專(zhuān)利名稱：重組質(zhì)粒psp1,轉(zhuǎn)化微生物,產(chǎn)生一種堿性蛋白酶vapk的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到了一種包含有編碼一種堿性蛋白酶VapK的基因vapk、和可增加質(zhì)粒載體自身穩(wěn)定性的par基因的重組性質(zhì)粒載體pSPI，該重組性質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的一種微生物metschnikovii弧菌，以及應(yīng)用該微生物來(lái)產(chǎn)生一種堿性蛋白酶VapK的方法。
應(yīng)用上述的微生物來(lái)產(chǎn)生堿性蛋白酶的最重要的因素，是堿性蛋白酶的高生產(chǎn)率問(wèn)題，這可以影響生產(chǎn)過(guò)程中的成本。
根據(jù)近年來(lái)的研究，包含有編碼堿性蛋白酶的重組性載體可以應(yīng)用基因工程的技術(shù)加以制備，為了提高堿性蛋白酶生產(chǎn)率而制備轉(zhuǎn)化體。此外，質(zhì)粒性載體的穩(wěn)定性可能會(huì)直接影響堿性蛋白酶的生產(chǎn)率，因此，也就有了若干與提高重組性質(zhì)粒載體穩(wěn)定性有關(guān)的研究加以報(bào)道。
本發(fā)明人此前所申報(bào)的一份專(zhuān)利申請(qǐng)(KR 1999-12588)命名為“適用于洗衣店去污劑的堿性蛋白酶VapK，vapk基因，重組性表達(dá)載體，以及經(jīng)轉(zhuǎn)化的微生物”，其中的微生物是metschnikovii弧菌KS1，并且重組性表達(dá)載體為pSBCm。在本發(fā)明中，也是應(yīng)用了與之相同的微生物和重組性表達(dá)載體。
為了應(yīng)用改進(jìn)的穩(wěn)定性的重組性質(zhì)粒載體產(chǎn)生出轉(zhuǎn)化的微生物，本發(fā)明者曾經(jīng)進(jìn)行了深入細(xì)致和廣泛地研究并加以驗(yàn)證。首先，制備了一種包含有堿性蛋白酶基因和par基因的重組性質(zhì)粒載體，堿性蛋白酶基因分離自metschnikovii弧菌KS1，par基因具有增加質(zhì)粒載體自身穩(wěn)定性的功能，并且，轉(zhuǎn)化的metschnikovii弧菌帶有上述的重組性質(zhì)粒載體，因此，包含有已提高了穩(wěn)定性和蛋白酶活性的質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)化微生物也加以制備。
本發(fā)明還提供了一種能夠得到權(quán)利要求1中所提及的重組性質(zhì)粒載體pSP1的方法，即通過(guò)將par基因插入到一種重組性質(zhì)粒載體pSBCm(KCCM-10142)的PvuII和HincII識(shí)別位點(diǎn)之間構(gòu)建而成，而重組性質(zhì)粒載體pSBCm所包含的vapk基因，可編碼一種來(lái)源于弧菌的堿性蛋白酶，其中的par基因具有改善質(zhì)粒載體自身的穩(wěn)定性的功能。
還有，本發(fā)明提供了一種已轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，它包含有重組性質(zhì)粒載體pSP1。
此外，本發(fā)明提供了一種已轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包括埃菲氏屬大腸桿菌或者metschnikovii弧菌。
本發(fā)明還提供一種應(yīng)用上述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞產(chǎn)生一種堿性蛋白酶VapK的方法。


圖1說(shuō)明了包含有編碼一種堿性蛋白酶VapK的vapk基因的重組性質(zhì)粒載體pSBCm的電泳結(jié)果。電泳泳道M代表的是標(biāo)準(zhǔn)參照物的大小，電泳泳道1代表的是重組性質(zhì)粒載體pSBCm，電泳泳道2代表的是重組性質(zhì)粒載體pSBCm/Hind III，它由一種2.2千堿基對(duì)的運(yùn)載體pKF3和一種2.9千堿基對(duì)的弧菌的堿性蛋白酶基因所組成。
圖2說(shuō)明了包含有堿性蛋白酶基因vapk的重組性質(zhì)粒載體pSBCm的限制性內(nèi)切酶譜。
圖3說(shuō)明了包含有堿性蛋白酶基因vapk和par基因的重組性質(zhì)粒載體pSP1的限制性內(nèi)切酶譜。
發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明提供了一種由包含有編碼一種堿性蛋白酶VapK的vapk基因、和能夠增強(qiáng)質(zhì)粒載體自身穩(wěn)定性的par基因的重組性質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的微生物，并且提供了一種在上面所提及的轉(zhuǎn)化微生物內(nèi)部，增強(qiáng)重組性質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的方法。
根據(jù)本項(xiàng)發(fā)明，編碼堿性蛋白酶的基因是經(jīng)過(guò)以下的幾個(gè)步驟加以分離的培養(yǎng)metchnikovii弧菌KS1，離心并回收metchnikovii弧菌KS1細(xì)胞，使這些細(xì)胞破裂并將其離心以獲得無(wú)細(xì)胞的上清液，以及從這種無(wú)細(xì)胞的上清液中提取metchnikovii弧菌KS1的染色體DNA。應(yīng)用以上提取的metchnikovii弧菌KS1的染色體DNA，形成轉(zhuǎn)化的埃菲氏屬大腸桿菌，即通過(guò)應(yīng)用如HindIII的限制性內(nèi)切酶，酶切消化上述的metchnikovii弧菌KS1的染色體DNA，形成DNA片段，將這些DNA片段克隆入質(zhì)粒載體中，構(gòu)建成為pSBCm和pSP1，并將這些載體轉(zhuǎn)化入埃菲氏屬大腸桿菌中。
首先，堿性蛋白酶的表達(dá)是通過(guò)應(yīng)用上面所提及的重組埃菲氏屬大腸桿菌加以引導(dǎo)的，該大腸桿菌中包含有質(zhì)粒載體pSBCm，并且在堿性的情況下，由轉(zhuǎn)化的埃菲氏屬大腸桿菌所產(chǎn)生的堿性蛋白酶的表達(dá)水平是可以測(cè)量的。在這種結(jié)果的基礎(chǔ)上，正如我們以前所知道的，上面所提及的轉(zhuǎn)化的埃菲氏屬大腸桿菌的堿性蛋白酶的表達(dá)是較低的。
為了解決上述問(wèn)題，本項(xiàng)發(fā)明者將重組性質(zhì)粒載體pSBCm克隆入弧菌中。然而，結(jié)果卻是重組性質(zhì)粒載體pSBCm的穩(wěn)定性較低。由此，為了提高上面所提及的重組性質(zhì)粒載體的穩(wěn)定性，作為眾所周知的具有改善質(zhì)粒載體自身穩(wěn)定性功能的par基因，被插入到上述的重組性質(zhì)粒載體pSBCm中，隨即構(gòu)建形成重組性質(zhì)粒載體pSP1。結(jié)果，重組性質(zhì)粒載體pSP1的穩(wěn)定性，比沒(méi)有par基因的重組性質(zhì)粒載體pSBCm升高了40％。
本項(xiàng)發(fā)明中所應(yīng)用的metchnikovii弧菌KS1菌株，收錄于漢城的韓國(guó)微生物培養(yǎng)中心，其登記時(shí)間是1998年12月15日，編碼為KFCC-10141。該菌株通過(guò)應(yīng)用N，N-亞硝基胍(NTG)作為突變劑，處理metchnikovii弧菌RH530N-4-8而產(chǎn)生的，并且metchnikovii弧菌RH530N-4-8則收錄于漢城的韓國(guó)微生物培養(yǎng)中心，其登記時(shí)間是1998年2月23日，編碼為KFCC-11030。結(jié)果，由metchnikovii弧菌KS1菌株產(chǎn)生的堿性蛋白酶的量，是metchnikovii弧菌RH530N-4-8菌株的兩倍。
還有，包含有本項(xiàng)發(fā)明中重組性質(zhì)粒載體pSBCm的埃菲氏屬大腸桿菌Top10F′菌株，則收錄于漢城的韓國(guó)微生物培養(yǎng)中心，其登記時(shí)間是1998年12月15日，編碼為KCCM-10142。
在下文中，將通過(guò)以下提供的諸多例證，更加詳細(xì)地描述了本項(xiàng)發(fā)明的特殊功效，并不限制本發(fā)明的精神和范圍。
埃菲氏大腸桿菌HB101菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，把100mM濃度的氯化鈣添加到埃菲氏大腸桿菌HB101的液體培養(yǎng)基中。該混合物在0℃儲(chǔ)存15分鐘，然后離心收集埃菲氏大腸桿菌HB101。將沉淀細(xì)胞懸浮在100mM氯化鈣溶液中，在0℃儲(chǔ)存15分鐘。把重組質(zhì)粒載體pSBCm添加到懸浮溶液中，在0℃儲(chǔ)存1小時(shí)。該上清液在42℃加熱90秒，然后在0℃儲(chǔ)存5分鐘。在上清液中加入1ml的LB培養(yǎng)基，然后鋪在含有34μg/ml的氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基中，30℃孵化24小時(shí)，挑選生長(zhǎng)的克隆。
在30℃下的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)metchnikovii弧菌KS1菌株后，通過(guò)在4℃下，每分鐘6,000轉(zhuǎn)離心10分鐘，以收獲已長(zhǎng)滿的細(xì)胞，并且將它們以20∶1的體積比，懸浮于一種H-緩沖溶液中，該緩沖液包含有200毫摩爾濃度的蔗糖，1毫摩爾濃度的HEPES和10％的丙三醇。在重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)步驟兩次以后，細(xì)胞被懸浮在80μl的H-緩沖溶液中。將重組性質(zhì)粒載體添加入懸浮液中，并且將這種溶液倒入一0.2厘米的試管中。在1,500V的電壓下，將含有10μF和200Ω的細(xì)胞懸液的試管放入由Bio-Rad公司制造的基因電脈沖儀II中。添加600μl的LB培養(yǎng)基入電穿孔處理溶液并在30℃下孵育。培養(yǎng)基覆蓋在含有25□/ml氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上面，挑選生長(zhǎng)的克隆。
產(chǎn)業(yè)上的適用性根據(jù)本項(xiàng)發(fā)明，通過(guò)應(yīng)用一種metchnikovii弧菌菌株，來(lái)改善包含有編碼一種堿性蛋白酶vapk基因的重組性質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的方法，其應(yīng)用可能是有效的。
權(quán)利要求
1.一種重組性質(zhì)粒載體pSP1，其中的par基因是被可隆入一種重組性質(zhì)粒載體pSBCm(KCCM-10142)中的，而重組性質(zhì)粒載體pSBCm則包含有編碼一種堿性蛋白酶的vapk基因，以改善質(zhì)粒載體自身的穩(wěn)定性。
2.一種能夠得到權(quán)利要求1中所提及的重組性質(zhì)粒載體pSP1的方法，即通過(guò)將par基因插入到一種重組性質(zhì)粒載體pSBCm(KCCM-10142)的PvuII和HincII識(shí)別位點(diǎn)之間構(gòu)建而成，而重組性質(zhì)粒載體pSBCm所包含的vapk基因，可編碼一種來(lái)源于弧菌的堿性蛋白酶，其中的par基因具有改善質(zhì)粒載體自身的穩(wěn)定性的功能。
3.一種轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，它包含有權(quán)利要求1中的重組性質(zhì)粒載體pSP1。
4.根據(jù)權(quán)利要求3中的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞包含有埃菲氏屬大腸桿菌或者metschnikovii弧菌。
5.一種產(chǎn)生堿性蛋白酶VapK的方法，應(yīng)用權(quán)利要求3或4中的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及到了一種包含有編碼一種堿性蛋白酶VapK的基因vapk，和可增加質(zhì)粒載體自身穩(wěn)定性的par基因的重組性質(zhì)粒載體，該重組性質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的一種微生物metschnikovii弧菌，以及應(yīng)用該微生物來(lái)產(chǎn)生一種堿性蛋白酶VapK的方法。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1441847SQ01812800
公開(kāi)日2003年9月10日 申請(qǐng)日期2001年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月19日
發(fā)明者秦基洪, 李賢煥, 盧賢模, 金炯錫 申請(qǐng)人:第一制糖株式會(huì)社