaattgcagtggatgagatccgggagcgattgtttgagcaggtcatgaggattgggctggacctgcctgctctgaacatgcagcgcagcagggaccacggcctcccaggatacaatgcctggaggcgcttctgtgggctcccgcagcctgaaactgtgggccagctgggcacggtgctgaggaacctgaaattggcgaggaaactgatggagcagtatggcacgcccaacaacatcgacatctggatgggcggcgtgtccgagcctctgaagcgcaaaggccgcgtgggcccactcctcgcctgcatcatcggtacccagttcaggaagctccgggatggtgatcggttttggtgggagaacgagggtgtgttcagcatgcagcagcgacaggccctggcccagatctcattgccccggatcatctgcgacaacacaggcatcaccaccgtgtctaagaacaacatcttcatgtccaactcatatccccgggactttgtcaactgcagtacacttcctgcattgaacctggcttcctggagggaagcctcctag本發(fā)明提供的重組質(zhì)粒，生產(chǎn)成本低，可以在較低濃度下作為抗原制備包被效果優(yōu)良的抗原包被板，以準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)dsdna抗體。本發(fā)明提供的檢測(cè)試劑盒通過(guò)檢測(cè)dsdna抗體的水平，可以判斷正常人和疑似系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的dsdna抗體表達(dá)水平差異，進(jìn)而篩查待檢人群患系統(tǒng)性紅斑狼瘡的風(fēng)險(xiǎn)：若dsdna抗體的表達(dá)水平高，則患系統(tǒng)性紅斑狼瘡的風(fēng)險(xiǎn)高，若dsdna抗體的表達(dá)水平低，則患系統(tǒng)性紅斑狼瘡的風(fēng)險(xiǎn)低，可用于臨床系統(tǒng)性紅斑狼瘡的輔助診斷。本發(fā)明試劑盒靈敏度優(yōu)于市售產(chǎn)品，對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡檢測(cè)效果好，而且本發(fā)明試劑盒制備簡(jiǎn)單，成本低廉，市場(chǎng)前景良好。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。附圖說(shuō)明圖1gst質(zhì)粒圖譜圖2gst-2mpo質(zhì)粒圖譜圖3重組質(zhì)粒gst-mpo以及gst-2mpo雙酶切驗(yàn)證圖1.gst-mpo；2.gst-2mpo；3.marker圖4甲基化gst質(zhì)粒與gst-2mpo質(zhì)粒的對(duì)比(n＝5)(**:p<0.01)圖5gst-2mpo甲基化與非甲基化的對(duì)比(n＝5)(**:p<0.01)圖6不同濃度魚(yú)精蛋白的影響(n＝5)1.魚(yú)精蛋白濃度20mg/ml；2.魚(yú)精蛋白濃度10mg/ml；3.魚(yú)精蛋白濃度5mg/ml；4.魚(yú)精蛋白濃度1mg/ml；5.魚(yú)精蛋白濃度0.5mg/ml；6.魚(yú)精蛋白濃度0.1mg/ml。具體實(shí)施方式下面以實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明不局限于這些實(shí)施例。本發(fā)明所用的實(shí)驗(yàn)材料試劑與儀器如下：1.1材料(1)e.colidh5α(de3)菌株(2)e.colihst-04菌株：購(gòu)自takara公司。(3)gst質(zhì)粒：為市售的pgex-6p-1質(zhì)粒，圖譜見(jiàn)圖1。(4)人cdna：購(gòu)自艾博思生物公司。1.2主要試劑(1)多聚-l-賴氨酸(2)魚(yú)精蛋白(3)限制性內(nèi)切酶：bamhi、ecori和xhoi(fermentors公司)(4)質(zhì)粒小抽提取試劑盒(道普生物科技有限公司)(5)膠回收試劑盒(道普生物科技有限公司)(6)辣根過(guò)氧化物酶(hrp)標(biāo)記的抗人igg抗體(sigma公司)(7)tmb-2hcl(sigma公司)(8)抗dsdna抗體體外診斷試劑盒(新建康成生物科技有限公司)1.3試劑配方(1)tae電泳緩沖液(50×)tris242gedta.2na.2h2o37.2g加800ml蒸餾水后充分?jǐn)嚢枞芙猓偌尤?7.1ml乙酸，充分混勻，定容至1000ml，4℃保存。(用時(shí)用蒸餾水稀釋至1×)(2)低鹽液體lb培養(yǎng)基蛋白胨(tryptone)10g酵母粉(yeastextract)5gnacl5g加950ml的蒸餾水，用1mol/lnaoh調(diào)ph7.4，定容至1000ml，分裝高壓滅菌，4℃保存。(3)低鹽固體lb培養(yǎng)基在低鹽lb培養(yǎng)基加入瓊脂粉至終濃度為2％高壓滅菌，4℃保存。(4)0.01mol/lpbs(ph7.2-7.4，1l)0.2mmol/lnah2po49.5ml0.2mmol/lna2hpo440.5mlnacl8.5g(5)堿裂解法①號(hào)液(ph8.0，1l)50mmol/l葡萄糖9.9085g25mmol/ltris-hcl3.0285gedta3.722g(6)堿裂解法②號(hào)液(1l)200mmol/lnaoh8g1％sds10g(7)堿裂解法③號(hào)液(ph5.0，1l)3mol/l醋酸鉀294.42g醋酸調(diào)ph至5.01.4主要儀器(1)uv1102紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海天美科技有限公司)(2)高速冷凍離心機(jī)(eppendorf公司)(3)水平電泳系統(tǒng)(bio-rad公司)(4)凝膠成像系統(tǒng)(gene公司)(5)ph計(jì)(phs-320，成都試劑方舟科技有限公司)(6)恒溫水浴箱:s.hh.w21-600-ii指針式三用電熱恒溫水溫箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械公司)(7)核酸蛋白測(cè)定儀(nanodorp-1000公司)(8)純水儀(millipore公司)(9)超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)(10)移液槍(0.1-2.5μl,1-10μl,20-200μl,100-1000μl；eppendorf公司)。實(shí)施例1本發(fā)明重組質(zhì)粒的制備1、gst-2mpo質(zhì)粒的構(gòu)建1.1pcr擴(kuò)增mpo基因(1)引物設(shè)計(jì)根據(jù)mpo基因序列設(shè)計(jì)引物表1mpo的引物1序列表2mpo的引物2序列(2)pcr擴(kuò)增基因：按下列組成在pcr反應(yīng)管中調(diào)制反應(yīng)液，按如下反應(yīng)體系進(jìn)行，其中，上下引物為表1的引物1組合。表3pcr反應(yīng)體系表4pcr反應(yīng)條件反應(yīng)結(jié)束后，抽取擴(kuò)增樣品5μl，用瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增結(jié)果，用dnamarker判斷片段大小或冷凍保存，以備以后分析使用。1.2小抽試劑盒提取載體(gst)質(zhì)粒(1)將菌液用涂布棒接種到加入抗生素的固體lb培養(yǎng)基中37℃恒溫性培養(yǎng)過(guò)夜。(2)挑取單菌落到液體lb培養(yǎng)基中，220×g37℃搖床生長(zhǎng)12小時(shí)。(3)取5ml菌液，在13,000轉(zhuǎn)下離心1min棄上清。(4)取250μl①號(hào)液使沉淀完全重懸。(5)取250μl②號(hào)液加入懸浮液中，上下翻轉(zhuǎn)6-10次，直至液體變清亮。(6)加入400μl③號(hào)液，立即輕柔混合，室溫放置5min后13,000×g離心10min.(7)將試劑盒中柱子加入500μl④號(hào)液13,000×g離心1min后棄濾液。(8)將步驟6上清加入柱子13,000×g離心1min后棄濾液。(9)加入500μl⑤號(hào)液裝柱，13,000×g離心1min后棄濾液。(10)加入600μl⑥號(hào)液13,000×g離心1min后棄濾液。(11)上步驟重復(fù)一次，空柱再離心一次，室溫放5min后除去殘留乙醇。(12)將柱裝置于新的2ml離心管中，膜中央加入50μl60℃無(wú)菌水,13,000×g離心1min洗脫。(13)將洗脫下來(lái)質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖電泳，利用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)量濃度，-20℃保存。1.3載體(gst)和目的基因(mpo質(zhì)粒)的雙酶切(1)載體(gst)酶切反應(yīng)體系，37℃水浴3h后加入ecori酶切，30min后取出。表5雙酶切反應(yīng)體系(2)目的基因(mpo)酶切反應(yīng)表6雙酶切反應(yīng)體系37℃水浴3h后加入ecori酶切，30min后取出。(3)1％瓊脂糖凝膠電泳用1×tae緩沖液配制1％的瓊脂糖凝膠，混勻后，微波爐加熱煮沸，直至瓊脂糖完全溶解。待凝膠冷卻至70℃左右時(shí)加入染料混勻，倒入膠板中，插入適當(dāng)?shù)氖猃X，室溫放置30min，待凝膠完全凝固，拔出梳齒，將膠板放入電泳槽中。用加樣器吸取樣品5μl與1μl上樣緩沖液混合，將樣品緩慢加入加樣孔中，100v/20min，電泳完畢后，紫外燈下觀察結(jié)果，并用凝膠成像系統(tǒng)掃描電泳結(jié)果。(4)膠回收①電泳完后切取瓊脂糖凝膠中的目的dna條帶，放入干凈的離心管中稱重，每100mg凝膠中加入300μl的體積溶膠液，于55℃水浴融膠10min，間斷(2～3min)混合，確保膠塊完全融化，當(dāng)膠完全融化后，觀察溶液的顏色，如顏色為紅色，加入適量3mol/l醋酸鈉(ph5.2)，調(diào)整顏色和溶膠液顏色相同(黃色)。②待融化的凝膠溶液降至室溫，加入吸附柱中靜置1min，12,000×g離心1min，棄流出液。③加入700μl溶液washbuffer，12,000×g離心1min，棄流出液。④12,000×g離心1～2min，去除殘留的washbuffer。⑤將吸附柱置于一干凈的離心管中，在柱的中央加入30μl去離子水，室溫靜置1min，12,000×g離心1min，洗脫dna。將洗脫出的dna于-20℃保存。⑥取洗脫溶液1μl測(cè)定dsdna的濃度。1.4載體(gst)和目的基因(mpo)連接按如下反應(yīng)體系進(jìn)行表7連接反應(yīng)體系22℃1h1.5cacl2法制備感受態(tài)細(xì)胞(1)劃線(無(wú)選擇性lb-agar平板)，37℃培養(yǎng)16-20h。(2)挑單菌落到2mllb培養(yǎng)液中，37℃,300rpm搖菌過(guò)夜。(3)取1ml過(guò)夜菌液到100mllb培養(yǎng)液中，37℃,300rpm搖菌約3h，檢測(cè)od600nm約0.4。(4)將菌液轉(zhuǎn)移到50mlbd管中，冰上放置10min。(5)4℃，4000×g，離心10min，倒出培養(yǎng)液，倒置1min。(6)用0.1mol/lcacl2-mgcl2(80mmol/lmgcl2,20mmol/lcacl2)溶液30ml重懸細(xì)胞沉淀,冰上30min。(7)4℃，4000×g，離心5min，到出培養(yǎng)液，倒置1min。(8)用2ml預(yù)冷0.1mmol/lcacl2-15％甘油重懸細(xì)胞沉淀，將其200μl/管分裝到滅菌ep管中，凍存于-80℃保存。1.6連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化(1)-80℃取出感受態(tài)細(xì)胞dh5α(de3)，冰上融化。(2)加入1μl(50ng)待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒；冰上放置30min(間隔震蕩)。(3)42℃，90s(勿震蕩)，冰浴2min，加lb培養(yǎng)基800μl，37℃,50rpm(溫柔搖菌)，50min。(4)取100μl菌液涂板至液體完全被吸收，倒置平皿，37℃培養(yǎng)16h，觀察菌落。1.7小抽試劑盒提取質(zhì)粒dna(1)挑單菌落到5ml選擇性lb培養(yǎng)液中，37℃，220rpm，14-18h。(2)取5ml在lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜的菌液12,000×g離心1min，棄盡上清。(3)加250μlbuffers1懸浮細(xì)菌沉淀，懸浮需均勻，不應(yīng)留有小的菌塊。(4)加250μlbuffers2，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)4-6次混合均勻使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步驟不宜超過(guò)5min。(5)加350μlbuffers3，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合6-8次，12,000×g離心10min。(6)吸取步驟4中的離心上清并轉(zhuǎn)移到制備管，12,000×g離心1min，棄濾液。(7)將制備管置回離心管，加500μlbufferw1，12,000×g離心1min，棄濾液。(8)將制備管置回離心管，加700μlbufferw2，12,000×g離心1min，棄濾液；以同樣的方法再用700μlbufferw2洗滌一次，棄濾液。(9)將制備管置回2ml離心管中，12,000×g離心1min。(10)將制備管移入新的1.5ml離心管中，在制備管膜中央加60-80μl去離子水，室溫靜置1min。12,000×g離心1min。1.8構(gòu)建gst-2mpo質(zhì)粒參照構(gòu)建gst-mpo的方法構(gòu)建gst-2mpo，步驟如下：用引物2組合擴(kuò)增出mpo片段，用ecori,xhoi雙酶切mpo片段；同樣雙酶切g(shù)st-mpo質(zhì)粒；然后連接雙酶切后的mpo片段和gst-mpo質(zhì)粒，即可。gst-2mpo質(zhì)粒的圖譜見(jiàn)圖2。2、獲得甲基化gst-2mpo質(zhì)粒挑取單顆菌落利用小抽試劑盒提取質(zhì)粒，得到甲基化gst-2mpo質(zhì)粒。將質(zhì)粒用上述限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切驗(yàn)證，重組質(zhì)粒gst-mpo用bamhi、ecori，gst-2mpo用ecori,xhoi來(lái)進(jìn)行雙酶切，酶切后進(jìn)行1％瓊脂糖電泳檢測(cè)。驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)圖3。3、獲得非甲基化gst-2mpo質(zhì)粒3.1構(gòu)建非甲基化質(zhì)粒菌株(1)-80℃取出感受態(tài)細(xì)胞(hst-04)，冰上融化。(2)加入1μl(50ng)待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒；冰上放置30min(間隔震蕩)。(3)42℃，90s(勿震蕩)，冰浴2min，加lb培養(yǎng)基800μl，37℃,50rpm(溫柔搖菌)，50min。(4)取100μl菌液涂板至液體完全被吸收，倒置平皿，37℃培養(yǎng)16h，觀察菌落。3.2挑取單克隆菌落，提取非甲基化gst-2mpo質(zhì)粒，備用。實(shí)施例2本發(fā)明dsdna抗原包被板的制備步驟如下：1、酶標(biāo)板的預(yù)處理：用每孔100μl1mmol/lhcl室溫浸泡預(yù)處理聚丙乙烯板條1h，紫外照射過(guò)夜。2、每孔加入100μl1g/l多聚-l-賴氨酸或1g/l魚(yú)精蛋白4℃過(guò)夜。3、用含0.005％吐溫-20的pbst洗三次、拍干，每孔100μl200ng/ml質(zhì)粒4℃過(guò)夜。4、用含0.005％吐溫-20的pbst洗三次、拍干，再用125u肝素或含5％bsa的pbs4℃封閉過(guò)夜。5、用含0.005％吐溫-20的pbst洗三次、拍干、保存。實(shí)施例3本發(fā)明檢測(cè)試劑盒的制備按照實(shí)施例2方法，制備dsdna抗原包被板(96孔板)一塊；取酶標(biāo)抗體(hrp標(biāo)記的人igg)、樣品稀釋液、洗滌液(0.05％tw-20的tris緩沖液)、底物液(0.325mol/ltmb-2hcl)、終止液(0.25mol/lhcl)；與本發(fā)明的dsdna抗原包被板共同組成本發(fā)明試劑盒。實(shí)施例4本發(fā)明質(zhì)粒的大規(guī)模制備方法1、質(zhì)粒gst-2mpo的大規(guī)模發(fā)酵(1)將gst-2mpo轉(zhuǎn)化到宿主菌hst-04中。①-80℃取出感受態(tài)細(xì)胞hst-04,冰上融化。②加入1μl(50ng)待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒；冰上，30min(間隔震蕩)。③42℃，60s(勿震蕩)，室溫2min，加lb培養(yǎng)基800μl，37℃,150rpm(溫柔搖菌)，60min。④取200μl菌液涂板至液體完全被吸收，倒置平皿，37℃培養(yǎng)16h，觀察菌落。(2)在lb瓊脂培養(yǎng)基(amp)上挑取菌落并接種到5mllb(amp)液體培養(yǎng)基中，在37℃振蕩培養(yǎng)14h。(3)次日將培養(yǎng)菌接種到1000mllb(amp)液體培養(yǎng)基中，在37℃振蕩培養(yǎng)3h，使其a540為0.8-1.0。(4)冷凍離心10,000×g收集沉淀。2、堿裂解法粗提取質(zhì)粒(1)按1g菌10ml①號(hào)液的比例，將菌體重懸，如10g菌體溶于100ml①號(hào)液中。(2)按1g菌10ml②號(hào)液的比例，邊搖邊加入②號(hào)液，動(dòng)作不要太劇烈。(3)按1g菌15ml③號(hào)液的比例，邊搖邊加入②號(hào)液。(4)靜止10min，四層紗布過(guò)濾后，經(jīng)布氏漏斗抽濾，得上清。(5)加入rna酶，37℃1h或4℃過(guò)夜。(6)離心去沉淀，用ph5.0的檸檬酸緩沖液透析。3、硅藻土吸附質(zhì)粒(1)按100ml液體加2g硅藻土的比例，將硅藻土與上訴粗提純的質(zhì)?；旌衔?0min。(2)用布式漏斗抽濾，去除上清，將硅藻土晾干。(3)用50ml，55℃純水洗脫吸附在硅藻土上的質(zhì)粒，用布式漏斗，抽濾得濾液(即為質(zhì)粒)。4、陽(yáng)離子交換柱提純質(zhì)粒(1)用ph5.0的檸檬酸緩沖液為平衡液，處理陽(yáng)離子交換柱。(2)緩慢上樣，注意收集穿透峰。(3)平衡后，用含1mol/lnacl的檸檬酸緩沖液(ph5.0)洗脫，收集洗脫峰。(4)沖10體積的純水，清洗柱子，后用20％乙醇保存。5、peg濃縮質(zhì)粒(1)將得到的穿透峰在pbs緩沖液中透析過(guò)夜。(2)再用peg8000進(jìn)行濃縮。6、乙醇提純(1)按照質(zhì)粒：乙醇＝1:1.5的比例加入預(yù)冷的乙醇，-20℃冷凍沉淀40min。(2)冷凍離心10,000×g收集沉淀，晾干保存或直接-20℃保存。以下通過(guò)試驗(yàn)例具體說(shuō)明本發(fā)明的有益效果：試驗(yàn)例1本發(fā)明抗原的篩選一、實(shí)驗(yàn)方法1、實(shí)驗(yàn)材料1)甲基化gst質(zhì)粒：即pgex-6p-1質(zhì)粒；2)甲基化gst-2mpo質(zhì)粒：按照實(shí)施例1方法制備得到。3)非甲基化gst-2mpo質(zhì)粒：按照實(shí)施例1方法制備得到。2、質(zhì)粒的固定化(制備抗原包被板)(1)酶標(biāo)板的預(yù)處理：用每孔100μl1mmol/lhcl室溫浸泡預(yù)處理聚丙乙烯板條1h，紫外照射過(guò)夜。(2)每孔加入100μl1g/l多聚-l-賴氨酸或1g/l魚(yú)精蛋白4℃過(guò)夜。(3)用含0.005％吐溫-20的pbst洗三次、拍干，每孔100μl200ng/ml質(zhì)粒4℃過(guò)夜。(4)用含0.005％吐溫-20的pbst洗三次、拍干，再用125u肝素或含5％bsa的pbs4℃封閉過(guò)夜。(5)用含0.005％吐溫-20的pbst洗三次、拍干、保存。3、酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(1)用樣本稀釋液(為tris緩沖液)將sle患者血清和正常人血清按100倍稀釋，如：10μl樣本+990μl樣本稀釋液。(2)加樣本：在對(duì)應(yīng)的微孔內(nèi)(指包被板微孔)加入稀釋后的正常人血清，病人血清，蒸餾水等各100μl。(3)溫育：蓋上蓋子，室溫(20℃-28℃)孵育1h。(4)洗滌：棄去孔內(nèi)液體，每孔加入含0.05％吐溫-20的tris緩沖液洗滌三次。(5)加酶標(biāo)液：每孔各加100μl酶標(biāo)液(hrp標(biāo)記的人igg),室溫(20℃-28℃)孵育30min。(6)洗滌：棄去孔內(nèi)液體，每孔加入含0.05％吐溫-20的tris緩沖液洗滌三次。(7)加底物液：每孔各加100μl底物液(0.325mol/ltmb-2hcl)，避光室溫(20℃-28℃)孵育15min.(8)終止：每孔加入100μl終止液(0.25mol/lhcl)(9)比色：在反應(yīng)終止30min內(nèi)，在450nm/620nm處(雙波長(zhǎng)450nm和620nm)讀取吸光度值。二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果將甲基化gst質(zhì)粒與甲基化gst-2mpo質(zhì)粒分別耦聯(lián)固定在酶標(biāo)板上，對(duì)sle患者血清進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表8和圖4。表8gst質(zhì)粒與gst-2mpo的對(duì)比(n＝5)#:p<0.01由表8和圖4可見(jiàn)，在質(zhì)?？偭肯嗤那闆r下，gst-2mpo質(zhì)粒的靈敏度優(yōu)于gst質(zhì)粒。將甲基化的gst-2mpo和非甲基化的gst-2mpo質(zhì)粒分別耦聯(lián)固定在酶標(biāo)板上，對(duì)sle患者血清進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表9和圖5。表9gst-2mpo甲基化與非甲基化的對(duì)比(n＝5)#:p<0.01由表9和圖5可見(jiàn)，甲基化gst-2mpo質(zhì)粒的靈敏度優(yōu)于非甲基化狀態(tài)的gst-2mpo質(zhì)粒。因此，本發(fā)明gst-2mpo重組質(zhì)粒的靈敏度優(yōu)于gst質(zhì)粒，適于作為抗原使用，其中，尤其以非甲基化gst-2mpo質(zhì)粒的靈敏度最優(yōu)。而其它質(zhì)粒作為抗原時(shí)，用量大，且有可能出現(xiàn)非特異性結(jié)合，產(chǎn)生假陽(yáng)性，作為抗原效果不佳。試驗(yàn)例2本發(fā)明dsdna抗原包被板的制備方法篩選考察不同濃度魚(yú)精蛋白包被對(duì)抗原包被板的制備方法影響：每個(gè)微孔內(nèi)用非甲基化的gst-2mpo質(zhì)?？偭繛?0ng，在制備抗原包被板時(shí)，選擇不同濃度的魚(yú)精蛋白包被，按試驗(yàn)例1的方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表10和圖6。表10不同濃度魚(yú)精蛋白的影響(n＝5)#:p<0.01可見(jiàn)，其它條件相同的情況下，魚(yú)精蛋白的用量對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較大，僅在魚(yú)精蛋白濃度為1mg/ml能準(zhǔn)確鑒別sle患者與正常人血清，其它濃度均無(wú)法鑒別。因此選擇魚(yú)精蛋白濃度為1mg/ml。試驗(yàn)例3本發(fā)明檢測(cè)試劑盒與市售試劑盒的效果對(duì)比1、實(shí)驗(yàn)試劑本發(fā)明檢測(cè)試劑盒：按照實(shí)施例3方法制備的試劑盒，市售試劑盒：抗dsdna抗體體外診斷試劑盒(新建康成生物科技有限公司)。2、實(shí)驗(yàn)方法分別取sle患者血清和正常人血清；本發(fā)明檢測(cè)試劑盒：按試驗(yàn)例1的方法進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定。市售試劑盒：按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表11兩種試劑盒的使用效果對(duì)比本發(fā)明試劑盒市售試劑盒正常人0.1290.198sle患者0.8410.424可見(jiàn)，對(duì)同樣的樣本，使用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)對(duì)患者和正常人的差異更明顯，說(shuō)明本發(fā)明試劑盒的靈敏度更高，可更加直觀的判斷是否為系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者，鑒定效果更準(zhǔn)確。綜上，本發(fā)明提供的重組質(zhì)粒，可以作為抗原用來(lái)檢測(cè)dsdna抗體的水平，進(jìn)而篩查待檢人群患系統(tǒng)性紅斑狼瘡的風(fēng)險(xiǎn)：若dsdna抗體的表達(dá)水平高，則患系統(tǒng)性紅斑狼瘡的風(fēng)險(xiǎn)高，若dsdna抗體的表達(dá)水平低，則患系統(tǒng)性紅斑狼瘡的風(fēng)險(xiǎn)低，可用于臨床系統(tǒng)性紅斑狼瘡的輔助診斷，應(yīng)用前景良好。sequencelisting<110>成都醫(yī)學(xué)院<120>一種重組質(zhì)粒及其用途<130>gy044-17p1177<160>5<170>patentinversion3.5<210>1<211>2238<212>dna<213>mpo基因序列<400>1atgggggttcccttcttctcttctctcagatgcatggtggacttaggaccttgctgggct60gggggtctcactgcagagatgaagctgcttctggccctagcagggctcctggccattctg120gccacgccccagccctctgaaggtgctgctccagctgtcctgggggaggtggacacctcg180ttggtgctgagctccatggaggaggccaagcagctggtggacaaggcctacaaggagcgg240cgggaaagcatcaagcagcggcttcgcagcggctcagccagccccatggaactcctatcc300tacttcaagcagccggtggcagccaccaggacggcggtgagggccgctgactacctgcac360gtggctctagacctgctggagaggaagctgcggtccctgtggcgaaggccattcaatgtc420actgatgtgctgacgcccgcccagctgaatgtgttgtccaagtcaagcggctgcgcctac480caggacgtgggggtgacttgcccggagcaggacaaataccgcaccatcaccgggatgtgc540aacaacagacgcagccccacgctgggggcctccaaccgtgcctttgtgcgctggctgccg600gcggagtatgaggacggcttctctcttccctacggctggacgcccggggtcaagcgcaac660ggcttcccggtggctctggctcgcgcggtctccaacgagatcgtgcgcttccccactgat720cagctgactccggaccaggagcgctcactcatgttcatgcaatggggccagctgttggac780cacgacctcgacttcacccctgagccggccgcccgggcctccttcgtcactggcgtcaac840tgcgagaccagctgcgttcagcagccgccctgcttcccgctcaagatcccgcccaatgac900ccccgcatcaagaaccaagccgactgcatcccgttcttccgctcctgcccggcttgcccc960gggagcaacatcaccatccgcaaccagatcaacgcgctcacttccttcgtggacgccagc1020atggtgtacggcagcgaggagcccctggccaggaacctgcgcaacatgtccaaccagctg1080gggctgctggccgtcaaccagcgcttccaagacaacggccgggccctgctgccctttgac1140aacctgcacgatgacccctgtctcctcaccaaccgctcagcgcgcatcccctgcttcctg1200gcaggggacacccgttccagtgagatgcccgagctcacctccatgcacaccctcttactt1260cgggagcacaaccggctggccacagagctcaagagcctgaaccctaggtgggatggggag1320aggctctaccaggaagcccggaagatcgtgggggccatggtccagatcatcacttaccgg1380gactacctgcccctggtgctggggccaacggccatgaggaagtacctgcccacgtaccgt1440tcctacaatgactcagtggacccacgcatcgccaacgtcttcaccaatgccttccgctac1500ggccacaccctcatccaacccttcatgttccgcctggacaatcggtaccagcccatggaa1560cccaacccccgtgtccccctcagcagggtcttttttgcctcctggagggtcgtgctggaa1620ggtggcattgaccccatcctccggggcctcatggccacccctgccaagctgaatcgtcag1680aaccaaattgcagtggatgagatccgggagcgattgtttgagcaggtcatgaggattggg1740ctggacctgcctgctctgaacatgcagcgcagcagggaccacggcctcccaggatacaat1800gcctggaggcgcttctgtgggctcccgcagcctgaaactgtgggccagctgggcacggtg1860ctgaggaacctgaaattggcgaggaaactgatggagcagtatggcacgcccaacaacatc1920gacatctggatgggcggcgtgtccgagcctctgaagcgcaaaggccgcgtgggcccactc1980ctcgcctgcatcatcggtacccagttcaggaagctccgggatggtgatcggttttggtgg2040gagaacgagggtgtgttcagcatgcagcagcgacaggccctggcccagatctcattgccc2100cggatcatctgcgacaacacaggcatcaccaccgtgtctaagaacaacatcttcatgtcc2160aactcatatccccgggactttgtcaactgcagtacacttcctgcattgaacctggcttcc2220tggagggaagcctcctag2238<210>2<211>24<212>dna<213>mpo的引物1，上游序列<400>2taggatccatgctgcctgccaggt24<210>3<211>27<212>dna<213>mpo的引物1下游序列<400>3ttgaattcctaggaggcttccctccag27<210>4<211>28<212>dna<213>mpo的引物2上游序列<400>4tagaattcatgctgcctgccaggtctct28<210>5<211>25<212>dna<213>mpo的引物2下游序列<400>5atctcgagctaggaggcttccctcc25當(dāng)前第1頁(yè)12