專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)核酸的材料和方法
本申請(qǐng)正由David J.Marshall，James R.Prudent，Christopher B.Scherrill，Gideon Shapiro，JenniferK.Grenier，Craig S.Richmond，和Simona Jurczk，美國(guó)國(guó)藉人員和居民作為PCR申請(qǐng)遞交，并且指定了除美國(guó)以外的所有國(guó)家。
背景技術(shù)：
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是DNA的特定區(qū)段的酶擴(kuò)增的方法。PCR是基于下面的基本步驟的重復(fù)循環(huán)雙鏈DNA變性，接著將寡核苷酸引物與DNA模板退火，由核酸聚合酶延伸引物(Mullis等人和Saiki等人1985；和U.S.PatentNos.4,683,195，4,683,202和4,800,159，其公開(kāi)內(nèi)容全文引入作為參考)。將用于PCR的寡核苷酸引物設(shè)計(jì)成與該DNA的相反鏈可退火，并且定位使一個(gè)引物的核酸聚合酶催化延伸產(chǎn)物可以作為其他引物的模板鏈。PCR擴(kuò)增方法導(dǎo)致長(zhǎng)度由寡核苷酸引物的5’末端確定的不連續(xù)的DNA片段的指數(shù)增加。
目前使用的PCR技術(shù)是擴(kuò)增核酸序列的極其有效的方法，被擴(kuò)增物質(zhì)的檢測(cè)通常需要?jiǎng)e的操作，隨后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行操作以確定是否存在目的DNA。開(kāi)發(fā)新的方法和分析方法是需要的。
引入本文作為參考的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,210,015涉及利用標(biāo)記的寡核苷酸檢測(cè)靶核酸的方法。該方法利用具有5’到3’核酸酶活性的聚合酶裂解可以隨后檢測(cè)的退火的標(biāo)記的寡核苷酸探針。
引入本文作為參考的美國(guó)專(zhuān)利5,846,717涉及通過(guò)在靶序列上形成核酸裂解結(jié)構(gòu)然后利用具有5’核酸酶活性以位點(diǎn)特異方法裂解核酸裂解結(jié)構(gòu)以檢測(cè)靶核酸的方法。
引入本文作為參考的美國(guó)專(zhuān)利5,432,272公開(kāi)了非標(biāo)準(zhǔn)堿基，該堿基對(duì)在DNA或RNA中，但具有的氫鍵方式與標(biāo)準(zhǔn)的A∶T或G∶C堿基對(duì)觀察到的方式不同。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及快速檢測(cè)靶核酸的材料和方法。本發(fā)明的方法利用了報(bào)道寡核苷酸；核酸聚合酶；和第一和第二寡核苷酸引物，其中至少第一和第二寡核苷酸引物之一至少含有一個(gè)非天然堿基。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在樣品中檢測(cè)靶核酸的方法，該方法包括將樣品與核酸聚合酶、第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物接觸，第一寡核苷酸引物含有與靶核酸的第一部分互補(bǔ)的序列，第二寡核苷酸引物含有一個(gè)第一區(qū)和一個(gè)第二區(qū)，第一區(qū)含有與靶核酸的第二部分互補(bǔ)的序列，第二區(qū)含有非天然堿基；如果樣品中存在靶核酸，利用第一和第二寡核苷酸引物通過(guò)PCR擴(kuò)增靶核酸產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，所述擴(kuò)增產(chǎn)物具有(i)雙鏈區(qū)和(ii)含有非天然堿基的單鏈區(qū)；將樣品與含有一個(gè)標(biāo)記和一個(gè)與單鏈區(qū)的非天然堿基互補(bǔ)的非天然堿基的報(bào)道分子接觸；報(bào)道分子的至少一部分與擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈區(qū)退火；在退火后裂解報(bào)道分子的至少一部分以便至少釋放一個(gè)報(bào)道分子片段；和將該至少一個(gè)報(bào)道分子片段的釋放與樣品中靶核酸的存在進(jìn)行關(guān)聯(lián)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在樣品中檢測(cè)靶核酸的方法，該方法包括將樣品與核酸聚合酶、第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物接觸，第一寡核苷酸引物含有與靶核酸的第一部分互補(bǔ)的序列，第二寡核苷酸引物含有一個(gè)第一區(qū)和一個(gè)第二區(qū)，第一區(qū)含有與靶核酸的第二部分互補(bǔ)的序列，第二區(qū)含有非天然堿基；如果樣品中存在靶核酸，利用第一和第二寡核苷酸引物通過(guò)PCR擴(kuò)增靶核酸產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，所述擴(kuò)增產(chǎn)物具有(1)雙鏈區(qū)和(ii)含有非天然堿基的一個(gè)單鏈區(qū)；將樣品與含有一個(gè)標(biāo)記和一個(gè)與單鏈區(qū)的非天然堿基互補(bǔ)的非天然堿基的報(bào)道分子接觸；將報(bào)道分子在單鏈區(qū)的非天然堿基對(duì)側(cè)摻入擴(kuò)增產(chǎn)物；并且將報(bào)道分子的摻入與樣品中的靶核酸的存在進(jìn)行關(guān)聯(lián)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了檢測(cè)靶核酸的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒含有核酸聚合酶；含有與靶核酸的第一部分互補(bǔ)的序列的第一寡核苷酸引物；含有第一區(qū)和第二區(qū)的第二寡核苷酸引物，第一區(qū)含有與靶核酸的第二部分互補(bǔ)的序列，第二區(qū)含有非天然堿基；和含有一個(gè)標(biāo)記和一個(gè)與單鏈區(qū)的非天然堿基互補(bǔ)的非天然堿基的報(bào)道分子。試劑盒任選進(jìn)一步含有其他成分，如緩沖液和試劑來(lái)進(jìn)行本發(fā)明的方法。
本發(fā)明的方法可以摻入到各種質(zhì)量篩選技術(shù)和讀出平臺(tái)。
附圖簡(jiǎn)述本發(fā)明可以考慮下面本發(fā)明的各種實(shí)施方案的詳細(xì)敘述，聯(lián)系附圖來(lái)更全面地理解，其中
附

圖1A-1E圖解說(shuō)明本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的測(cè)試方法；附圖2A-2E圖解說(shuō)明了本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方案的測(cè)試方法；附圖3展示了許多非天然堿基的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其中A是附著于多聚體骨架的點(diǎn)，X是N或C-Z，Y是N或C-H，Z是H，取代或非取代的烷基基團(tuán)，或鹵素；附圖4A-4D圖解說(shuō)明了本發(fā)明的第3個(gè)實(shí)施方案的測(cè)試方法；附圖5A-5E圖解說(shuō)明本發(fā)明的第4個(gè)實(shí)施方案的測(cè)試方法；附圖6A-6E圖解說(shuō)明本發(fā)明的第5個(gè)實(shí)施方案的測(cè)試方法；附圖7A-7E圖解說(shuō)明了本發(fā)明的第6個(gè)實(shí)施方案的測(cè)試方法；附圖8A-8E圖解說(shuō)明了本發(fā)明的第7個(gè)實(shí)施方案的測(cè)試方法；附圖9A-9E圖解說(shuō)明了本發(fā)明的第8個(gè)實(shí)施方案的測(cè)試方法；附圖10A-10E圖解說(shuō)明了本發(fā)明的第9個(gè)實(shí)施方案的測(cè)試方法；附圖11A-11E圖解說(shuō)明了本發(fā)明的第10個(gè)實(shí)施方案的測(cè)試方法；附圖12A-12E圖解說(shuō)明了本發(fā)明的第11個(gè)實(shí)施方案的測(cè)試方法；附圖13圖解說(shuō)明制備含有等位基因特異性PCR混合物和模板樣品的測(cè)定平板的一般程序方法；附圖14是顯示通過(guò)在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中位點(diǎn)特異地?fù)饺氪銣缁衔铮赑CR反應(yīng)中淬滅熒光的圖，相關(guān)的熒光單位(RFU’s)表示在Y軸，PCR循環(huán)的數(shù)目表示在X軸；附圖15圖解說(shuō)明了根據(jù)方法A制備已標(biāo)記的非天然堿基的合成方案；附圖16圖解說(shuō)明了根據(jù)方法B制備已標(biāo)記的非天然堿基的合成方案；附圖17A是顯示通過(guò)在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中位點(diǎn)特異地?fù)饺氪銣缁衔铩皩?shí)時(shí)”檢測(cè)PCR反應(yīng)中淬滅熒光的圖；相關(guān)的熒光單位(RFU’s)表示在Y軸，PCR循環(huán)的數(shù)目表示在X軸，附圖17B是顯示附圖17A的PCR產(chǎn)物的解鏈曲線分析的附圖；解鏈溫度表示在X軸；附圖18A是顯示通過(guò)在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中位點(diǎn)特異地?fù)饺氪銣缁衔铩皩?shí)時(shí)”檢測(cè)PCR反應(yīng)中淬滅熒光的圖；相關(guān)的熒光單位(RFU’s)表示在Y軸，PCR循環(huán)的數(shù)目表示在X軸，附圖18B是證明附圖17A的PCR產(chǎn)物的解鏈曲線的分析；解鏈溫度表示在X軸；附圖19是顯示“實(shí)時(shí)”檢測(cè)擴(kuò)增基因組 DNA的PCR反應(yīng)中熒光的增加的圖；相關(guān)的熒光單位(RFU’s)表示在Y軸，PCR循環(huán)的數(shù)目表示在X軸；附圖20是顯示“實(shí)時(shí)”檢測(cè)擴(kuò)增不同量的逆轉(zhuǎn)錄RNA的PCR反應(yīng)中的熒光的增加的圖；相關(guān)的熒光單位(RFU’s)表示在Y軸，PCR循環(huán)的數(shù)目表示在X軸；附圖21是顯示“實(shí)時(shí)”檢測(cè)通過(guò)在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中位點(diǎn)特異地?fù)饺氪銣缁衔?，擴(kuò)增不同量的逆轉(zhuǎn)錄RNA的PCR反應(yīng)中淬滅熒光的圖；相關(guān)的熒光單位(RFU’s)表示在Y軸，PCR循環(huán)的數(shù)目表示在X軸；附圖22是顯示來(lái)自野生型，突變體，和雜合因子V DNA靶的多重PCR分析的總合結(jié)果的圖；HEX熒光RFU表示在Y軸，F(xiàn)AM熒光RFU表示在X軸；附圖23A-B是顯示來(lái)自各種小鼠株的基因組DNA的小鼠STS序列27.MMHAP25FLA6中的多態(tài)現(xiàn)象的多重PCR分析的總合結(jié)果的圖；PCR循環(huán)的數(shù)目表示在X軸。在附圖23A，HEX熒光RFUs示在Y軸；在附圖23B，F(xiàn)AM熒光RFU表示在Y軸；和附圖24是來(lái)自通過(guò)位點(diǎn)特異摻入淬滅化合物而擴(kuò)增不同量的逆轉(zhuǎn)錄RNA的反應(yīng)的PCR產(chǎn)物的解鏈曲線分析；隨時(shí)間的熒光變化表示在Y軸，解鏈溫度表示在X軸。
本發(fā)明可以進(jìn)行各種修飾和替代形式，其特例已經(jīng)通過(guò)附圖中的例子表示，并且將詳細(xì)敘述。但是應(yīng)該可以理解，本發(fā)明不限于所述的特定實(shí)施方案。相反，本發(fā)明覆蓋了所有的修飾形式，等同物，和替代形式，它們都在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及檢測(cè)，分析樣品中的靶核酸中的突變或?qū)ζ涠康姆椒ê筒牧稀１景l(fā)明的方法通常包括利用PCR。PCR可以是Fast-shotTM擴(kuò)增。本發(fā)明的方法利用了報(bào)道寡核苷酸；核酸聚合酶；和第一和第二寡核苷酸引物，其中至少第一和第二引物寡核苷酸之一至少含有一個(gè)非天然堿基。利用固相支持物的其他相關(guān)的測(cè)試方法在美國(guó)專(zhuān)利臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/，題目為“固相支持實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)和利用非天然堿基的方法”，代理檔案號(hào)13238.2USP1，2000年10月14日遞交的美國(guó)專(zhuān)利中有敘述。
如本文所用，“核酸”包括多聚分子，如脫氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)，肽核酸(RNA)，或通常指與化學(xué)主鏈相連的堿基的任何序列，其中堿基具有形成堿基對(duì)或與互補(bǔ)的化學(xué)結(jié)構(gòu)雜交的能力。適當(dāng)?shù)姆呛塑账嶂麈溊绨ň埘０泛途蹎徇麈?。術(shù)語(yǔ)“核酸”包括寡核苷酸，核苷酸，或聚核苷酸序列，和其片段或部分。核酸可以任何適當(dāng)?shù)男问教峁?，例如從天然?lái)源分離，重組產(chǎn)生，或人工合成，可以是單或雙鏈，并且可以代表有義或反義鏈。
術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”通常指短鏈(例如，小于約100個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，通常約6到約50個(gè)核苷酸長(zhǎng)度)可以利用本領(lǐng)域目前可得的技術(shù)如固相支持核酸合成，DNA復(fù)制，逆轉(zhuǎn)錄，限制性消化，失控轉(zhuǎn)錄等等來(lái)制備。寡核苷酸的準(zhǔn)確的大小將取決于許多因子，依次將取決于最終的功能或寡核苷酸的應(yīng)用。
“序列”指核苷酸的有順序的排列。
術(shù)語(yǔ)“樣品”利用的是它的最廣泛的意義。該術(shù)語(yǔ)包括樣品或培養(yǎng)物(例如，微生物培養(yǎng)物)，以及生物學(xué)和非生物學(xué)樣品。
如本文所用，“靶”或“靶核酸”指含有懷疑是在樣品中的和在本發(fā)明的方法或系統(tǒng)中待檢測(cè)或定量的核酸序列的核酸。靶核酸含有在測(cè)試方法過(guò)程中實(shí)際測(cè)試的靶核酸序列。該靶可以直接或間接測(cè)試。至少在一些實(shí)施方案中，靶核酸如果在樣品中存在，可以用作本發(fā)明的方法中擴(kuò)增的模板。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”或“互補(bǔ)性”，當(dāng)用于指核酸(即核苷酸序列如寡核苷酸或靶核酸時(shí))，指通過(guò)堿基配對(duì)規(guī)則相關(guān)的序列。對(duì)于天然堿基，堿基配對(duì)規(guī)則是Watson和Crick發(fā)現(xiàn)的那些規(guī)則。對(duì)于非天然堿基，如本文所用，堿基配對(duì)規(guī)則包括以和Watson-Crick堿基對(duì)規(guī)則相似的方法或通過(guò)疏水，熵，或范德華力形成氫鍵。作為實(shí)例，序列“T-G-A”，互補(bǔ)序列是“A-C-T”?；パa(bǔ)性可以是“部分”的。其中只有核酸的一些堿基可以根據(jù)堿基配對(duì)規(guī)則匹配。或者，在這些核酸之間可以是“完全”或“總體”互補(bǔ)的。在核酸鏈之間的互補(bǔ)的程度對(duì)核酸鏈之間的雜交的效率和長(zhǎng)度具有影響。
術(shù)語(yǔ)“雜交”用于指互補(bǔ)的核酸的配對(duì)。雜交和雜交的強(qiáng)度(即，在核酸之間相關(guān)的強(qiáng)度)是受這些因子如這些核酸之間的互補(bǔ)的程度，涉及的雜交條件的嚴(yán)格度，形成的雜交體的解鏈溫度(Tm)和核酸內(nèi)的G∶C比例的影響。
如本文所用，“標(biāo)記”指可以提供可檢測(cè)(優(yōu)選可定量的)信號(hào)，并且可以附著于核酸或蛋白質(zhì)的任何原子或分子。這些標(biāo)記提供了通過(guò)如，比色，熒光，電泳，電化學(xué)，光譜，色譜，密度計(jì)，或放射照相技術(shù)等等可檢測(cè)的信號(hào)。標(biāo)記可以是本身不產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的分子，但當(dāng)用于與另一個(gè)標(biāo)記聯(lián)合使用時(shí)可以產(chǎn)生或淬滅可檢測(cè)信號(hào)。例如，一個(gè)標(biāo)記可以是淬滅劑-染料對(duì)的淬滅劑。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“耐熱的核酸聚合酶”指催化核苷的聚合的酶，并且是例如當(dāng)與來(lái)自大腸桿菌的核苷酸聚合酶比較時(shí)是相對(duì)熱穩(wěn)定的酶。通常，該酶將能夠啟動(dòng)與靶序列退火的引物的3’末端的合成的酶，并且將沿著模板的5’方向前行，如果具有5’到3’核酸酶活性，則水解間插的退火寡核苷酸而釋放間插的核苷酸堿基或寡核苷酸片段，直到合成終止。耐熱的酶在至少約37℃到約42℃的溫度下具有活性，溫度范圍通常在約50℃到約75℃。代表性的耐熱聚合酶包括例如，耐熱的聚合酶，包括，但不限于水生棲熱菌(Taq)，黃棲熱菌(Tfl)，和嗜棲熱菌(Tth)，和棲熱袍菌屬物種，包括但不限于那不勒斯棲熱袍菌的天然的和已改變的聚合酶。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“DNA多態(tài)性”指兩個(gè)或多個(gè)不同的核苷酸序列可以存在于DNA的特定位點(diǎn)的狀況，包括任何核苷酸的變異，如單個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代，缺失或插入。這些核苷酸的變異可以是突變體或多態(tài)性的等位基因的變異。本文所述的方法的實(shí)施方案中至少一些可以檢測(cè)核酸中的單個(gè)核苷酸的變異，如發(fā)生在單個(gè)堿基突變，疊加或缺失引起的β球蛋白遺傳疾病(一些β-重型地中海貧血癥，鐮刀型細(xì)胞貧血癥，C血紅蛋白疾病等等)，以及多個(gè)堿基變異如α地中海貧血癥或一些β地中海貧血癥中涉及的那些。另外，本文的方法可以檢測(cè)多態(tài)性，所述多態(tài)性與一種疾病不是必定相關(guān)的，僅僅是一種狀況，其中兩個(gè)或多個(gè)不同的核苷酸序列(是否具有取代，缺失或插入的核苷酸堿基對(duì))可以在該群體中的核酸的特定位點(diǎn)中存在，該方法可以檢測(cè)人基因組的HLA區(qū)和隨機(jī)多態(tài)性如線粒體的DNA。
本發(fā)明提供了檢測(cè)樣品中的靶核酸的方法和材料。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)方法包括將懷疑含有靶核酸的樣品與聚合酶和第一和第二引物接觸；如果樣品中存在靶核酸，通過(guò)PCR，利用第一和第二引物擴(kuò)增靶核酸產(chǎn)生具有雙鏈區(qū)和至少含有一個(gè)非天然堿基的單鏈區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物；將樣品與含有一個(gè)標(biāo)記和與單鏈區(qū)的非天然堿基(或多個(gè)堿基)互補(bǔ)的非天然堿基(或多個(gè)堿基)的報(bào)道分子接觸；至少將一部分報(bào)道分子與擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈區(qū)退火；在退火后裂解報(bào)道分子的至少一部分，以釋放至少一個(gè)報(bào)道分子片段；和將至少一個(gè)報(bào)道分子片段的釋放與樣品中的靶核酸的存在進(jìn)行關(guān)聯(lián)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)方法包括將懷疑含有靶核酸的樣品與聚合酶和第一和第二引物接觸；如果樣品中存在靶核酸，利用第一和第二引物，通過(guò)PCR，擴(kuò)增靶核酸，產(chǎn)生具有雙鏈區(qū)和至少含有一個(gè)非天然堿基的單鏈區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物；將樣品與含有一個(gè)標(biāo)記和與單鏈區(qū)的非天然堿基(或多個(gè)堿基)互補(bǔ)的非天然堿基(或多個(gè)堿基)的報(bào)道分子接觸；將該報(bào)道分子摻入擴(kuò)增產(chǎn)物；和將報(bào)道分子的摻入與樣品中的靶核酸的存在相關(guān)聯(lián)。
本發(fā)明也可以包括利用本文所述的一個(gè)或多個(gè)方法，檢測(cè)樣品中靶核酸的相應(yīng)的試劑盒。
本發(fā)明可以提供許多優(yōu)點(diǎn)，如果需要，包括在一些實(shí)施方案中提供檢測(cè)樣品中的靶核酸的能力，而不需要反應(yīng)后的加工如洗滌或分離(例如，通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行)。另外，在一些實(shí)施方案中，該方法可以通過(guò)在利用一系列反應(yīng)條件加工的一個(gè)反應(yīng)混合物中加入所有的元素進(jìn)行。這可以避免或減少與多個(gè)反應(yīng)步驟和試劑相關(guān)的問(wèn)題。
一般的討論本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案現(xiàn)在將參考附圖1所示的圖解說(shuō)明大體地?cái)⑹?。參考附圖1A，一個(gè)樣品懷疑含有靶核酸100，靶核酸100包括第一部分102和第二部分104。如附圖所示，靶核酸100是鏈100a和100b組成的雙鏈分子。
參考附圖1B，將樣品與第一引物106和所述的第二引物108接觸。第一引物106是與靶核酸100的第一部分102互補(bǔ)的。第二引物108包括第一區(qū)110，和第二區(qū)112，第一區(qū)110含有與靶核酸100的第二部分104互補(bǔ)的序列。第二引物108的第二區(qū)112包括非天然堿基114。第二區(qū)112是不與靶核酸100互補(bǔ)的。
除了第一引物和第二引物，樣品也與聚合酶接觸，如本文所述進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。如果靶核酸100存在于樣品中，第一引物106的互補(bǔ)部分和第二引物108的互補(bǔ)部分與靶核酸100的對(duì)應(yīng)的102和104區(qū)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的堿基配對(duì)規(guī)則退火。如附圖所示，當(dāng)引物與靶退火時(shí)，第一引物106的3’端核苷酸是通過(guò)附圖1B中作為107描述的核苷酸的一個(gè)序列，或一個(gè)“空位”與第二引物108的3’端核苷酸分離的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一和第二寡核苷酸引物設(shè)計(jì)成當(dāng)與模板核酸退火時(shí)，模板核酸上約0至約5個(gè)堿基的空位107存在于PCR引物的3’末端之間。
正如附圖1B所示，將聚合酶用于利用PCR，或Fast-shotTM擴(kuò)增來(lái)從每個(gè)引物的3‘-OH末端合成單鏈。即，將第一引物106用于合成與靶核酸100的鏈100a的至少一部分互補(bǔ)的鏈120a，和將第二引物108用于合成與靶核酸100的鏈100b的至少一部分互補(bǔ)的鏈120b，如附圖1C所示。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)允許進(jìn)行需要數(shù)目的循環(huán)得到擴(kuò)增產(chǎn)物120。
如附圖1C所示，擴(kuò)增產(chǎn)物120包括雙鏈區(qū)122和單鏈區(qū)124。如這一實(shí)施方案所示，非天然堿基114定位于單鏈區(qū)124，鄰接雙鏈區(qū)122。單鏈區(qū)124可以包括不止一個(gè)非天然堿基。
現(xiàn)在參考附圖1D，將擴(kuò)增產(chǎn)物120與報(bào)道分子126接觸。我們考慮可以在已經(jīng)存在靶核酸的擴(kuò)增之前，期間或之后的反應(yīng)中加入報(bào)道分子126。報(bào)道分子126包括標(biāo)記128，132，和與擴(kuò)增產(chǎn)物120的單鏈區(qū)124的非天然堿基114互補(bǔ)的非天然堿基130。在附圖1D所示的實(shí)施方案中，報(bào)道分子126包括含有染料128和淬滅劑132的一個(gè)標(biāo)記和非天然堿基130。報(bào)道分子126允許與擴(kuò)增產(chǎn)物120退火。在退火后，至少將報(bào)道分子126的一部分裂解，產(chǎn)生包括染料128的報(bào)道分子片段134，如附圖1E所示。報(bào)道分子片段134的釋放與樣品中的靶核酸的存在相關(guān)。在所述的情況中，檢測(cè)了未淬滅的報(bào)道分子片段染料的存在。在或選的實(shí)施方案中，染料和淬滅劑的定位是相反的，而報(bào)道分子片段在裂解時(shí)帶走了淬滅劑。
附圖8敘述了或選的測(cè)試方法，其中淬滅劑132是與第二引物108而不是報(bào)道分子偶聯(lián)的。淬滅劑132淬滅了報(bào)道分子126的染料128的熒光，直到報(bào)道分子126的一部分裂解產(chǎn)生了包括染料128的報(bào)道分子片段134。如一個(gè)或選方法中，淬滅劑可以與報(bào)道分子偶聯(lián)，染料可以與第二個(gè)引物偶聯(lián)。在目前的說(shuō)明書(shū)中，這些附圖的實(shí)施方案之間共同的元素是相同地編號(hào)的，并且這些元素不需要分開(kāi)討論。
附圖9A-9E，10A-10E，11A-11E，和12A-12E敘述了許多與附圖1A-1E的測(cè)試相似的實(shí)施方案，其中X和Y代表非標(biāo)準(zhǔn)堿基。例如，X可以代表異胞苷，Y代表異鳥(niǎo)苷。下面的敘述說(shuō)明了在附圖1A-1E的測(cè)試和這些實(shí)施方案之間的差異。另外，同樣的考慮方法和條件也可以應(yīng)用。
在附圖9A-9E的測(cè)試中，將第一和第二引物106，108與雙鏈靶核酸100接觸，如附圖9A所示。第二引物具有與靶核酸的一部分互補(bǔ)的第一部分110，和與靶核酸不互補(bǔ)的第二部分112，該部分通常不與靶核酸雜交。第二引物108在第二部分112具有非標(biāo)準(zhǔn)堿基114，并且與和靶核酸退火的第二引物的第一部分110鄰接。將第一和第二引物用于通過(guò)PCR成一個(gè)與靶核酸的部分互補(bǔ)的擴(kuò)增產(chǎn)物120，如附圖9B和9C所示。擴(kuò)增產(chǎn)物120具有雙鏈區(qū)122和單鏈區(qū)124。將報(bào)道分子126與擴(kuò)增產(chǎn)物120的單鏈區(qū)124接觸，如附圖9C所示。報(bào)道分子包括與單鏈區(qū)124的非標(biāo)準(zhǔn)堿基114互補(bǔ)的非標(biāo)準(zhǔn)堿基119。報(bào)道分子126與單鏈區(qū)124退火，如附圖9D所示。在報(bào)道分子126中，與非標(biāo)準(zhǔn)堿基119鄰接的堿基127可以與鄰接于單鏈區(qū)的非標(biāo)準(zhǔn)堿基114的雙鏈區(qū)的堿基131互補(bǔ)，但不是必需這樣的。通過(guò)聚合酶裂解堿基127，形成報(bào)道分子片段134，如附圖9E所示，報(bào)道分子片段134通常含有一個(gè)標(biāo)記或標(biāo)記的一個(gè)部分128，如熒光團(tuán)或淬滅劑，以便允許檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物120的報(bào)道分子片段。任選地，用通常包括標(biāo)記128的寡核苷酸序列替代堿基127，并且從報(bào)道分子的剩余部分裂解。
附圖10A-10E中敘述了另一個(gè)實(shí)施方案。在這一實(shí)施方案中，堿基131不是與靶核酸序列互補(bǔ)的第二引物108的第一區(qū)110的部分，而堿基131是與該靶核酸序列不互補(bǔ)的，并且是第二引物108的第二區(qū)112的部分。否則，這一測(cè)試的步驟和方法是與附圖9A-9E的測(cè)試相同的。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一和第二引物106，108是與雙鏈靶核酸100接觸的，如附圖11A所示。第二引物具有與靶核酸的一部分互補(bǔ)的第一部分110，和與靶核酸不互補(bǔ)的第二部分112，該部分通常不與靶核酸雜交。第二引物108至少具有在第二部分112中的兩個(gè)連續(xù)的非標(biāo)準(zhǔn)堿基114，117，并且與靶核酸退火的第二引物的第一部分110鄰接。第一和第二引物用于通過(guò)PCR合成與靶核酸的許多部分互補(bǔ)的擴(kuò)增產(chǎn)物120，如附圖11B和11C所示。擴(kuò)增產(chǎn)物120具有雙鏈區(qū)122和單鏈區(qū)124。任選地，堿基141從非標(biāo)準(zhǔn)堿基114，117的第一個(gè)對(duì)側(cè)錯(cuò)誤摻入。報(bào)道分子126接觸擴(kuò)增產(chǎn)物120的單鏈區(qū)124，如附圖11C所述。報(bào)道分子包括與第二引物的非標(biāo)準(zhǔn)堿基互補(bǔ)的非標(biāo)準(zhǔn)堿基。報(bào)道分子126與單鏈區(qū)124退火，如附圖11D所示。非標(biāo)準(zhǔn)堿基127是通過(guò)聚合酶裂解的，產(chǎn)生報(bào)道分子片段134，如附圖11E所示，該片段通常含有一個(gè)標(biāo)記或標(biāo)記的一個(gè)部分128，如熒光團(tuán)或淬滅劑，以便允許檢測(cè)報(bào)道分子片段或擴(kuò)增產(chǎn)物120?；蛘?，用通常包括標(biāo)記128的寡核苷酸序列取代堿基127，并且從報(bào)道分子的剩余部分中裂解。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一和第二引物106，108與雙鏈靶核酸100接觸，如附圖12A所示。第二引物具有與靶核酸的一個(gè)部分互補(bǔ)的第一部分110，和與靶核酸不互補(bǔ)的第二部分112，該部分通常不與靶核酸雜交。第二引物108具有在第二部分112中的兩個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)堿基114，117，并且與和靶核酸退火的第二引物的第一部分110鄰接。第一和第二引物用于通過(guò)PCR合成與靶核酸的多個(gè)部分互補(bǔ)的擴(kuò)增產(chǎn)物120，如附圖12B和12C所示。擴(kuò)增產(chǎn)物120具有雙鏈區(qū)122和單鏈區(qū)124。任選地，擴(kuò)增產(chǎn)物120包括從非標(biāo)準(zhǔn)堿基117對(duì)側(cè)通過(guò)聚合酶錯(cuò)誤摻入的堿基121。報(bào)道分子126與擴(kuò)增產(chǎn)物120的單鏈區(qū)124接觸，如附圖12C所示。報(bào)道分子包括與第二引物的非標(biāo)準(zhǔn)堿基114互補(bǔ)的非標(biāo)準(zhǔn)堿基。報(bào)道分子126與單鏈區(qū)124退火，如附圖12D所示。報(bào)道分子126包括偶聯(lián)于與單鏈區(qū)的堿基114退火的非標(biāo)準(zhǔn)堿基119的堿基127，但堿基127與單鏈區(qū)的堿基117不互補(bǔ)。堿基127通過(guò)聚合酶裂解，形成報(bào)道分子片段134，如附圖12E所示，該片段通常含有一個(gè)標(biāo)記或標(biāo)記的一個(gè)部分128，如熒光團(tuán)或淬滅劑，以便允許檢測(cè)報(bào)道分子片段或擴(kuò)增產(chǎn)物120。任選地，用通常含有標(biāo)記128的寡核苷酸序列取代堿基127，并且從報(bào)道分子的剩余部分中裂解。
在附圖2中圖解說(shuō)明了本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案。如附圖2A所示，雙鏈靶核酸100包括第一部分102和第二部分104。樣品與第一引物106和第二引物108接觸。第一引物106是與靶核酸100的第一部分102互補(bǔ)的。第二引物108包括與靶核酸100的第二部分104互補(bǔ)的第一區(qū)110，和含有非天然堿基114，并且是不與靶核酸100互補(bǔ)的第二區(qū)114。
除了第一引物106和第二引物108，樣品與聚合酶(未示出)接觸，并且進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。與附圖1所示的實(shí)施方案相似如果靶核酸100存在于樣品中，第一引物106的互補(bǔ)部分和第二引物108的互補(bǔ)部分110將與靶核酸100的對(duì)應(yīng)區(qū)102，104根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的堿基配對(duì)規(guī)則退火。與附圖1所示的實(shí)施方案相似，當(dāng)引物與靶退火時(shí)，第一引物106的3’端核苷酸是通過(guò)一個(gè)核苷酸序列或“空位”107與第二引物108的3’端核苷酸分離的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將第一和第二寡核苷酸引物設(shè)計(jì)成當(dāng)與模板核酸退火時(shí)在PCR引物的3’末端之間存在模板核酸上約0到約5個(gè)堿基的一個(gè)空位。
如附圖2B和2C所示，聚合酶用于利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，或Fast-shotTM擴(kuò)增，從每個(gè)引物的3’-OH末端合成單鏈120a、120b。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)允許進(jìn)行需要數(shù)目的循環(huán)，得到附圖2C所示的擴(kuò)增產(chǎn)物120。
如附圖2C所示，擴(kuò)增產(chǎn)物120包括雙鏈區(qū)122和單鏈區(qū)124。如示，單鏈區(qū)124包括第二引物108的非天然堿基114。雖然證實(shí)單鏈區(qū)124包括單個(gè)的非天然堿基，但本發(fā)明并不限于止，單鏈區(qū)可以包括一個(gè)以上非天然堿基。
現(xiàn)在參考附圖2D，擴(kuò)增產(chǎn)物120與報(bào)道分子150接觸。在PCR擴(kuò)增之前，期間或之后，在樣品中加入報(bào)道分子150。報(bào)道分子150包括一個(gè)標(biāo)記154和與擴(kuò)增產(chǎn)物120的單鏈區(qū)124的非天然堿基114互補(bǔ)的非天然堿基152，如附圖2E所示。將報(bào)道分子150摻入與非天然堿基114相對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物中。如下面更詳細(xì)討論的，報(bào)道分子150的摻入可以利用任何適當(dāng)?shù)拿?，如聚合酶或連接酶來(lái)進(jìn)行。樣品中的靶核酸的存在是通過(guò)與擴(kuò)增產(chǎn)物中的報(bào)道分子的存在進(jìn)行關(guān)聯(lián)而確定的。在所述的情況中，例如，靶核酸的存在是通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記154，例如通過(guò)熒光或其他顯示方法來(lái)確定的。適當(dāng)?shù)臋z測(cè)和顯示方法將在下面更詳細(xì)地?cái)⑹觥?br> 盡管附圖1和2的附圖解表示了本發(fā)明的成分的相關(guān)的位置和大小，這些代表的含義是僅為了說(shuō)明的目的。正如將在本文的討論中理解的，第一引物和第二引物的相對(duì)大小以及靶核酸的第一部分和第二部分將根據(jù)特定的應(yīng)用而變化。另外，沿著靶核酸的第一引物和第二引物的相對(duì)位置將變化。另外，用于本發(fā)明的非天然堿基和標(biāo)記的位置將根據(jù)用途而變化。
聚合酶本發(fā)明提供了利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，或Fast-shotTM擴(kuò)增的材料和方法以檢測(cè)樣品中需要的靶核酸。適當(dāng)?shù)暮怂峋酆厦咐绨軌蛲ㄟ^(guò)摻入與模板寡核苷酸互補(bǔ)的核酸延伸寡核苷酸的聚合酶。例如，聚合酶可以是DNA聚合酶。
具有聚合酶活性的酶催化在核酸引物的延伸端的3’羥基基團(tuán)和核苷酸三磷酸的5’磷酸基團(tuán)之間形成鍵。這些核苷酸三磷酸通常是選自脫氧腺苷三磷酸(A)，脫氧胸苷三磷酸(T)，脫氧胞苷三磷酸(C)和脫氧鳥(niǎo)苷三磷酸(G)。但是，至少在一些實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的方法的聚合酶也可以利用那些非天然堿基的核苷酸三磷酸摻入非天然堿基。
因?yàn)樵诟鞣N方法例如PCR過(guò)程中的鏈變性需要的相對(duì)高的溫度可以導(dǎo)致許多核酸聚合酶的不可逆的失活，用于本發(fā)明中的核酸聚合酶，優(yōu)選地保留了足夠的聚合酶活性，當(dāng)遭受許多方法如PCR的極端溫度時(shí)將能夠完成反應(yīng)。優(yōu)選地用于本發(fā)明的方法的核酸聚合酶是熱穩(wěn)定的核酸聚合酶。適當(dāng)?shù)臒岱€(wěn)定核酸聚合酶包括，但不限于來(lái)源于嗜熱生物體的酶。衍生適當(dāng)?shù)臒岱€(wěn)定核酸聚合酶的嗜熱生物體的例子包括，但不限于水生棲熱菌，嗜熱棲熱菌，黃棲熱菌，那不勒斯棲熱袍菌和芽孢桿菌，以及熱球菌屬，硫化葉菌和火球菌屬的物種。核酸聚合酶可以直接從這些嗜熱生物體中純化。但是，核酸聚合酶產(chǎn)量的大量增加可以首先在多拷貝表達(dá)載體中通過(guò)重組DNA技術(shù)方法克隆編碼酶的基因，將載體插入能夠表達(dá)酶的宿主細(xì)胞菌株，培養(yǎng)含有載體的宿主細(xì)胞，然后從已經(jīng)表達(dá)酶的宿主細(xì)胞菌株中提取核酸聚合酶而完成。適當(dāng)?shù)臒岱€(wěn)定核酸聚合酶如上面所述的那些是可以購(gòu)買(mǎi)得到的。
許多核酸聚合酶具有核酸聚合酶活性以外的活性；這些可以包括5’-3’外切核酸酶活性和3’-5’外切核酸酶活性。5’-3’和3’-5’外切核酸酶活性是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。3’-5’外切核酸酶活性通過(guò)除去已經(jīng)摻入的不準(zhǔn)確的堿基，提高了新合成的鏈的準(zhǔn)確度。相反，經(jīng)常存在于核酸聚合酶中的5’-3’外切酶活性可能在特定的應(yīng)用中并不理想，因?yàn)樗赡芟怂?，包括具有未保護(hù)的5’末端的引物。所以，具有減弱的5’-3’外切核酸酶活性或其中缺乏這樣的活性的熱穩(wěn)定核酸聚合酶是在本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案中利用的酶的需要的特征。在其他實(shí)施方案中，聚合酶需要具有5’-3’外切核酸酶活性來(lái)有效地裂解報(bào)道分子和釋放已標(biāo)記的片段，使該信號(hào)可以直接或間接地產(chǎn)生。
沒(méi)有5’-3’外切核酸酶活性或具有減弱的5’-3’外切核酸酶活性的適當(dāng)?shù)暮怂峋酆厦甘潜绢I(lǐng)域已知的。已經(jīng)敘述了各種核酸聚合酶，其中已經(jīng)在完成該靶核酸聚合酶中導(dǎo)入了一個(gè)修飾。例如，大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段可以以全酶的蛋白質(zhì)水解片段形式產(chǎn)生，其中已經(jīng)除去控制5’-3’外切核酸酶活性的蛋白質(zhì)區(qū)域。缺5’-3’外切核酸酶活性的適當(dāng)?shù)暮怂峋酆厦甘强梢陨虡I(yè)獲得的。缺乏5’-3’外切核酸酶活性的商業(yè)可得聚合酶的例子包括AMPLITAQSTOFFELTMDNA聚合酶和KlenTaqTMDNA聚合酶。
聚合酶可以是PCR過(guò)程中“錯(cuò)誤摻入”的堿基。用另一句話說(shuō)，聚合酶可以在合成的鏈的3’位置上摻入一個(gè)核苷酸(例如，腺苷)，它不與模板核酸鏈上的配對(duì)的核苷酸(例如，胞苷)形成規(guī)范的氫堿基對(duì)?？梢愿淖働CR條件降低堿基的錯(cuò)誤摻入的發(fā)生。例如，可以改變反應(yīng)條件，如濕度，鹽濃度，pH，去垢劑濃度，金屬的類(lèi)型，金屬的濃度，等等來(lái)降低聚合酶將摻入與模板鏈不互補(bǔ)的堿基的可能性。
正如利用單個(gè)聚合酶的或選方案，任何本文所述的方法可以利用多個(gè)酶進(jìn)行。例如，聚合酶，如外切核酸酶缺失的聚合酶，和外切核酸酶可以聯(lián)合使用。另一個(gè)例子是外切核酸酶缺失聚合酶和熱穩(wěn)定瓣內(nèi)切核酸酶的使用。另外，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，RNA可以用作樣品，逆轉(zhuǎn)錄酶可以用于將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA。轉(zhuǎn)錄可以在PCR擴(kuò)增之前或期間發(fā)生。
第一引物和第二引物本發(fā)明提供了利用包括聚合酶，第一引物和第二引物的PCR檢測(cè)靶核酸的方法。如附圖1，2，和9-12所示，第一引物106含有與靶核酸100的第一部分102互補(bǔ)的序列。第二引物108含有第一區(qū)110和第二區(qū)112，第一區(qū)110含有與靶核酸的第二部分104互補(bǔ)的序列，第二區(qū)112至少含有一個(gè)非天然堿基。第二區(qū)通常與靶核酸不互補(bǔ)。
在PCR技術(shù)中，將引物設(shè)計(jì)成與已知存在于待擴(kuò)增的靶核酸中的序列互補(bǔ)。通常，選擇與待擴(kuò)增的靶核酸序列的側(cè)翼序列(可以是部分)互補(bǔ)的引物。優(yōu)選地，選擇與待檢測(cè)的靶核酸的序列側(cè)翼互補(bǔ)的引物。一旦靶核酸的序列已知，首先確定待檢測(cè)的靶核酸的長(zhǎng)度或大小，確定靠近靶核酸序列的5’和3’末端或緊鄰5’和3’末端的適當(dāng)?shù)膫?cè)翼序列，和利用標(biāo)準(zhǔn)的Watson-Crick堿基配對(duì)規(guī)則確定靶核酸序列的側(cè)翼互補(bǔ)核酸序列，然后合成已確定的引物序列來(lái)制備引物的序列。這一制備過(guò)程可以利用本領(lǐng)域已知的適當(dāng)方法來(lái)完成，例如克隆和限制消化適當(dāng)?shù)男蛄泻椭苯拥幕瘜W(xué)合成。化學(xué)合成方法可以包括例如，Narang等人(1979)，酶學(xué)方法68∶90所述的磷酸三酯方法，Brown等人(1979)，酶學(xué)方法68109中公開(kāi)的磷酸二酯方法，Beaucage等人(1981)Tetrahedron Letters 221859中公開(kāi)的二乙基氨基磷酸酯方法和美國(guó)專(zhuān)利4,458,066中公開(kāi)的固相支持方法，所有這些摻入本文作為參考。
第一和第二引物與靶核酸形成足夠穩(wěn)定的雜交體的能力取決于幾個(gè)因素，例如在引物和靶核酸之間展示的互補(bǔ)性程度。通常，與它的靶具有更高程度的互補(bǔ)性的寡核苷酸將與靶形成更穩(wěn)定的雜交體。
另外，引物的長(zhǎng)度可以影響引物與靶核酸雜交的溫度。通常，與較短引物相比，較長(zhǎng)的引物與靶核酸序列在更高的溫度下形成足夠穩(wěn)定的雜交體。
另外，在引物中存在高比例的G或C或特定的非天然堿基可以增強(qiáng)在引物和靶核酸之間形成雜交體的穩(wěn)定性。這種增強(qiáng)的穩(wěn)定性例如可以是由G-C相互作用中或其他非天然堿基對(duì)相互作用中存在3個(gè)氫鍵造成的，相比之下，A-T相互作用中存在兩個(gè)氫鍵。
通過(guò)解鏈溫度，或“Tm”可以估計(jì)或表示核酸雙鏈體的穩(wěn)定性。在特定條件下的特定的核酸雙鏈體的Tm是核酸雙鏈體的50％的群體解離成單鏈核酸分子的溫度。特定的核酸雙鏈體的Tm可以通過(guò)任何適當(dāng)?shù)姆椒▉?lái)推測(cè)。確定特定的核酸雙鏈體的Tm的適當(dāng)?shù)姆椒ɡ绨ㄜ浖绦?。適當(dāng)?shù)挠糜谶@些方法中的引物和本發(fā)明的試劑盒可以根據(jù)含有該引物的寡核苷酸雙鏈體的推測(cè)的Tm來(lái)預(yù)定。
如附圖1和2所示，當(dāng)將第一和第二引物與靶核酸退火，空位107存在于第一引物106的3’末端核苷酸和第二引物108的3’末端核苷酸之間?？瘴?07含有靶核酸的許多核苷酸?？瘴豢梢允侨魏螖?shù)目的核苷酸，前提是聚合酶可以有效地?fù)饺牒塑账岬窖娱L(zhǎng)的鏈中，在一輪PCR反應(yīng)(例如，一輪退火，延伸，變性)中填充空位。通常，聚合酶可以在每秒放置約30到約100個(gè)堿基。所以，引物之間空位的最大長(zhǎng)度取決于一輪PCR中的時(shí)間，其中溫度是在一個(gè)范圍中，其中聚合酶是有活性的，并且引物是退火的。
對(duì)于Fast-shotTM擴(kuò)增，利用標(biāo)準(zhǔn)熱循環(huán)儀，溫度變化相對(duì)是慢的，只要限制了Peltier冷卻和加熱。當(dāng)利用標(biāo)準(zhǔn)熱循環(huán)儀時(shí)，F(xiàn)ast-shotTM擴(kuò)增反應(yīng)的條件是在溫度范圍內(nèi)的，其中聚合酶是有活性的，引物退火約10到15秒。應(yīng)該考慮，本發(fā)明的方法可以利用能夠快速熱循環(huán)樣品溫度的微流系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行。當(dāng)延伸時(shí)間相對(duì)短時(shí)，溫度變化相對(duì)快速。這樣的快速熱循環(huán)可以利用例如，LabChipTM技術(shù)來(lái)進(jìn)行(Caliper技術(shù)，Palo Alto，CA)。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一和第二寡核苷酸引物設(shè)計(jì)成當(dāng)與靶核酸退火時(shí)，在PCR引物的3’末端之間存在靶核酸上的約0到約5個(gè)堿基的空位。
非天然堿基正如本發(fā)明所考慮的，第二引物的第二區(qū)通常至少含有一個(gè)非天然堿基。DNA和RNA是包括分別用磷酸二酯鍵偶聯(lián)的脫氧核糖或核糖的寡核苷酸。各個(gè)脫氧核糖或核糖包括與糖偶聯(lián)的一個(gè)堿基。摻入天然存在的DNA和RNA中的堿基是腺嘌呤(A)，鳥(niǎo)嘌呤(G)，胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)，和尿嘧啶(U)。這5個(gè)堿基是“天然堿基”。根據(jù)Watson和Crick闡述的堿基配對(duì)規(guī)則，天然堿基可以雜交形成嘌呤-嘧啶堿基對(duì)，其中G與C配對(duì)，A與T或U配對(duì)。這些配對(duì)規(guī)則促進(jìn)了寡核苷酸與互補(bǔ)的寡核苷酸的特異的雜交。
通過(guò)在各個(gè)堿基對(duì)的兩個(gè)堿基之間產(chǎn)生兩個(gè)或3個(gè)氫鍵有助于天然堿基的堿基對(duì)的形成。各個(gè)堿基包括兩個(gè)或三個(gè)氫鍵供體和氫鍵受體。堿基對(duì)的氫鍵是通過(guò)在一個(gè)堿基上的至少一個(gè)氫鍵供體與另一個(gè)堿基的氫鍵受體之間的相互作用來(lái)形成的。氫鍵供體例如包括至少具有一個(gè)附著的氫的雜原子(例如，氧或氮)。氫鍵受體包括例如，具有單個(gè)電子對(duì)的雜原子(例如，氧或氮)。
通過(guò)在非氫鍵位置取代可以使天然堿基，A，G，C，T，和U衍生形成修飾的天然堿基。例如，通過(guò)將反應(yīng)性官能團(tuán)(例如，硫，肼，醇，胺等等)與堿基的非氫鍵原子連接附著于支持物上，可以修飾天然堿基。其他可能的取代基包括例如，生物素，地高辛配基，熒光基團(tuán)，烷基(例如，甲基或乙基)等等。
形成氫鍵的堿基對(duì)的非天然堿基也可以如美國(guó)專(zhuān)利5,432,272，5,965,364，6,001,983和6,037,120和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)08/775,401中所述構(gòu)建，該文獻(xiàn)引入本文作為參考。附圖3說(shuō)明了適當(dāng)?shù)膲A基和它們對(duì)應(yīng)的堿基對(duì)的幾個(gè)實(shí)例。這些堿基的特定的例子包括在堿基對(duì)組合中的下面的堿基(iso-C/iso-G，K/X，H/J，和M/N)
其中A是附著于糖或多聚體主鏈的其他部分的位置，R是H或取代或未取代烷基基團(tuán)?？梢哉J(rèn)識(shí)到，利用氫鍵的其他非天然堿基是可以制備的，以及通過(guò)在堿基的非氫鍵原子中摻入官能團(tuán)可以修飾上面鑒定的非天然堿基。
這些非天然堿基對(duì)的氫鍵是與天然堿基的那些相似的，其中在配對(duì)的非天然堿基的氫鍵受體和氫鍵供體之間形成兩個(gè)或3個(gè)氫鍵。在天然堿基和這些非天然堿基之間的不同之一是氫鍵受體和氫鍵供體的數(shù)目和地址。例如，胞嘧啶可以認(rèn)為是供體/受體/受體堿基，鳥(niǎo)嘌呤是互補(bǔ)的受體/供體/供體堿基。Iso-C是受體/受體/供體堿基，iso-G是互補(bǔ)的供體/供體/受體堿基，如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,037,120中所述，引入本文作為參考。
用于寡核苷酸的其他非天然堿基例如包括在引入本文作為參考的Ren等人，J.Am.Chem.Soc.118，1671(1996)和Mc Minn等人，J.Am.Chem.Soc.121，11585(1999)討論的萘，菲，和芘衍生物。這些堿基不利用氫鍵穩(wěn)定，而是依靠疏水性或范德華力形成堿基對(duì)。
根據(jù)本發(fā)明所述的非天然堿基的利用是在樣品中存在的核酸序列的檢測(cè)和定量下可延伸的。例如，非天然堿基可以被催化與核酸相關(guān)的反應(yīng)的許多酶識(shí)別。盡管聚合酶需要互補(bǔ)核苷酸以繼續(xù)聚合一種延伸寡核苷酸鏈，其他酶不需要互補(bǔ)核苷酸。如果模板中存在非天然堿基，并且在反應(yīng)混合物中不存在它的互補(bǔ)的非天然堿基，當(dāng)嘗試使延長(zhǎng)中的引物延伸超過(guò)非天然堿基時(shí)，聚合酶通常將終止(或者在一些情況中，當(dāng)給予足夠的時(shí)間，錯(cuò)誤摻入一個(gè)堿基)。但是，催化與核酸相關(guān)的反應(yīng)的其他酶，如連接酶，激酶，核酸酶，聚合酶，拓?fù)洚悩?gòu)酶，螺旋酶等等可以催化包括非天然堿基的反應(yīng)。這樣的非天然堿基的特征是可以利用的，并且在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
例如，非天然堿基可以用于產(chǎn)生具有單個(gè)鏈突出端的雙鏈核酸序列。這可以通過(guò)進(jìn)行PCR反應(yīng)檢測(cè)樣品中的靶核酸來(lái)完成，靶核酸具有第一部分和第二部分，其中反應(yīng)系統(tǒng)包括所有四種天然存在的dNTP，第一引物與靶核酸的第一部分互補(bǔ)，第二引物具有第一區(qū)和第二區(qū)，第一區(qū)是與靶核酸的第一部分互補(bǔ)的，第二部分是與靶核酸不互補(bǔ)的。第二引物的第二區(qū)含有非天然堿基。如果存在靶核酸，第一引物和第二引物的第一區(qū)與其雜交。幾輪PCR將產(chǎn)生含有(i)雙鏈區(qū)和(ii)單鏈區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物。雙鏈區(qū)是通過(guò)在PCR中延伸第一和第二引物形成的。單鏈區(qū)包括一個(gè)或更多非天然堿基。由于聚合酶不能夠在缺乏互補(bǔ)的非天然堿基的核苷酸三磷酸時(shí)，通過(guò)超過(guò)非天然堿基的聚合作用來(lái)形成延伸產(chǎn)物，因而導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈區(qū)。以這種方式非天然堿基的功能是維持?jǐn)U增產(chǎn)物的單鏈區(qū)。
如上面提到的，在一些情況下，聚合酶可以是在非天然堿基的對(duì)側(cè)錯(cuò)誤摻入一個(gè)堿基。在這一實(shí)施方案中，錯(cuò)誤摻入是因?yàn)樵摲磻?yīng)混合物不包括互補(bǔ)的非天然堿基而發(fā)生的。所以，如果給予足夠的時(shí)間，在一些情況中，聚合酶在反應(yīng)混合物中非天然堿基對(duì)側(cè)錯(cuò)誤摻入了一個(gè)堿基。
擴(kuò)增在PCR過(guò)程中，聚合酶，第一引物和第二引物是用于產(chǎn)生如本文所述的擴(kuò)增產(chǎn)物的。可以利用的一個(gè)PCR技術(shù)是修飾的PCR，或Fast-shotTM擴(kuò)增。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“Fast-shotTM擴(kuò)增”指修飾的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
傳統(tǒng)的PCR方法包括下面步驟變性，或雙鏈核酸的解鏈；引物的退火；和利用聚合酶延伸引物。這一循環(huán)是通過(guò)變性延伸的引物和再起始來(lái)重復(fù)的。理論上，靶序列的拷貝數(shù)是指數(shù)增長(zhǎng)的。在實(shí)踐中，它通常在每個(gè)循環(huán)中加倍直到達(dá)到一個(gè)平臺(tái)，這時(shí)引物模板積累，多于在循環(huán)過(guò)程中酶的延伸；然后靶核酸變成線性增加。
Fast-shot擴(kuò)增是修飾的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其中延伸步驟，以及退火和解鏈步驟是非常短或沒(méi)有。正如本文所用，當(dāng)提到PCR的“步驟”時(shí)，一個(gè)步驟是一個(gè)時(shí)期，其中反應(yīng)維持在需要的溫度，而沒(méi)有溫度的很大波動(dòng)。例如，典型的PCR的延伸步驟約為30秒到約60秒。Fast-shotTM擴(kuò)增的延伸步驟通常的范圍是約0秒到約20秒。優(yōu)選地，延伸步驟約1秒或更少。在優(yōu)選的實(shí)施方案中刪除了延伸步驟。典型的PCR的退火和解鏈步驟的時(shí)間可以是在30秒到60秒的范圍內(nèi)。Fast-shotTM擴(kuò)增中的退火和解鏈步驟通常可以在約0到約60秒的范圍內(nèi)。對(duì)于Fast-shotTM擴(kuò)增，退火和解鏈步驟通常不超過(guò)2秒，優(yōu)選地約1秒或更少。當(dāng)刪除了延伸步驟時(shí)，溫度是在退火和解鏈步驟之間循環(huán)，但不包括在退火和解鏈溫度之間的中間延伸步驟。
另外，從退火溫度到解鏈溫度中溫度可以改變多快的限制是取決于在延伸引物上摻入堿基過(guò)程中的聚合酶的效率和必需摻入的堿基的數(shù)目，這是通過(guò)引物之間的空位和引物的長(zhǎng)度而確定的。Fast-shotTM擴(kuò)增的例子如實(shí)施例中所示。
用于確定樣品中核酸序列的存在所需的Fast-shotTM擴(kuò)增循環(huán)的數(shù)目可以根據(jù)樣品中靶分子的數(shù)目而改變。在如下所述的一個(gè)實(shí)施例中，總共37個(gè)循環(huán)足夠用于檢測(cè)少至100個(gè)靶核酸分子的。
擴(kuò)增產(chǎn)物如附圖1，2，和9-12所示，PCR可用于產(chǎn)生含有雙鏈區(qū)122和單鏈區(qū)124的擴(kuò)增產(chǎn)物120。如這些附圖所示，雙鏈區(qū)122是從第一和第二引物106和108延伸得到的。如上討論，單鏈區(qū)124通過(guò)在本發(fā)明的第二個(gè)引物中摻入非天然堿基得到的。第二引物108的第二區(qū)112是與靶核酸100不互補(bǔ)的。如上討論，因?yàn)榉翘烊粔A基遵循Watson和Crick的堿基配對(duì)原則并且與其他非天然堿基形成鍵，非天然堿基的存在維持了第二區(qū)112，作為擴(kuò)增產(chǎn)物120中的單鏈區(qū)124。
在或選的實(shí)施方案中，單鏈區(qū)124包括一個(gè)以上的非天然堿基。非天然堿基的數(shù)目包括在第二引物108的第二區(qū)112，可以根據(jù)需要選擇。
報(bào)道分子如本文所用，術(shù)語(yǔ)“報(bào)道分子”指互補(bǔ)的成分(例如，一個(gè)寡核苷酸)，所以形成了具有第二引物的第二部分的雙鏈體結(jié)構(gòu)。參考例如附圖1，2和9-12所示的實(shí)施方案，報(bào)道分子含有一個(gè)標(biāo)記，128，132(附圖2中的154)和與單鏈區(qū)124的非天然堿基114互補(bǔ)的至少一個(gè)非天然堿基130(附圖2中的152)。優(yōu)選地，報(bào)道分子是與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的第一引物或第二引物不互補(bǔ)的。優(yōu)選地，報(bào)道分子的3’末端是“封閉的”，抑制了在引物延伸產(chǎn)物中摻入報(bào)道分子?！胺忾]”可以通過(guò)利用非互補(bǔ)堿基或通過(guò)在最后的核苷酸的3’羥基加一個(gè)化學(xué)部分如生物素或磷酸基團(tuán)來(lái)達(dá)到，取決于選擇的部分，它也可以通過(guò)作為標(biāo)記到達(dá)雙重目的。
用于本發(fā)明的報(bào)道分子可以含有一個(gè)以上的非天然堿基。包括在報(bào)道分子中的非天然堿基的數(shù)目可以由使用者確定，將取決于一些因素，如第二引物的第二區(qū)的長(zhǎng)度和堿基組成和需要的雜交條件和雜交的特異性。
第二引物的第二區(qū)的核苷酸含量通常決定了報(bào)道分子的核苷酸含量。即，通過(guò)確定第二引物的第二區(qū)的序列，和利用Watson和Crick發(fā)現(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)則確定第二區(qū)的互補(bǔ)序列來(lái)確定報(bào)道分子的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，例如，第二引物的第二區(qū)含有單個(gè)的非天然堿基。在這一實(shí)施方案中，報(bào)道分子將優(yōu)選地包括單個(gè)的非天然堿基，該堿基與第二引物的中的非天然堿基互補(bǔ)。同樣，當(dāng)?shù)诙锏牡诙^(qū)中包括一個(gè)非天然堿基時(shí)，第二區(qū)的序列確定了該序列的互補(bǔ)序列，并且因此合成了報(bào)道分子。
假如第二引物的第二部分在多種測(cè)試中相同，具有能夠與第二引物的第二部分雜交的相同序列的報(bào)道分子可以在這些測(cè)試中使用。用另一句話說(shuō)，可以使用“通用”的報(bào)道分子和第二引物的第二部分。第二引物的“通用”的第二部分然后可以附著于第二引物或作為第二引物的部分而合成，其中第一部分是特異于靶核酸的。這例如可以用于使用者為了需要的靶核酸購(gòu)買(mǎi)的試劑盒中。
在其他實(shí)施方案中，在給定的測(cè)試中，利用幾個(gè)第二引物是有益的，每個(gè)在它們的第二區(qū)具有不同的序列，并且?guī)讉€(gè)報(bào)道分子中的每個(gè)具有與幾個(gè)不同的第二引物之一的第二部分互補(bǔ)的序列。在這樣的測(cè)試中，每個(gè)報(bào)道分子具有不同的標(biāo)記可能是有益的。在一些實(shí)施方案中，報(bào)道分子可以將它們的3’末端附著于固體或其他獨(dú)特的支持物的不同區(qū)。
報(bào)道分子與具有互補(bǔ)序列的寡核苷酸形成足夠穩(wěn)定的雜交體的能力取決于幾個(gè)因素，如上文關(guān)于引物的討論。
在或選的實(shí)施方案中，第二引物和報(bào)道分子是單個(gè)的化合物。這一實(shí)施方案在附圖4中有敘述。如附圖4A所示，靶核酸100與第一引物106和第二引物108接觸。在這一實(shí)施方案中，第二引物具有，第一區(qū)110，第二區(qū)112，接頭180，報(bào)道分子190，和淬滅劑196。在這一實(shí)施方案中，接頭180與將第二引物108與報(bào)道分子190連接。報(bào)道分子190含有染料192，非天然堿基194，淬滅劑196。非天然堿基194是與第二引物108的非天然堿基114互補(bǔ)的。如附圖4B所示，第一區(qū)110與靶核酸100的第一部分102退火。接頭180具有將一個(gè)核苷酸的5’末端與另一個(gè)核苷酸的3’末端連接的化學(xué)接頭。接頭180允許報(bào)道分子126回折，與第二引物102的第二區(qū)112形成堿基對(duì)，如附圖4B所示。在一個(gè)實(shí)施方案中，接頭180具有足夠長(zhǎng)度的核苷酸序列，允許報(bào)道分子126與第二區(qū)112雜交。優(yōu)選地，在這一實(shí)施方案中含有接頭180的核苷酸能夠形成發(fā)夾環(huán)182。在另一個(gè)實(shí)施方案中，報(bào)道分子126與第二區(qū)112雜交的溫度低于第一區(qū)110與靶110的第二區(qū)104雜交的溫度。
附圖4C表示了在PCR或Fast-shotTM擴(kuò)增中引物104和106延伸產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物200。擴(kuò)增產(chǎn)物200包括雙鏈區(qū)202和單鏈區(qū)204。報(bào)道分子190與擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈區(qū)204退火。
如附圖4D所示，通過(guò)酶，例如聚合酶或其他適當(dāng)?shù)拿?，裂解?bào)道分子190，這樣釋放了報(bào)道分子片段198。釋放的報(bào)道分子片段198包括染料192。如本文所述可以觀察到從淬滅劑196的附近釋放染料192。在一些實(shí)施方案中，可以將報(bào)道分子126與第二區(qū)112雜交，而第一和第二引物106，108延伸，如附圖4所示。這允許第一引物106充分延伸時(shí)聚合酶裂解報(bào)道分子片段198，并且可以允許在PCR過(guò)程中“實(shí)時(shí)”檢測(cè)測(cè)試而不需要隨后加入報(bào)道分子。在第一和第二引物的延伸過(guò)程中，報(bào)道分子與第二區(qū)的雜交不是必需的特征。在以附圖1所述的測(cè)試所述的相似的方法延伸后，可能發(fā)生報(bào)道分子與第二區(qū)的雜交。
標(biāo)記根據(jù)本發(fā)明，報(bào)道分子含有一個(gè)標(biāo)記。通過(guò)分光光譜，光化學(xué)，生物化學(xué)，免疫化學(xué)或化學(xué)測(cè)試摻入可檢測(cè)的部分可以標(biāo)記核苷酸和寡核苷酸。將標(biāo)記與核苷酸或寡核苷酸連接或偶聯(lián)的方法取決于利用標(biāo)記的類(lèi)型，和核苷酸或寡核苷酸上的標(biāo)記的位置。
適用于本發(fā)明的各種標(biāo)記，以及將其引入探針中的方法是本領(lǐng)域已知的，標(biāo)記包括但不限于酶底物，放射活性原子，熒光染料，生色團(tuán)，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記，電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記，如ORI-TAGTM(Igen)，具有特異的結(jié)合伙伴的配體或可以相互作用以增強(qiáng)，改變或減弱一個(gè)信號(hào)的任何其他標(biāo)記。應(yīng)該理解，PCR可以利用熱循環(huán)儀器進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，應(yīng)該選擇一個(gè)標(biāo)記，該標(biāo)記適應(yīng)這一自動(dòng)過(guò)程中需要的溫度循環(huán)。
適用于本發(fā)明的方法的一個(gè)標(biāo)記的一個(gè)放射性原子是32P。在核酸中導(dǎo)入32P的方法是本領(lǐng)域已知的，且包括例如用激酶進(jìn)行5’標(biāo)記，或通過(guò)切口翻譯隨機(jī)插人。
應(yīng)該理解，上面的敘述并不意味中在不同的類(lèi)別中分類(lèi)各種標(biāo)記，因?yàn)橄嗤臉?biāo)記可以以幾個(gè)不同的方式起作用。例如，125I可以作為放射性標(biāo)記或作為電子密度試劑。另外，為了需要的效果，可以組合各種標(biāo)記。例如，可以標(biāo)記具有生物素的核苷酸，和用具有125I標(biāo)記的抗生物素檢測(cè)它的存在。其它變更和可能性將是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員明了的，并且認(rèn)為是在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在一些情況中，在單個(gè)寡核苷酸上利用兩個(gè)相互作用的標(biāo)記是需要的，同時(shí)考慮在寡核苷酸上標(biāo)記之間保持適當(dāng)?shù)拈g隔，以允許寡核苷酸水解過(guò)程中這些標(biāo)記的分離。在不同的寡核苷酸上如報(bào)道分子和第二引物的第二區(qū)利用兩個(gè)相互作用的標(biāo)記同樣是需要的。在這一實(shí)施方案中，報(bào)道分子和第二區(qū)設(shè)計(jì)成相互雜交的。再次，考慮在雜交時(shí)維持寡核苷酸之間的標(biāo)記的適當(dāng)?shù)拈g隔。
相互作用的標(biāo)記對(duì)的一個(gè)類(lèi)型是淬滅劑-染料對(duì)。優(yōu)選地，淬滅劑-染料對(duì)是由熒光團(tuán)和淬滅劑組成的。適當(dāng)?shù)臒晒鈭F(tuán)包括例如，熒光素，級(jí)聯(lián)藍(lán)，六氯熒光素，四氯熒光素，TAMRA，ROX，Cy3，Cy3.5，Cy5，Cy5.5，4，4-二氟-5，7-二苯基-4-硼-3a，4a-二氮雜-s-indacene-3-丙酸，4，4-二氟-5，p-甲氧苯基-4-硼-3a，4a-二氮雜-s-indacene-3-丙酸，4，4-二氟-5-苯乙烯基-4-硼-3a，4a-二氮雜-S-indacene-丙酸，6-羧基-X-羅丹明，N，N N’，N’-四甲基-6-羧基羅丹明，德克薩斯紅，伊紅，熒光素，4.4-二氟-5，7-二苯基-4-硼-3a，4a-二氮雜-s-indacene-3-丙酸，4，4-二氟-5，p-乙氧苯基-4-硼-3a，4a-二氮雜-S-indacene3-丙酸，和4，4-二氟-5-苯乙烯基-4-硼-3a，4a-二氮雜-S-indacene-丙酸。適當(dāng)?shù)拇銣鐒┌ɡ纾珼abcyl，QSY7TM(分子探針，Eugene，OR)等等。另外，如果吸收另一個(gè)染料發(fā)射的光，染料也可以用作淬滅劑。
這些標(biāo)記可以直接或間接地通過(guò)各種技術(shù)附著于核苷酸，包括非天然堿基，或寡核苷酸。根據(jù)利用的標(biāo)記的準(zhǔn)確類(lèi)型，該標(biāo)記可以定位于報(bào)道分子的5’或3’端，內(nèi)部地定位于報(bào)道分子的核苷酸序列中，或附著于從報(bào)道分子延伸的間隔臂，并且具有各種大小和組成以促進(jìn)信號(hào)相互作用。利用商業(yè)可得的亞磷酰胺試劑，可以生產(chǎn)在每端含有官能團(tuán)(例如，硫醇或伯胺)的寡核苷酸，例如通過(guò)將亞磷酰胺染料與5’堿基的5’羥基通過(guò)形成磷酸鍵，或內(nèi)部地通過(guò)適當(dāng)?shù)囊驯Ｗo(hù)的亞磷酰胺偶聯(lián)來(lái)生產(chǎn)，可以利用如PCR方案A，方法和應(yīng)用的指導(dǎo)，Innis等人，學(xué)術(shù)出版社，1990所述的方案來(lái)標(biāo)記它們，該文獻(xiàn)引入本文作為參考。
在引入本文作為參考的美國(guó)專(zhuān)利4,914,210中敘述了通常在5’末端的寡核苷酸報(bào)道分子序列中摻入具有一個(gè)或幾個(gè)硫氫基，氨基或羥基成分的寡核苷酸官能化試劑的方法。例如，5’磷酸基團(tuán)可以作為放射性同位素利用多核苷酸激酶和[γ32P]摻入，以便提供報(bào)道分子基團(tuán)。可以通過(guò)使在合成過(guò)程中導(dǎo)入的氨基胸苷殘基與抗生物素的羥基琥珀酰亞胺酯反應(yīng)，在5’末端加入生物素。
在3’末端的標(biāo)記例如可以利用多核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶加入需要的成分，如蛹蟲(chóng)草菌素，35S-dATP和生物素dUTP。
寡核苷酸衍生物也可以作為標(biāo)記獲得。例如，Etheno-dA和etheno-A是已知可以摻入報(bào)道分子的熒光腺嘌呤核苷酸。同樣，etheno-dC是可以在報(bào)道分子合成中利用的另一個(gè)類(lèi)似物。含有這樣的核苷酸衍生物的報(bào)道分子可以水解以便在PCR過(guò)程中核酸聚合酶延伸引物時(shí)通過(guò)聚合酶5’到3’核酸活性釋放更強(qiáng)的熒光單核苷酸。
在一些實(shí)施方案中，已標(biāo)記的報(bào)道分子含有第一和第二標(biāo)記，其中通過(guò)核酸酶敏感的裂解位點(diǎn)從第二標(biāo)記分離第一標(biāo)記。
報(bào)道分子的標(biāo)記可以在報(bào)道分子的任何適當(dāng)?shù)奈恢脕?lái)定位。例如，當(dāng)報(bào)道分子具有一個(gè)以上核苷酸時(shí)，該標(biāo)記可以附著于報(bào)道分子序列的任何適當(dāng)?shù)暮塑账?。?biāo)記可以定位于報(bào)道分子的5’末端，并且通過(guò)非互補(bǔ)序列從與靶核酸互補(bǔ)的報(bào)道分子的序列分離。在這一實(shí)施方案中，報(bào)道分子具有與擴(kuò)增產(chǎn)物的非天然堿基互補(bǔ)的非天然堿基，和與第二引物的第二區(qū)不互補(bǔ)的序列，該標(biāo)記定位于與第二區(qū)非互補(bǔ)的序列中。另外，標(biāo)記可以利用適當(dāng)?shù)拈g隔基或化學(xué)接頭間接地附著于報(bào)道分子的核苷酸。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，已標(biāo)記的報(bào)道分子具有有效地定位于報(bào)道分子或在報(bào)道分子和測(cè)試的第二個(gè)成分(如第二個(gè)寡核苷酸)上的相互作用的信號(hào)產(chǎn)生標(biāo)記以致當(dāng)相互作用的信號(hào)產(chǎn)生標(biāo)記是足夠相互靠近時(shí)淬滅可檢測(cè)信號(hào)的產(chǎn)生。優(yōu)選地，這些標(biāo)記是通過(guò)在對(duì)核苷酸裂解敏感的報(bào)道分子內(nèi)的一個(gè)位點(diǎn)分離的，從而允許核酸聚合酶的5’到3’核酸酶活性通過(guò)在核酸酶敏感位點(diǎn)裂解報(bào)道分子，從第二個(gè)相互作用的信號(hào)產(chǎn)生標(biāo)記分離第一個(gè)相互作用的信號(hào)產(chǎn)生標(biāo)記。相互作用的信號(hào)產(chǎn)生成分的分離(例如，裂解報(bào)道分子，釋放含有一個(gè)標(biāo)記的報(bào)道分子片段)導(dǎo)致可檢測(cè)信號(hào)的產(chǎn)生。這樣的標(biāo)記的例子包括染料/淬滅劑對(duì)或兩個(gè)染料對(duì)(其中一個(gè)染料的發(fā)射刺激了第二個(gè)染料的發(fā)射)。
在例舉的實(shí)施方案中，相互作用的信號(hào)產(chǎn)生對(duì)具有熒光團(tuán)，例如熒光素，5-[(2-氨基乙基)氨基]萘-1-硫酸(EDANS)，四甲基羅丹明，等等，和可以淬滅熒光團(tuán)的熒光發(fā)射的淬滅劑，例如二甲基氨基偶氮苯氨基exal-3-acrinido(Dabcyl)。普通技術(shù)人員可以選擇將淬滅特定的熒光團(tuán)的發(fā)射的適當(dāng)?shù)拇銣鐒┏煞?。在列舉的實(shí)施方案中，Dabcyl淬滅劑吸收從熒光團(tuán)成分發(fā)射的熒光。熒光淬滅劑對(duì)已經(jīng)在Morrison，在非同位素探測(cè)，印跡和測(cè)序中能量轉(zhuǎn)移和熒光淬滅的檢測(cè)，學(xué)術(shù)出版社，1995，引入本文作為參考的文獻(xiàn)中有敘述。
或者，這些相互作用的信號(hào)產(chǎn)生標(biāo)記可以用于檢測(cè)方法中，其中第二引物的第二區(qū)至少具有一個(gè)非天然堿基和一個(gè)標(biāo)記。該對(duì)的第二標(biāo)記是通過(guò)報(bào)道分子提供的，其中至少具有與第二引物的非天然堿基互補(bǔ)的一個(gè)非天然堿基和第二個(gè)標(biāo)記。在附圖6中說(shuō)明了這一實(shí)施方案。例如，如果利用了染料/淬滅劑，報(bào)道分子與擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交或擴(kuò)增產(chǎn)物的摻入將導(dǎo)致熒光素的減少。
或者，可以利用熒光素共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)或熒光素極化檢測(cè)兩個(gè)標(biāo)記的鄰近性。FRET是兩個(gè)染料分子的電子激發(fā)狀態(tài)之間的依賴(lài)距離的相互作用，其中將激發(fā)從供體分子轉(zhuǎn)移到受體分子而不發(fā)射光子。FRET的供體/受體染料對(duì)的例子是熒光素/四甲基羅丹明，IAEDANSTM/熒光素(分子探針，Eugene，OR)，EDANSTM/Dabcyl，熒光素/熒光素(分子探針，Eugene，OR)，BODIPYTMFL/BODIPYTMFL(分子探針，Eugene，OR)，和熒光素/QSY7TM。
退火在檢測(cè)方法過(guò)程中，在樣品中，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間內(nèi)加入報(bào)道分子。在附圖1所述的實(shí)施方案中，在PCR產(chǎn)生了足夠的擴(kuò)增產(chǎn)物120后，將報(bào)道分子126與擴(kuò)增產(chǎn)物120的單鏈區(qū)124退火。在這一所述的實(shí)施方案中，報(bào)道分子126含有染料128，淬滅劑132，和與第二引物108的非天然堿基114互補(bǔ)的非天然堿基130。報(bào)道分子126與對(duì)應(yīng)于第二引物108的第二區(qū)112的序列退火。報(bào)道分子126可以在PCR已經(jīng)產(chǎn)生足夠的擴(kuò)增產(chǎn)物120后加入反應(yīng)混合物，或者可以在PCR擴(kuò)增之前，在反應(yīng)混合物中加入報(bào)道分子126。優(yōu)選在PCR擴(kuò)增之前在反應(yīng)混合物中加入報(bào)道分子126。在擴(kuò)增后，溫度優(yōu)選地降低到低于報(bào)道分子/擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度的一個(gè)溫度，以允許將報(bào)道分子與擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈區(qū)退火。在一個(gè)實(shí)施方案中，在將報(bào)道分子與單鏈突出區(qū)退火的步驟中，反應(yīng)溫度降低至約49℃或更低。退火的進(jìn)行相似于本發(fā)明的其他實(shí)施方案，包括利用如上所述的其他報(bào)道分子和其他類(lèi)型標(biāo)記的實(shí)施方案。在另一個(gè)實(shí)施方案中，報(bào)道分子126在第一和第二引物106，108和擴(kuò)增產(chǎn)物120的解鏈溫度或該溫度以上退火。當(dāng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的“實(shí)時(shí)”檢測(cè)時(shí)，這一實(shí)施方案是特別有用。
裂解在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在報(bào)道分子與擴(kuò)增產(chǎn)物退火后，裂解事件發(fā)生，至少釋放了一個(gè)報(bào)道分子片段。報(bào)道分子片段的釋放是與如上所述的靶核酸的存在相關(guān)的。一旦報(bào)道分子與擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈區(qū)退火，形成了通過(guò)裂解復(fù)合物釋放報(bào)道分子片段的酶可識(shí)別的報(bào)道分子/擴(kuò)增產(chǎn)物復(fù)合物。用于本實(shí)施方案中的酶通常能夠識(shí)別各種報(bào)道分子/擴(kuò)增產(chǎn)物復(fù)合物結(jié)構(gòu)。例如，報(bào)道分子126的5’末端部分可以與擴(kuò)增產(chǎn)物的序列交迭，形成單鏈突出區(qū)160(參見(jiàn)附圖1D)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，報(bào)道分子126不含有交迭區(qū)形成單鏈突出區(qū)，而當(dāng)它與擴(kuò)增產(chǎn)物退火時(shí)報(bào)道分子形成切口樣結(jié)構(gòu)(參見(jiàn)附圖5)。在這一實(shí)施方案中，在擴(kuò)增產(chǎn)物中形成切口樣結(jié)構(gòu)，如附圖5D所示。通常，在雙鏈DNA中的一個(gè)“切口”是在一個(gè)鏈的兩個(gè)鄰接的核苷酸之間缺乏磷酸二酯鍵。如本文所用，當(dāng)在報(bào)道分子126的5’末端核苷酸和擴(kuò)增產(chǎn)物的鏈100a的3’末端核苷酸之間缺乏磷酸二酯鍵時(shí)，形成了“切口樣”結(jié)構(gòu)。有幾個(gè)酶如大腸桿菌DNA聚合酶I，能夠在雙鏈DNA中利用切口作為起始點(diǎn)，從中雙鏈的一個(gè)鏈可以降解，并且通過(guò)新材料的再合成來(lái)取代。
在這一實(shí)施方案中，報(bào)道分子210包括與擴(kuò)增產(chǎn)物的非天然堿基114互補(bǔ)的非天然堿基216，染料212，和淬滅劑214。報(bào)道分子210與擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈部分退火。所以，在非天然堿基216和擴(kuò)增產(chǎn)物的鄰接的核苷酸之間產(chǎn)生了一個(gè)切口。在這一實(shí)施方案中，聚合酶識(shí)別了在報(bào)道分子/擴(kuò)增產(chǎn)物復(fù)合物中形成的切口樣結(jié)構(gòu)，并且在那個(gè)切口位點(diǎn)裂解報(bào)道分子。復(fù)合物的裂解釋放了報(bào)道分子片段134，并且檢測(cè)了信號(hào)。
盡管報(bào)道分子/擴(kuò)增產(chǎn)物復(fù)合物形成的一些特定的結(jié)構(gòu)將以一些細(xì)節(jié)討論，其他報(bào)道分子/擴(kuò)增產(chǎn)物復(fù)合物可以形成并達(dá)到如上所述的裂解。
參考附圖1D所述的實(shí)施方案，在退火后報(bào)道分子126的5’末端160的部分是不與靶退火的，并且是單鏈。應(yīng)該理解，假如保持了聚合酶的5’到3’核酸酶活性從擴(kuò)增產(chǎn)物裂解退火的報(bào)道片段的能力，單鏈突出區(qū)160的堿基可以是任何長(zhǎng)度。對(duì)于在附圖1D中舉例的實(shí)施方案中的檢測(cè)，反應(yīng)是在足夠允許聚合酶的5’到3’核酸酶活性裂解退火的報(bào)道分子126的條件下繼續(xù)的。報(bào)道分子126的裂解產(chǎn)生了然后可以檢測(cè)(或者，余下的報(bào)道分子/擴(kuò)增產(chǎn)物復(fù)合物可以檢測(cè))的裂解片段134，并且該片段是樣品中靶核苷酸的存在的指示。在至少一些實(shí)施方案中，報(bào)道分子片段可以包括單，雙和更大的核苷酸片段的混合物。
聚合酶的核酸酶活性裂解單鏈區(qū)160，釋放報(bào)道分子片段134，如附圖1E所示。在這一實(shí)施方案中，報(bào)道分子片段含有染料128。來(lái)自包括淬滅劑132的擴(kuò)增產(chǎn)物的染料128的釋放允許檢測(cè)染料。所以，報(bào)道分子片段的釋放允許在染料從淬滅劑的附近釋放時(shí)檢測(cè)染料。這依次允許將報(bào)道分子片段與靶核酸的存在相聯(lián)系?；蛘?，染料和淬滅劑的放置是可以逆轉(zhuǎn)的，并且淬滅劑是用報(bào)道分子片段釋放的，然后檢測(cè)報(bào)道分子/擴(kuò)增產(chǎn)物上的染料。
摻入現(xiàn)在參考附圖2，表示了本發(fā)明的或選的實(shí)施方案。在這一實(shí)施方案中，第二引物的第二區(qū)124含有非天然堿基124。與非天然堿基124互補(bǔ)的非天然堿基152利用適當(dāng)?shù)拿笓饺肓藬U(kuò)增產(chǎn)物。在這一實(shí)施方案中，報(bào)道分子的摻入與樣品中的靶核酸的存在相關(guān)。
如附圖2所示，本發(fā)明的方法利用了報(bào)道分子150；核酸聚合酶(沒(méi)有顯示)；第一引物106和第二引物108。PCR反應(yīng)混合物也含有四個(gè)天然存在的核苷酸三磷酸(即，dATP，dCTP，dGTP，和dTTP)以及作為報(bào)道分子150的一個(gè)或多個(gè)非天然核苷酸三磷酸(或一個(gè)含有非天然核苷酸三磷酸的寡核苷酸)。在所述的實(shí)施方案中，在反應(yīng)混合物中的一個(gè)或多個(gè)非天然核苷酸三磷酸含有一個(gè)標(biāo)記154。PCR可以是Fast-shotTM擴(kuò)增。
第一引物106含有與靶核酸100的一部分互補(bǔ)的序列并且可以與靶核酸100的該部分雜交。第二引物108具有第一區(qū)110和第二區(qū)112。第一區(qū)110含有與靶序列100的一部分互補(bǔ)的序列。第二引物108的第二區(qū)112具有非天然堿基114，這一第二區(qū)112是與靶核酸100不互補(bǔ)的。雖然，在第二區(qū)112中據(jù)敘述只有單個(gè)核苷酸，可以理解第二區(qū)可以包括其他的核苷酸。優(yōu)選地，非天然堿基114是定位于第二引物108的第一區(qū)110和第二區(qū)112之間的連接點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，在第二寡核苷酸引物的第二區(qū)112中存在的非天然堿基114是iso-C或iso-G。
除了第一引物106和第二引物108，樣品與聚合酶接觸(沒(méi)有顯示)，并且進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。如果樣品中存在靶核酸100，第一引物106的互補(bǔ)部分和第二引物108的互補(bǔ)部分110與靶核酸100的對(duì)應(yīng)區(qū)102，104根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的堿基配對(duì)規(guī)則退火。與附圖1所示的實(shí)施方案相似，當(dāng)引物與靶退火時(shí)，第一引物106的3’末端核苷酸可以通過(guò)核苷酸的一個(gè)序列或一個(gè)“空位”，與第二引物108的3’末端核苷酸分隔開(kāi)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)第一和第二引物，使當(dāng)與模板核酸退火時(shí)，PCR引物的3’末端之間存在模板核酸上的約0到約5個(gè)堿基的空位。
如附圖2B和2C所示，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或修飾的Fast-shotTM擴(kuò)增，聚合酶用于合成來(lái)自每個(gè)引物的3’一OH的單鏈120a，120b，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)允許進(jìn)行需要數(shù)目的循環(huán)，以便得到附圖2C所示的擴(kuò)增產(chǎn)物120。
如附圖2C所示，擴(kuò)增產(chǎn)物120包括雙鏈區(qū)122和單鏈區(qū)124。如示，單鏈區(qū)124具有第二引物108的非天然堿基114。雖然，單鏈區(qū)124顯示出包括單個(gè)的非天然堿基，這一區(qū)可以包括一個(gè)以上的非天然堿基。
現(xiàn)在參考附圖2D，然后，擴(kuò)增產(chǎn)物120與報(bào)道分子150接觸。報(bào)道分子150具有一個(gè)標(biāo)記154和非天然堿基152。將報(bào)道分子150在非天然堿基114對(duì)側(cè)摻入擴(kuò)增產(chǎn)物。如附圖2E所示。在一個(gè)實(shí)施方案中，報(bào)道分子150的非天然堿基152具有與擴(kuò)增產(chǎn)物120的單鏈區(qū)124的非天然堿基114互補(bǔ)的核苷酸三磷酸堿基。在這一實(shí)施方案中，PCR反應(yīng)包括存在已標(biāo)記的非天然核苷酸三磷酸堿基，另外還有四個(gè)天然存在的核苷酸三磷酸堿基(即，dATP dCTP，dGTP和dTTP)。在PCR反應(yīng)中的非天然核苷酸三磷酸堿基的濃度可以例如在1μM到100μM的范圍內(nèi)在擴(kuò)增產(chǎn)物120中摻入報(bào)道分子150的適當(dāng)?shù)拿赴ɡ缇酆厦负瓦B接酶。能夠在延伸的引物鏈中摻入天然核苷酸的許多聚合酶也可以在擴(kuò)增產(chǎn)物中互補(bǔ)的非天然堿基對(duì)側(cè)摻入非天然堿基。通常，A類(lèi)DNA聚合酶；如Klenow，Tfl，TthTaq，HotTub，和Bst能夠比B類(lèi)聚合酶；如Pfu，Tli，Vent exo-，T4，和Pwo更好地?fù)饺敕翘烊粔A基。逆轉(zhuǎn)錄酶如HIV-1也可以用于在模板中的互補(bǔ)的非天然堿基相對(duì)的延伸引物中摻入非天然堿基。在這一實(shí)施方案中，聚合酶可以是缺乏核酸酶或具有降低的核酸酶的活性。盡管不打算限制本發(fā)明，核酸酶缺乏的聚合酶可以期望更強(qiáng)，因?yàn)楹怂崦富钚砸呀?jīng)顯示能夠干擾一些PCR反應(yīng)(Gene 1992112(1)29-35，Science1993 260(5109)778-83)。
樣品中靶核酸的存在是通過(guò)聯(lián)系擴(kuò)增產(chǎn)物中報(bào)道分子的存來(lái)確定。適當(dāng)?shù)臋z測(cè)和顯示方法用于檢測(cè)靶核酸。在所述的情況中，例如通過(guò)熒光或其他顯示方法檢測(cè)標(biāo)記154，可以確定靶核酸的存在。熒光極化例如可以用于檢測(cè)在擴(kuò)增產(chǎn)物中報(bào)道分子的摻入。
優(yōu)選地，在這一實(shí)施方案中，在擴(kuò)增產(chǎn)物120中摻入報(bào)道分子150之后和在檢測(cè)之前進(jìn)行洗滌步驟或分離步驟。這一洗滌或分離步驟將除去系統(tǒng)中未結(jié)合的報(bào)道分子150，以致信號(hào)的檢測(cè)取決于摻入的報(bào)道分子。本領(lǐng)域的一個(gè)普通技術(shù)人員將容易地理解任何已知的洗滌或分離步驟可以用于本發(fā)明，包括通過(guò)凝膠電泳等等進(jìn)行大小分離?；蛘?，當(dāng)熒光的極化用作檢測(cè)的方法時(shí)，不需要洗滌步驟。
用于這一實(shí)施方案的報(bào)道分子150至少具有一個(gè)非天然堿基152。報(bào)道分子的非天然堿基優(yōu)選包括標(biāo)記154。報(bào)道分子150的非天然堿基152能夠在PCR擴(kuò)增過(guò)程中由聚合酶摻入擴(kuò)增產(chǎn)物中第二引物108的至少一個(gè)非天然堿基114對(duì)側(cè)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，如附圖6所示，報(bào)道分子170具有與第二個(gè)引物108的非天然堿基114互補(bǔ)的非天然堿基172和淬滅劑129。在這一實(shí)施方案中，第二引物108的非天然堿基114包括染料162。在這一實(shí)施方案中，報(bào)道分子170的摻入將淬滅劑129帶入了染料162附近。這依次減少了染料162的信號(hào)輸出，并且這一信號(hào)的減少是可以檢測(cè)的并與靶核酸的存在相關(guān)。適當(dāng)?shù)娜玖?淬滅劑對(duì)如上討論。或者，可以利用染料-染料對(duì)。當(dāng)存在靶核酸時(shí)，PCR產(chǎn)生了將兩個(gè)染料緊密相鄰的雙鏈產(chǎn)物，并且該標(biāo)記的熒光輸出改變。該變化是可以通過(guò)臺(tái)式熒光平板讀數(shù)器檢測(cè)的。
用于本實(shí)施方案的聚合酶可以具有核酸酶活性，可能已經(jīng)減少了核酸酶活性，或者可以是核酸酶缺乏的。優(yōu)選地，聚合酶是熱穩(wěn)定聚合酶。
檢測(cè)利用本領(lǐng)域已知的任何方法可以完成報(bào)道寡核苷酸片段的檢測(cè)和分析。許多方法可以用于檢測(cè)含有任何上面列出的標(biāo)記的核酸。例如，利用非同位素檢測(cè)方法可以檢測(cè)例如生物素標(biāo)記的寡核苷酸，所述方法利用了抗生物素偶聯(lián)物，如鏈霉抗生物素-堿性磷酸酶偶聯(lián)物。利用熒光素成像儀可以檢測(cè)熒光素標(biāo)記的寡核苷酸。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以在PCR反應(yīng)混合物中檢測(cè)報(bào)道寡核苷酸，而不需要進(jìn)一步的加工。例如，從未裂解的寡核苷酸可以分辨來(lái)自裂解的寡核苷酸的信號(hào)，而不需要物理分離。這可以通過(guò)熒光素極化分析完成，其中可以檢測(cè)大小的變化和在熒光分子的溶液中旋轉(zhuǎn)的速度。
在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)存在靶時(shí)，產(chǎn)生了雙鏈產(chǎn)物，該產(chǎn)物使第一和第二標(biāo)記(例如，染料/染料對(duì))緊密相鄰。當(dāng)兩個(gè)標(biāo)記緊密相鄰時(shí)，報(bào)道分子標(biāo)記的熒光輸出改變。這種變化是可以通過(guò)大多數(shù)臺(tái)式熒光平板讀數(shù)器檢測(cè)的?；蛘?，該標(biāo)記對(duì)含有緊密相鄰的淬滅劑-標(biāo)記對(duì)。在這一實(shí)施方案中，報(bào)道分子標(biāo)記的熒光輸出改變，該變化是可檢測(cè)的。在本發(fā)明中也考慮了其他適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，在進(jìn)一步加工后檢測(cè)報(bào)道分子。同時(shí)認(rèn)為可以利用用于分離寡核苷酸的本領(lǐng)域中已知的許多技術(shù)從反應(yīng)中分離報(bào)道分子寡核苷酸片段。例如，報(bào)道寡核苷酸片段可以通過(guò)固相提取從反應(yīng)混合物中分離。報(bào)道寡核苷酸片段可以通過(guò)電泳或電泳以外的方法來(lái)分離。例如，生物素-標(biāo)記的寡核苷酸可以利用順磁或磁珠，或用抗生物素(或鏈霉抗生物素)包衣的顆粒與反應(yīng)混合物中存在的核酸分離。以這一方法，通過(guò)將復(fù)合物暴露于磁場(chǎng)，從混合物中的其他成分物理地分離生物素化的寡核苷酸/擴(kuò)生物素-磁珠復(fù)合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)質(zhì)譜分析報(bào)道分子寡核苷酸片段。
在一些實(shí)施方案中，當(dāng)進(jìn)行擴(kuò)增和在熱循環(huán)過(guò)程中能夠讀熒光的儀器上檢測(cè)時(shí)，可以區(qū)分非特異的PCR產(chǎn)物與目的PCR產(chǎn)物。當(dāng)模板核酸量有限時(shí)，可以形成目的產(chǎn)物以外的擴(kuò)增產(chǎn)物。這可能是由于引物二聚體的形成，其中第二引物108與本身或第一引物106形成引物二聚體。在引物二聚體形成過(guò)程中，兩個(gè)引物的3’末端雜交并且通過(guò)核酸聚合酶延伸到包含的每個(gè)引物的5’末端。這產(chǎn)生了一個(gè)底物，使得當(dāng)形成的是對(duì)于參與的引物是一個(gè)理想的底物時(shí)，在隨后的擴(kuò)增循環(huán)中以指數(shù)方式產(chǎn)生更多的該非特異產(chǎn)物。所以，引物的二聚體的最初的形成不必需是有利的相互作用，因?yàn)榧词故且粋€(gè)非常稀有的事件，擴(kuò)增過(guò)程可允許二聚體產(chǎn)物進(jìn)行該反應(yīng)，特別是當(dāng)模板核酸有限或缺乏時(shí)。當(dāng)在這一產(chǎn)物中摻入第二寡核苷酸引物106時(shí)，一個(gè)已標(biāo)記的非標(biāo)準(zhǔn)堿基170正交地放置到第二引物106非標(biāo)準(zhǔn)堿基114。這導(dǎo)致了在在報(bào)道分子的標(biāo)記129和第二引物的162之間相互作用，這給出了與如附圖6E中所示的目的產(chǎn)物120的形成相同的熒光輸出變化。引物二聚體產(chǎn)物通常在長(zhǎng)度上比目的產(chǎn)物更短，所以解鏈溫度更低。如附圖6E所示，由于跨雙鏈體的標(biāo)記緊密相鄰，可以分離兩條鏈的事件將擾亂標(biāo)記的相互作用。使含有反應(yīng)產(chǎn)物的反應(yīng)的溫度增加到引物二聚體的雙鏈體DNA和目的產(chǎn)物的Tm之上，將使產(chǎn)物的DNA雙鏈體解鏈并且破壞標(biāo)記的相互作用，產(chǎn)生可測(cè)量的熒光改變。通過(guò)測(cè)量熒光改變，同時(shí)逆漸增加擴(kuò)增和信號(hào)產(chǎn)生后的反應(yīng)溫度，確定目的產(chǎn)物以及非特異產(chǎn)物的Tm是可能的。
嵌套式PCR利用本發(fā)明的方法可以進(jìn)行嵌套式PCR。例如，利用第一，第二和第三引物(或更多)可以進(jìn)行嵌套式PCR。第二引物具有與靶序列互補(bǔ)的第一區(qū)和與報(bào)道寡核苷酸互補(bǔ)的第二區(qū)。第一和第三引物可以在比第二引物更高的溫度下與靶雜交。在進(jìn)行幾個(gè)PCR循環(huán)之后可以產(chǎn)生第一擴(kuò)增產(chǎn)物，其中變性和退火溫度之間的循環(huán)允許第一和第三引物，但不是第二引物與靶核酸退火。PCR退火溫度隨后可以減少到允許第二引物的第一區(qū)與第一擴(kuò)增產(chǎn)物雜交。在降低的退火溫度下的PCR的幾個(gè)循環(huán)可以在第一和第二引物之間產(chǎn)生第二擴(kuò)增產(chǎn)物。該溫度可以降低到允許報(bào)道寡核苷酸與第二引物的第二區(qū)雜交。
在DNA多態(tài)性的檢測(cè)中的用途本發(fā)明的方法可用于在核酸序列中檢測(cè)序列變異。如本文所用，“序列變異”指在兩個(gè)核酸之間的核酸序列的差異。例如，通過(guò)存在一個(gè)或多個(gè)核苷酸的單個(gè)堿基的取代，或缺失或插入，野生型基因和該基因的突變體形式可能有序列的變異。該基因的這兩個(gè)形式據(jù)說(shuō)序列相互不同。序列變異的一個(gè)例子是DNA的多態(tài)性。在附圖7所示的一個(gè)實(shí)施方案中，敘述了利用PCR并且除將PCR反應(yīng)平板放置于熒光平板讀數(shù)器上以外不需要進(jìn)一步的樣品操作而檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)的過(guò)程。利用了含有等位基因特異標(biāo)記的等位基因特異報(bào)道分子或引物。例如，兩個(gè)等位基因系統(tǒng)可以包括帶有具有不同顏色的標(biāo)記的等位基因特異報(bào)道分子或引物。樣品中存在任意一種顏色指示樣品中該等位基因的存在，兩種顏色的組合指示樣品中存在兩種等位基因。
在這一實(shí)施方案中，如下設(shè)計(jì)引物檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性。優(yōu)選地，利用的一個(gè)引物具有等位基因特異引物。優(yōu)選地引物中的一個(gè)具有非天然堿基。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)單個(gè)引物提供了這兩個(gè)特征。或者，等位基因特異引物是一個(gè)與具有非天然堿基的引物不同的引物。
如本文所用，“等位基因特異引物”指在懷疑含有SNP的區(qū)域中與靶核酸完全互補(bǔ)的一個(gè)引物。
設(shè)計(jì)可以用于辨別SNP等位基因的等位基因特異PCR引物使其與每個(gè)等位基因互補(bǔ)，以便使需要的多態(tài)堿基定位于該引物的3’末端。高水平的等位基因辨別部分地是通過(guò)限制聚合酶延伸引物的能力而完成的，該引物在3’末端與靶DNA的3’末端具有一個(gè)核苷酸錯(cuò)配，即引物非特異的對(duì)應(yīng)的等位基因。另外，可以通過(guò)在等位基因特異引物的其他位置放置該錯(cuò)配來(lái)進(jìn)行等位基因的辨別。通常，等位基因特異位置可以是引物內(nèi)的任何地方，前提是只要存在錯(cuò)配聚合酶就不能有效地延伸該引物。優(yōu)選地，選擇引物使等位基因錯(cuò)配足夠使在選定的PCR條件下，等位基因特異引物與不同的等位基因的靶核酸序列的雜交充分去穩(wěn)定。在一個(gè)實(shí)施方案中，等位基因特異位置是從引物的3’末端開(kāi)始的約5個(gè)堿基內(nèi)。例如，等位基因特異位置可以在引物的3’端堿基。引物中的等位基因特異位置的這些交替的位置可以用于以?xún)蓚€(gè)主要方法達(dá)到選擇性擴(kuò)增方法1)通過(guò)降低引物的Tm使其在聚合酶延伸的熱循環(huán)過(guò)程中在模板DNA上不雜交，或方法2)產(chǎn)生聚合酶將不延伸的不利的引物/模板結(jié)構(gòu)。利用Fast-shotTM擴(kuò)增循環(huán)可以達(dá)到增強(qiáng)的特異性，其中延伸的終止時(shí)間以及退火和解鏈的終止時(shí)間縮短或不存在。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，在約90-100℃和約50-65℃之間快速循環(huán)反應(yīng)，在每個(gè)溫度最多保持1秒，從而留給聚合酶少量的時(shí)間延伸錯(cuò)配引物。在舉例的實(shí)施方案中，在約95℃和約58℃之間循環(huán)反應(yīng)，在每個(gè)溫度保持約1秒?？赡芡ㄟ^(guò)生產(chǎn)最短的可能的PCR產(chǎn)物來(lái)進(jìn)行快速循環(huán)，其中通常在PCR引物的3’堿基之間，在模板核酸上留下了約0到約5個(gè)堿基的空位。優(yōu)選地，設(shè)計(jì)引物使其具有最短的序列可能和約55-60℃的Tm。在一個(gè)包括對(duì)基因組DNA樣品進(jìn)行SNP分析的實(shí)施方案中，總共約37個(gè)循環(huán)足夠檢測(cè)少至30個(gè)靶分子。
附圖7中敘述了等位基因特異性測(cè)定方法的一個(gè)例子?？梢哉J(rèn)識(shí)到，本文討論的其他測(cè)定可以用于或經(jīng)修飾而用于等位基因特異測(cè)試。參考附圖7A，懷疑樣品中含有靶核酸100，它包括第一部分102和第二部分104。如附圖所示，靶核酸100是鏈100a和100b組成的雙鏈分子。
參考附圖7B，將樣品與兩個(gè)或更多的等位基因特異第一引物106a，106b和所述的第二引物108接觸。等位基因特異第一引物106a中的一個(gè)是與靶核酸100的第一部分102互補(bǔ)的。其他等位基因特異引物(106b)與靶核酸100的第一部分102不完全互補(bǔ)。第二引物108包括第一區(qū)110和第二區(qū)112，第一區(qū)110具有與靶核酸100的第二部分104互補(bǔ)的一個(gè)序列。第二引物108的第二區(qū)112包括非天然堿基114。第二區(qū)112是與靶核酸100不互補(bǔ)的。
除了第一引物和第二引物，樣品也可以與聚合酶接觸，進(jìn)行如本文所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。如果樣品中存在靶核酸100，等位基因特異第一引物106a的互補(bǔ)部分和第二引物108的互補(bǔ)部分根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)堿基配對(duì)規(guī)則與靶核酸100的對(duì)應(yīng)的區(qū)102和104退火。
如附圖7B所示，利用PCR，或Fast-shotTM擴(kuò)增使用該聚合酶從每個(gè)引物106a，108的3’-OH末端合成單鏈。即，利用等位基因特異第一引物106a合成與靶核酸100的鏈100a的至少一個(gè)部分互補(bǔ)的鏈120a，并且用第二引物108合成與靶核酸100的鏈100b的至少一部分互補(bǔ)的鏈120b。等位基因特異的第一引物106a基本上不延伸，因?yàn)樗c靶核酸100不完全互補(bǔ)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)允許進(jìn)行需要數(shù)目的循環(huán)得到附圖7C所示的擴(kuò)增產(chǎn)物120。然后按附圖1所述進(jìn)行測(cè)定。
試劑盒本發(fā)明的方法中利用的試劑可以包裝成診斷試劑盒。診斷試劑盒包括標(biāo)記的報(bào)道分子，第一引物，和第二引物。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括能夠通過(guò)聚合酶摻入延伸的寡核苷酸中的非天然堿基。在一個(gè)實(shí)施方案中，已標(biāo)記了非天然堿基。如果，寡核苷酸和非天然堿基是未標(biāo)記的，特異性標(biāo)記的試劑也可以包括在試劑盒。試劑盒也可以含有其他適當(dāng)包裝的擴(kuò)增需要的試劑和材料，例如緩沖液，dNTPs，或聚合酶，以及檢測(cè)需要的試劑和材料，例如酶和固相萃取劑。
用于本發(fā)明的方法的試劑可以?xún)?chǔ)存在溶液中或可以?xún)龈?。?dāng)凍干時(shí)，為了在重構(gòu)成時(shí)容易使用，一些或所有試劑可以容易地儲(chǔ)存在微量滴定板的孔中。應(yīng)該注意，本領(lǐng)域已知的任何凍干試劑的方法都將適用于制備用于本發(fā)明的方法的干燥的試劑。
本文引用的所有專(zhuān)利，專(zhuān)利申請(qǐng)，臨時(shí)申請(qǐng)和公開(kāi)物，以全文引入作為參考，引入的程度是它們與本申請(qǐng)闡明的教導(dǎo)不會(huì)不一致。
下面是敘述用于實(shí)施本發(fā)明的方法的實(shí)施例。這些實(shí)施例不應(yīng)該構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。所有的百分?jǐn)?shù)是重量百分?jǐn)?shù)，除非特別說(shuō)明，所有溶劑混合物的比例是體積比。
實(shí)施例1引物設(shè)計(jì)在核酸成分的序列中表示的符號(hào)如下A＝脫氧腺苷酸；T＝脫氧胸苷酸；C＝脫氧胞苷酸；G＝脫氧脫氧鳥(niǎo)苷酸；X＝脫氧-異-胞嘧啶(d-isoC)；Y＝脫氧-異-鳥(niǎo)嘌呤(d-isoG)；P＝與靶核酸中的多態(tài)核苷酸互補(bǔ)的第一引物的核苷酸；B＝通過(guò)在起作用封閉聚合酶的3’末端加入生物素TEG CPG(GlenResearch，Sterling，VA)和延伸報(bào)道分子對(duì)報(bào)道核酸的3’修飾，Q＝信號(hào)淬滅元件(5’-5’[N-4’-羧基-4’(二甲基氨基)-偶氮苯]-氨基己基-3’-丙烯酰亞氨基)-2’-脫氧尿苷(Dabcyl dT；Glen Reserarch，Sterling，VA)，該淬滅元件是通過(guò)加入5’-二甲氧基三苯甲基氧(dimethoxytrityloxy)-5’-[N-4’-羧基-4-(二甲基氨基)-偶氮苯]-氨己基-3’-丙烯酰亞氨基]-2’-脫氧尿苷-3’-[(2’-氰乙基)-(N，N-二異丙基)]-亞磷酰胺(Dabcyl dT；Glen Research，Sterling，VA)而摻入報(bào)道分子；FAM＝信號(hào)產(chǎn)生元件(6-羧基熒光素(6-FAM)；Glen Research，Sterling，VA)。下面劃線的表示的是與模板不互補(bǔ)的核酸成分的部分。
核酸成分的設(shè)計(jì)表示如下
第一引物設(shè)計(jì)成具有約60℃的Tm。第二引物設(shè)計(jì)成具有約61℃的Tm。利用各種已知的技術(shù)包括Peyret等人，生物化學(xué)，38，3468-77(1999)，來(lái)估計(jì)Tm，在此引入本文作為參考。
雜交條件如下
由于Taq聚合酶延伸G錯(cuò)配的趨勢(shì)，在設(shè)計(jì)等位基因特異引物中避免了3’G。
第二引物的第一區(qū)或3’末端是與靶核酸序列的第二區(qū)或下游區(qū)互補(bǔ)的。在靶核酸序列上的第二引物的定位提供了在第一和第二引物的3’末端之間的可以是0到約5個(gè)核苷酸的靶核酸的一個(gè)空位或一個(gè)區(qū)。在合成第二引物中，在引物的第二區(qū)中的異胞苷的摻入是利用標(biāo)準(zhǔn)DNA合成條件進(jìn)行的。
實(shí)施例2等位基因特異PCR在基于熒光的PCR反應(yīng)中利用了如下的核酸成分
如下顯示了PCR反應(yīng)中各成分對(duì)于各個(gè)20μl PCR反應(yīng)體積的工作濃度(1X)
所有成分是在冰上解鏈的，并且溫和地混合在一起。制備10X PCR緩沖液，并且由100mM Tris pH8.0，0.1％BSA，0.1％Triton X-100，1mg/ml已降解的鯡魚(yú)精子DNA(Sigma D-3159)，400mM乙酸鉀，和20mM的MgCl2組成。主混合物和等位基因特異混合物是通過(guò)加入如下比例的試劑制備的
反應(yīng)的最終體積是20μL。將5μL的靶核酸加入15μL的合并的主混合物和第一引物中。靶核酸體積可以根據(jù)最后的使用者的需要通過(guò)調(diào)節(jié)加入主混合物中的水的量來(lái)增加或下降。5μL是用多管移液器遞送的常規(guī)體積。如下所示制備了等位基因特異混合物
如下制備了測(cè)試用的平板15μl等位基因特異混合物(如上定義)等分進(jìn)96孔的測(cè)定平板。(可以制備等位基因特異混合物，制備是為了待用于測(cè)試中的每個(gè)特異的第一引物而進(jìn)行的)。在含有等位基因特異混合物的每個(gè)孔中，以5μl的體積雙倍地加入靶核酸樣品。保留了一定數(shù)目的孔作為對(duì)照；陰性對(duì)照(沒(méi)有靶核酸)應(yīng)該與等位基因特異混合物一起進(jìn)行。在加入了靶核酸后，用20μl礦質(zhì)油覆蓋反應(yīng)，將測(cè)定平板轉(zhuǎn)移到DNA熱循環(huán)器中。這一方法的時(shí)間的控制可以利用多管的移液器來(lái)大量減少。
測(cè)定平板的熱循環(huán)參數(shù)如下
在PCR循環(huán)反應(yīng)后，測(cè)試了測(cè)定平板的熒光信號(hào)發(fā)射。將測(cè)定平板轉(zhuǎn)移到PerSeptive Biosystems CytofluorTM4000熒光平板讀數(shù)器，儀器設(shè)置為從平板的頂端開(kāi)始讀數(shù)。平板讀數(shù)器的參數(shù)如下激發(fā)濾器設(shè)置在485±10nm；發(fā)射濾器設(shè)置在530±12.5nm，PMT放大設(shè)置在50。然后讀樣品。
表1表示了利用等位基因特異引物得到的讀數(shù)。
表1
RFU＝相對(duì)熒光單位實(shí)施例3“Fast-shotTM”擴(kuò)增與SNP檢測(cè)中的標(biāo)準(zhǔn)PCR的比較這一實(shí)施例通過(guò)在三個(gè)數(shù)量級(jí)上改變靶的水平，來(lái)顯示“Fast-shotTM”擴(kuò)增和傳統(tǒng)的PCR循環(huán)參數(shù)之間的等位基因辨別的相對(duì)水平。Fast-shotTM擴(kuò)增包括在引物的變性和退火溫度之間循環(huán)，在這些溫度保持非常短的時(shí)間(例如，1秒)。
下面的核酸成分可以利用
模板核酸濃度是在attomol范圍的。對(duì)于各個(gè)20μL PCR反應(yīng)體積，PCR反應(yīng)中的成分的工作濃度(1X)如下所示。
利用如實(shí)施例2所述的相同方法制備PCR反應(yīng)。對(duì)于“fast-shot”P(pán)CR利用了下面的PCR參數(shù)
對(duì)于傳統(tǒng)的PCR利用了下面的PCR參數(shù)
AmplitaqTMGold是5’-3’外切核酸酶陽(yáng)性Taq聚合酶，AmplitaqTMStoffel是5’-3’外切核酸酶缺乏的Taq聚合酶。
表2中所示的數(shù)據(jù)通過(guò)在三個(gè)數(shù)量級(jí)上改變靶核酸水平，顯示在“Fast-shotTM”擴(kuò)增和傳統(tǒng)PCR循環(huán)參數(shù)之間的等位基因辨別的相對(duì)水平。通過(guò)特異反應(yīng)(C-引物/G-靶，和A-引物/T-靶)和錯(cuò)配反應(yīng)(C-引物/T-靶，和A-引物/G-靶)的帶密度的比較，可以確定等位基因辨別的水平。表2概括了在這些實(shí)驗(yàn)中可以看見(jiàn)的辨別的水平。
表2
如結(jié)果中所示，一些3’錯(cuò)配更容易通過(guò)核酸聚合酶延伸。在這種情況中，在傳統(tǒng)PCR參數(shù)下，通過(guò)含有AmplitaqTMGold的5’-3’外切核酸酶和5’-3’外切核酸酶缺陷的AmplitaqTMStoffel DNA聚合酶C/T錯(cuò)配延伸到比A/G錯(cuò)配更高的程度。通過(guò)利用“Fast-shotTM”擴(kuò)增，利用一個(gè)酶就可以達(dá)到兩個(gè)等位基因之間的1∶1000的辨別水平。
實(shí)施例4PCR和報(bào)道分子退火將下面的核酸用于基于熒光的PCR反應(yīng)
利用了在2μg/ml的鯡魚(yú)精子DNA中的2fM的合成模板對(duì)照，和2mM的MOPS pH7.0。
如下表示了下面的反應(yīng)的反應(yīng)成分
從Perkin Elmer得到AMPLITAQ GOLDTM5U/μl。
解凍試劑，并且溫和地混合，制備兩個(gè)主混合物。一個(gè)主混合物(A)含有第二引物A和報(bào)道分子A。另一主混合物(B)含有第二引物B和報(bào)道分子B。如下所示制備主混合物。
反應(yīng)的最終體積是20μl。在15μl的合并的主混合物和第一引物中加入5μl靶核酸。靶核酸體積可以根據(jù)最后使用者的需要通過(guò)調(diào)節(jié)在主混合物中加入的水的量來(lái)增加或降低。
如下制備了測(cè)定平板在96孔的測(cè)定平板(Low Profile MultiplateTM96孔；MJ Research，MLL-9601)的孔中等分地加入15μl的主混合物。在含有主混合物的孔中，以5μl的體積雙份地加入靶核酸。在一些孔中，5μl水，而不是靶核酸，作為陰性對(duì)照加入。在靶核酸或陰性對(duì)照加入后，用20μl礦物油Mineral Oil覆蓋反應(yīng)(微白色的油，Sigma，M-3516)，并且將測(cè)定平板轉(zhuǎn)移到DNA熱循環(huán)器中。
測(cè)定平板的熱循環(huán)參數(shù)如下所示
作為額外的對(duì)照，一些樣品不進(jìn)行PCR熱循環(huán)。
在PCR循環(huán)反應(yīng)之后，測(cè)試測(cè)定平板中熒光信號(hào)的發(fā)射。將測(cè)定平板轉(zhuǎn)移到PerSeptive Biosystems CytofluorTM4000熒光平板讀數(shù)器，將儀器設(shè)置為從平板的頂部開(kāi)始讀數(shù)。平板讀數(shù)器的參數(shù)如下激發(fā)濾器設(shè)置在485±10nm；發(fā)射濾器設(shè)置在530±12.5nm，PMT放大設(shè)置在50。然后將樣品讀數(shù)。在PCR擴(kuò)增之前，也對(duì)測(cè)定平板的熒光信號(hào)的發(fā)射進(jìn)行測(cè)試作為對(duì)照。
隨后，在10％的天然聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)上跑樣品，接著通過(guò)溴化乙錠染色，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在和證實(shí)從測(cè)定平板中取得的熒光讀數(shù)。
表3顯示了靶核酸模板的熒光檢測(cè)結(jié)果。擴(kuò)增產(chǎn)物也在PAGE之后通過(guò)溴化乙錠染色來(lái)檢測(cè)。在表3中，(-)表示了沒(méi)有，(+)表示了存在模板或進(jìn)行熱循環(huán)。表3中的數(shù)字表示了相對(duì)熒光單位(RFUs)。
如表3所示，幾個(gè)第二引物和報(bào)道分子可以成功地用于檢測(cè)樣品中存在的靶核酸序列的存在。第二引物/報(bào)道分子/在主混合物A中的組合產(chǎn)生了比主混合物B中的第二引物/報(bào)道分子的組合更強(qiáng)烈的信號(hào)。(也將認(rèn)識(shí)到，主混合物A包括了比主混合物B更多的PCR產(chǎn)物，這解釋了信號(hào)強(qiáng)度的一些差別)。信號(hào)強(qiáng)度的差別似乎是在更低的溫度時(shí)更強(qiáng)。但是，主混合物B中的第二引物和報(bào)道分子在所有保持的溫度下產(chǎn)生了高于本底的一個(gè)信號(hào)，所以足夠檢測(cè)和定量靶核酸序列。
PCR產(chǎn)物是通過(guò)PAGE分離的，并且用溴化乙錠染色，或利用MolecularDynamics(Sunnyvale，CA)595 FluoroimagerTM掃描熒光素?zé)晒?。?duì)于主混合物A和主混合物B的反應(yīng)，在對(duì)應(yīng)于含有模板的反應(yīng)的泳道中㈩，在PAGE后通過(guò)溴化乙錠染色檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。在對(duì)應(yīng)于不含有核酸模板的反應(yīng)的泳道中(-)未看到擴(kuò)增產(chǎn)物。這些結(jié)果證明，在上面的測(cè)定中檢測(cè)到的增強(qiáng)的熒光信號(hào)是由于樣品中存在核酸靶序列導(dǎo)致的。
主混合物A的第二引物/報(bào)道分子組合和主混合物B的第二引物/報(bào)道分子組合之間的信號(hào)強(qiáng)度的差異似乎是反應(yīng)過(guò)程中非天然堿基，isoC的降解導(dǎo)致的。非天然堿基，isoC趨向于在含有親核物質(zhì)的溶液，如含有Tris緩沖液的溶液中，在高溫下降解。但是，上面出現(xiàn)的結(jié)果確實(shí)顯示，isoC是適于在高溫下，在Tris緩沖液中使用的。
為了使本發(fā)明的方法的效率最佳化，當(dāng)利用非天然堿基，isoC時(shí)，應(yīng)該利用不需要熱起始激活的聚合酶和非親核性質(zhì)的緩沖液。
實(shí)施例5
制備干燥平板為了方便儲(chǔ)存和容易使用，可以干燥本發(fā)明的方法中需要的一些或所有試劑。例如，反應(yīng)可以設(shè)置成含有40mM乙酸鉀，20mM MgCl2，50μM的dNTP(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)，1單位/反應(yīng)的AMPLITAQ GOLDTM聚合酶，如下所述的糖，和8μM的報(bào)道分子的主混合物。然后，可以將主混合物等分96孔微量滴定板的孔中，并且在SPEEDVACTM(Savant儀器，Holbrook，New York)中干燥45-50分鐘(不加熱)。在干燥后，可以用MICROSEAL ATM(Trocken德國(guó))薄膜覆蓋平板，放置于帶有IDESIPAKTM(Trocken，德國(guó))的真空袋中，可以用氬氣填充該袋，用FOOD SAVERTTM(Tilia，舊金山，CA)封口?？梢岳酶鞣N濃度(1重量％，2重量％，5重量％，和10重量％)的各種糖(甘露糖，棉子糖，蔗糖和海藻糖(Sigma，St.Louis，MO))。
可以在含有核酸靶，第一引物，第二引物，或者報(bào)道分子的水中重構(gòu)反應(yīng)混合物。然后，可以將反應(yīng)混合物進(jìn)行PCR。
在這一方法中，可以容易地重構(gòu)干燥的試劑，并且成功地PCR用于測(cè)試。這樣的凍干試劑可以?xún)?chǔ)存在室溫下一個(gè)較長(zhǎng)的時(shí)期?？梢愿稍镆恍┗蛩性噭?。本發(fā)明的給定方法中需要的一些或所有凍干試劑可以?xún)?chǔ)存在微量滴定板的孔中，在重構(gòu)后使用。
實(shí)施例6包括PCR摻入非天然堿基的測(cè)定下面的實(shí)施例說(shuō)明了通過(guò)淬滅第二引物上的標(biāo)記的信號(hào)監(jiān)測(cè)PCR產(chǎn)物積累的方法，該方法包括在第二引物的標(biāo)記附近的一個(gè)位置在DNA雙鏈體中位點(diǎn)特異地?fù)饺?SSI)核苷酸三磷酸已標(biāo)記的核苷酸三磷酸是在PCR延伸過(guò)程中摻入到延長(zhǎng)的第一引物中的。在標(biāo)記的核苷酸三磷酸上的標(biāo)記能夠淬滅第二引物上的標(biāo)記?；蛘撸诘诙锏臉?biāo)記(供體染料)和報(bào)道分子的標(biāo)記(受體染料)之間可以觀察到熒光能量轉(zhuǎn)移(FRET)。通過(guò)激發(fā)供體染料和讀出摻入的受體染料的發(fā)射可以觀察到PCR產(chǎn)物的檢測(cè)。
下面核酸成分用于PCR反應(yīng)
“c3”表示的是在第一引物的合成過(guò)程中，化學(xué)地裝配的取代核苷酸的丙基間隔基。用于第一引物的合成中的亞磷酰胺是3-O-二甲基三苯甲基-丙基-1-[2-氰乙基]-(N，N-二異丙基)]-亞磷酰胺(間隔基亞磷酰胺C3；Glen Research，Sterling，VA)。任選地，含有相同核苷酸序列，包括核苷酸修飾，但沒(méi)有丙基間隔基的寡核苷酸可以用作PCR反應(yīng)中的第一引物的替代物。
在這些系統(tǒng)的設(shè)計(jì)中，優(yōu)選地，已標(biāo)記的核苷酸三磷酸與靠近第二引物A或B的標(biāo)記的堿基互補(bǔ)。當(dāng)利用被標(biāo)記的天然存在的核苷酸堿基時(shí)，只可能在有限的情況中在第二引物A或B的標(biāo)記附近摻入這樣一個(gè)互補(bǔ)堿基。這是因?yàn)樗兴姆N天然存在的核苷酸堿基似乎是都摻入在其他的位點(diǎn)。利用已標(biāo)記的非天然堿基，如已標(biāo)記的isoG和isoC，已標(biāo)記的非天然堿基將僅摻入互補(bǔ)的非天然堿基對(duì)側(cè)，它可以位于第二引物A或B的標(biāo)記的附近。
利用已標(biāo)記的非天然堿基和天然存在的核苷酸三磷酸的系統(tǒng)在測(cè)定中利用了標(biāo)記淬滅劑染料(QSY7TM)的天然存在的核苷酸(dTTP)，以檢測(cè)或定量樣品中存在的靶核酸(模板)的量。在這一實(shí)施例中，在第二引物A的標(biāo)記(FAM)對(duì)側(cè)和附近的位置，在進(jìn)行PCR延伸的過(guò)程中，將已標(biāo)記的，天然存在的核苷酸摻入第一引物中。在測(cè)定中，也利用了位于淬滅劑染料(QSY7TM)標(biāo)記的非天然堿基，IsoG(dGisoTP)的系統(tǒng)檢測(cè)或定量分析樣品中存在的靶核酸(模板)的量。在這一實(shí)施例中，在第二引物B的標(biāo)記(FAM)附近的isoC(X)對(duì)側(cè)的位置上，在PCR延伸過(guò)程中，在第一引物中摻入已標(biāo)記的，天然存在的核苷酸。下面顯示了QSY7TMdTTP和dGisoTP的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
通過(guò)在PCR中位點(diǎn)特異地?fù)饺雭?lái)進(jìn)行PCR反應(yīng)以證實(shí)熒光淬滅。PCR條件在25μl反應(yīng)體積中有0.2μmol/L第一引物，0.2M二引物A，0.4pM模板核酸，50μM dATP，dGTP和dCTP，10mM Tris pH8，0.1％BSA，0.1％TritonTMX-100，0.1μg/μl已降解的鯡魚(yú)精子DNA，40mM KAc，2mM MgCl2，1個(gè)單位的KlentaqTMDNA聚合酶(Ab)肽，St/Louis，MO)，和0或3.9μM的QSY7TMdTTP。
利用的PCR條件如下。
在CytofluorTM4000熒光平板讀數(shù)器上(485nm激發(fā)波長(zhǎng)/530nm發(fā)射波長(zhǎng))和通過(guò)凝膠電泳分析反應(yīng)的熒光。在70℃，利用6秒的持續(xù)時(shí)間得到準(zhǔn)確的熒光讀數(shù)。結(jié)果表示在表4。
在利用TyphoonTM熒光掃描儀(分子動(dòng)力學(xué)，Sunnyvale，CA)，在10％的天然聚丙烯酰胺凝膠上掃描6FAM以分辨PCR反應(yīng)。在產(chǎn)物帶中含有的相對(duì)熒光單位(RFU)對(duì)于㈩QSY7TMdTTP反應(yīng)是1,325,644，對(duì)于(-)QSY7TMdTTP反應(yīng)是41,462,945。聚丙烯酰胺凝膠也可以用溴化乙錠(在10mM Tris-HCl，1mM EDTA中50μg/ml)染色。對(duì)來(lái)自溴化乙錠染色的產(chǎn)物帶定量發(fā)現(xiàn)，對(duì)于(+)QSY7TMdTTP反應(yīng)是21,993RFU，對(duì)于(-)QSY7TMdTTP反應(yīng)是25,537RFU。
表4顯示了在35個(gè)循環(huán)的PCR之前和之后，在PCR反應(yīng)的孔中的凈RFU讀數(shù)。
表4
這些結(jié)果顯示，當(dāng)在PCR過(guò)程中，將已標(biāo)記的核苷酸三磷酸(QSY7TMdTTP)摻入雙鏈體第二引物的熒光素標(biāo)記(FAM)對(duì)側(cè)時(shí)，熒光強(qiáng)度降低27倍。
在這一實(shí)施例中的核酸成分也用于通過(guò)位點(diǎn)特異摻入(SSI)證明“實(shí)時(shí)”監(jiān)測(cè)PCR產(chǎn)物的積累。
PCR條件如下在15μl的反應(yīng)體積中有0.2μM第一引物，0.2μM的第二引物A，0.33pM的模板，50uM的dATP，dGTP和dCTP，10mM的Tris pH8，0.1％BSA，0.1％TritonX-100，0.1μg/μl已降解的鯡魚(yú)精子DNA，40mM KAc，2mM MgCl2，l單位的KlentaqTMDNA聚合酶(Ab肽，St/Louis，MO)，和0或3μM的QSY7TMdTTP。
PCR條件
(*X＝6，11，16，21，26，31，或36)在CytofluorTM4000的熒光平板讀數(shù)器(PE Biosystems公司，F(xiàn)oster City，CA)上(485nm激發(fā)波長(zhǎng)/530nm發(fā)射波長(zhǎng))和通過(guò)凝膠電泳分析反應(yīng)的熒光。附圖14表示了結(jié)果。
附圖14表示了相對(duì)熒光和PCR循環(huán)數(shù)的關(guān)系。也通過(guò)凝膠電泳(在10％的天然的聚丙烯酰胺凝膠上的5μl)檢測(cè)了含QSY7TMdTTP的反應(yīng)。用溴化乙錠(10mM Tris-HCl，1mM EDTA中50μg/ml)染色凝膠顯示了期望的產(chǎn)物的積累。凝膠分析發(fā)現(xiàn)含有QSY7TMdTTP的反應(yīng)的熒光與PCR產(chǎn)物的出現(xiàn)和積累是一致的。這些結(jié)果也表明，將PCR循環(huán)數(shù)與靶濃度淬滅進(jìn)行關(guān)聯(lián)可以定量樣品中存在的靶的量。例如，存在的靶越多，發(fā)生的淬滅越快。
在70℃持續(xù)6秒可用于在如上所述的實(shí)施例中準(zhǔn)確地測(cè)量熒光。這樣的持續(xù)時(shí)間不是跨越引物之間的空位和跨越該引物摻入的需要堿基數(shù)所必需的。如果不測(cè)量熒光，不需要在70℃持續(xù)時(shí)間。如果獲得熒光讀數(shù)，或任何其他適當(dāng)?shù)臏y(cè)量需要持續(xù)時(shí)間，優(yōu)選地，持續(xù)溫度是第一引物可以有效雜交于靶序列的溫度以上的溫度。在一個(gè)實(shí)施方案中，持續(xù)溫度大于第一引物的解鏈溫度以上10℃。
實(shí)施例7已標(biāo)記的非天然堿基的合成適于本發(fā)明的方法和試劑盒的已標(biāo)記的非天然堿基可以通過(guò)各種方法制成。對(duì)于已標(biāo)記的脫氧異鳥(niǎo)苷5’-三磷酸提供了兩個(gè)合成計(jì)劃方法A表示在附圖1 5，方法A的化合物(化合物1-8，包括8a-8d)表示在A部分；方法B表示在附圖16，方法B的化合物(化合物9-18)表示在B部分。
A部分下面的化學(xué)反應(yīng)中，包括利用方法A合成已標(biāo)記的脫氧異鳥(niǎo)苷5’-三磷酸，SephadexTMDEAE纖維素，Ω氨基丁基瓊脂糖和三丁基焦磷酸銨鹽是從Sigma購(gòu)買(mǎi)的；生物素2-硝基苯酯，6-羧基熒光素N-羥基琥珀酰亞胺酯，和6-羧基四甲基羅丹明N-羥基琥珀酰亞胺酯是從Berry&Associates購(gòu)買(mǎi)的；QSY7TMN-羥基琥珀酰亞胺酯是從Molecular Probes購(gòu)買(mǎi)的；所有其他化學(xué)物是從AldrichChemical公司，或Fisher Chemical公司購(gòu)買(mǎi)的，不需要進(jìn)一步純化就可以使用。在4的分子篩上干燥溶劑。在烘箱干燥的玻璃系統(tǒng)中，在干的氬氣下進(jìn)行反應(yīng)?！罢舭l(fā)”是指用膜泵除去易揮發(fā)的溶劑。用硅凝膠(230-425網(wǎng)格)進(jìn)行柱層析。
6-(6-氨基己基)-氨基-2-氯嘌呤2‘-脫氧-3’，5’-二-甲苯甲酰核苷2在室溫下，向在200ml的DMF中已攪拌40分鐘的六亞甲基二胺的溶液(20當(dāng)量.，100mmol，11.60g)中，加入已溶解于DMF(100ml)的2，6-二氯-2’-脫氧-3’，5’-二-甲苯甲酰核苷(I當(dāng)量.，5mmol，2.705g)。在50℃攪拌溶液2.5小時(shí)，然后，冷卻到室溫，濃縮，萃取殘留物(水/乙酸乙酯)。用水(5×50ml)洗滌有機(jī)層，干燥(Na2SO4)，并且蒸發(fā)溶劑得到泡沫形式的2.673g(4.308mmol，86％)產(chǎn)物2。
6-(6-氨基己基)-氨基-2-氯嘌嶺2’-脫氧核苷3將上面得到的化合物2(4.308mmol，2.673g)溶解于20ml甲醇，在0℃用氨飽和，放置于密封的管中。在80℃加熱1小時(shí)并冷卻到0℃。打開(kāi)管子，在膜泵真空下蒸發(fā)溶劑。用乙醚/己烷處理殘留物3次，在真空中干燥得到的粉末，用于下面的步驟而不進(jìn)一步純化。
6-(6-氨基己基)-氨基-2-苯氧基嘌呤2’-脫氧核苷4將上面得到的粉末(最大量.4.308mmol)溶解于DMF(15ml)，加入NaH(12當(dāng)量.，51.69mmol，2.068g礦物油中60％的分散體)的苯甲醇(43ml)溶液。在100℃攪拌2時(shí)，冷卻到室溫。然后，加入乙酸(12當(dāng)量.)中和反應(yīng)混合物。在CeliteTM過(guò)濾得到的溶液，蒸發(fā)過(guò)濾物，得到的殘留物可以在下面的步驟中利用，而不需要進(jìn)一步的純化。
6-(6-三氟乙?；０被夯?-氨基-2-苯氧基嘌呤2’-脫氧核苷5在甲醇(30ml)/三氟乙酸乙酯(30ml)的混合物中溶解上面得到的產(chǎn)物，在室溫下攪拌24小時(shí)。通過(guò)蒸發(fā)除去溶劑和過(guò)量的三氟乙酸乙酯，通過(guò)柱層析，用氯仿中1.5％的甲醇然后氯仿中17.5％甲醇的一步梯度純化殘留物。產(chǎn)量626mg(3步1.134mmol，26％)。
6-(6-三氟乙?；０被夯?-氨基-3-苯氧基嘌呤2’-脫氧核苷5’-三磷酸6在0.5ml的乙腈/4.5當(dāng)量三乙胺(0.585mmol，0.081ml)的混合物中溶解1，2，4-三唑(4.5當(dāng)量，0.585mmol，40mg)，將燒瓶放置于冰浴上。加入磷氧氯(1.5當(dāng)量，0.195mmol，0.018ml)，在室溫下攪拌30分鐘。過(guò)濾，用最小量的乙腈洗滌固體，將過(guò)濾物加入化合物5(1當(dāng)量，0.13mmol，72mg)。在室溫下攪拌30分鐘，然后，加入DMF(2ml)中的三丁基焦磷酸銨(89mg)溶液，連續(xù)攪拌19小時(shí)。然后，加入水(1ml)水解其余的三唑基團(tuán)。在攪拌30分鐘后，在真空中，30℃濃縮反應(yīng)混合物，并且在DEAE纖維素上用0.05M-0.5M TEAB緩沖液的梯度柱層析純化。產(chǎn)物在0.4-0.5M的緩沖液濃度洗脫。在30℃蒸發(fā)含有該產(chǎn)物的級(jí)分，并且進(jìn)一步利用。
N6-(6--氨基己基)-2’-脫氧異鳥(niǎo)苷5’-三磷酸7用甲醇蒸發(fā)上面得到的化合物，并且溶解于甲醇中(5ml)。加入Pd/C(10重量％，10mg)和HCOONH4(63mg)，在回流下攪拌45分鐘。然后，冷卻到室溫，過(guò)濾除去催化劑，用熱水洗滌催化劑(60℃，3ml)，在真空中合并濃縮的過(guò)濾物。在28％的氫氧化銨水溶液(3ml)中溶解殘留物，在室溫下攪拌3小時(shí)，在真空中濃縮，用0.05M-0.5M TEAB緩沖液的梯度，在DEAE纖維素上柱層析純化。產(chǎn)物在0.3-0.4M的緩沖液濃度洗脫。蒸發(fā)含有產(chǎn)物的部分，進(jìn)一步使用。
N6-(6-Tamra-酰胺基己基)-2’-脫氧異鳥(niǎo)苷5’-三磷酸8a在0.2ml 0.1M的TEAB緩沖液中溶解化合物7(約1mg它的三乙銨鹽形式)，加入溶解于DMF(0.2ml)的6-羧基四甲基羅丹明N-羥基琥珀酰亞胺酯(10mg)。在35℃攪拌3小時(shí)，然后加入Ω-氨基丁基瓊脂糖，以結(jié)合過(guò)量的TamraTM，再攪拌一小時(shí)，將反應(yīng)混合物加載到DEAE纖維素柱上，用0.05M-0.5M TEAB緩沖液洗脫。產(chǎn)物在0.4M的緩沖液濃度洗脫。在30℃蒸發(fā)含有該產(chǎn)物的級(jí)分。
分別利用6-羧基熒光素N-羥基琥珀酰亞胺酯和QSY7TMN-羥基琥珀酰亞胺酯，而不是6-羧基四甲基羅丹明N-羥基琥珀酰亞胺酯，以和化合物8a同樣的方法制備化合物8b和8d。
N6-(6-生物素酰胺基己基)-2’-脫氧異鳥(niǎo)苷5’-三磷酸8c在0.2ml的水中溶解化合物7(約1mg它的三乙銨鹽形式)，加入溶解于DMF(0.2ml)中的生物素2-硝基苯酯(10mg)。溶液表現(xiàn)為淺黃色。在35℃攪拌1小時(shí)，然后加入Ω-氨基丁基瓊脂糖，結(jié)合過(guò)量的生物素，再攪拌1小時(shí)，將反應(yīng)混合物加載到DEAE纖維素柱上，用0.05M-0.5MTEAE緩沖液梯度。產(chǎn)物在0.4M的緩沖液濃度洗脫。在30℃蒸發(fā)含有該產(chǎn)物的級(jí)分。
B部分對(duì)于下面的化學(xué)反應(yīng)，包括利用A方法合成已標(biāo)記的脫氧異鳥(niǎo)苷5’-三磷酸，三丁基焦磷酸銨是從Sigma購(gòu)買(mǎi)的；生物素N羥基琥珀酰亞胺酯是從Pierce化學(xué)公司購(gòu)買(mǎi)的；QSY7TMN-羥基琥珀酰亞胺酯和Dabcyl N-羥基琥珀酰亞胺是從Molecular Probes購(gòu)買(mǎi)的；所有其他化學(xué)品是從Aldrich化學(xué)公司或Fisher化學(xué)公司購(gòu)買(mǎi)的。這些化學(xué)品使用時(shí)不需要進(jìn)一步純化。在4的分子篩上干燥溶劑。在烘箱干燥的玻璃器中，在干的氬氣下進(jìn)行反應(yīng)。用硅凝膠(230-425網(wǎng)格)進(jìn)行柱層析。
下面是所用的縮寫(xiě)Ac2O(乙酸酐)；DMF(N，N-二甲基甲酰胺)；DMAP(4，4’-二甲基氨基吡啶)；DMT(4，4’-二甲氧基三苯甲基)；Et3N(三乙胺)；MeCN(乙腈)；MeOH(甲醇)；Tol(p-甲苯甲酰基)。
1-(p，p’-二甲氧基三苯甲基)-六亞甲基二胺(9)用吡啶共蒸發(fā)六亞甲基二胺(10當(dāng)量.，375mmol，43.5g)兩次，溶解于100ml的吡啶中。加入DMAP(0.1當(dāng)量，3.75mmol，457mg)，將反應(yīng)燒瓶放置于冰浴上。在2小時(shí)中逐滴加入溶解于100ml的吡啶中的DMT氯化物(1當(dāng)量.，37.5mmol，12.69g)。在室溫?cái)嚢?個(gè)時(shí)，加入MeOH(5ml)，濃縮反應(yīng)混合物，用NaHCO3/乙酸乙酯萃取剩余的殘留物。用NaHCO3水溶液洗滌有機(jī)層兩次，干燥和蒸發(fā)溶劑。在下面的步驟中利用得到的產(chǎn)物，不需要進(jìn)一步純化。
產(chǎn)量14.895g(35.634mmol，95％)粘稠油。
2-氯-6-(6-p，p’-二甲氧基三苯甲基氨基己基)-氨基嘌呤-2’-脫氧-3’5’-二甲基苯基核苷(10)用DMF共蒸發(fā)化合物9(1.3當(dāng)量.，31.916mmol，13.34g)，溶解于100ml的DMF中。加入溶解于100ml的DMF的二異丙基乙胺(3.9當(dāng)量.，95.748mmol，16.65ml)，在室溫下攪拌3小時(shí)。濃縮，用NaHCO3/乙酸乙酯水溶液萃取殘留物，干燥有機(jī)層，蒸發(fā)溶劑。用醚研磨殘留物兩次，在真空中干燥后可進(jìn)一步利用得到的固體產(chǎn)物而不需要進(jìn)一步純化。
2-芐氧基-6-(6-p，p’-二甲氧基三苯甲基氨基己基)-氨基嘌呤-2’-脫氧核苷(11)在DMF(25ml)中溶解化合物10(1當(dāng)量，19.23mmol，17.74g)，然后加入到NaH(10當(dāng)量，192.3mmol，7.69g在礦質(zhì)油中的60％的分散體)的苯甲醇(128ml)溶液中。加熱反應(yīng)混合物(120℃，6小時(shí))，然后在CeliteTM上過(guò)濾之前，在室溫下攪拌(15小時(shí))，蒸發(fā)過(guò)濾物，萃取殘留物(乙酸乙酯/水)，洗滌有機(jī)層(NaHCO3-溶液)，干燥，蒸發(fā)溶劑，用醚/己烷1∶10研磨殘留物5次。TLC∶CHCl3/10％MeOH RF＝0.26。
產(chǎn)量10.280g(13.562mmol，70.5％，2步)泡沫。
2-芐氧基-6-(6-p，p’-二甲氧基三苯甲基氨基己基)-氨基嘌呤-2’-脫氧-5’-O-p，p’-二甲氧基三苯甲基核苷(12)用吡啶共蒸發(fā)化合物11(14.7388mmol，11.172g)，溶解于150ml吡啶和加入DMAP(0.25當(dāng)量，3.6847mmol，450mg)。將燒瓶放置于冰浴中，在2小時(shí)中慢慢加入DMTCl(1.5當(dāng)量，22.108mmol，7.484g)。在室溫下攪拌22小時(shí)，然后，加入MeOH(1ml)，濃縮反應(yīng)混合物，萃取殘留物(氯仿/NaHCO3水溶液)。干燥有機(jī)層，蒸發(fā)溶劑，用乙醚/己烷1∶1研磨殘留物，除去過(guò)量的DMT，干燥不溶的固體產(chǎn)物，不再進(jìn)一步純化即使用。
產(chǎn)量14.890g(14.047mmol，95％)微棕色泡沫。
2-芐氧基-6-(6-p，p’-二甲氧基三苯甲基氨基己基)-氨基嘌呤-3’-O-乙?；?2’-脫氧-5’-O-p，p’-二甲氧基三苯甲基核苷(13)用吡啶共蒸發(fā)化合物12(14.047mmol，14.89g)，溶解于200ml的吡啶中，加入DMAP(0.25當(dāng)量，3.5117mmol，428mg)，Et3N(5當(dāng)量，70.235mmol，9.7ml)和Ac2O(2.5當(dāng)量，35.1175mmol，3.582g)。在室溫下攪拌4.5小時(shí)，然后加入MeOH(2ml)，濃縮反應(yīng)混合物，萃取殘留物(乙酸乙酯/NaHCO3水溶液)。干燥有機(jī)層，蒸發(fā)溶劑，用乙酸乙酯/己烷/Et3N 30∶60∶1，然后65∶35∶3的一步梯度柱層析純化殘留物。產(chǎn)量5.93g(5.385mmol，38％)黃色泡沫。
2-芐氧基-6(6-氨基己基)-氨基嘌呤-3’-O-乙酰基-2’-脫氧核苷(14)在50ml的乙腈/2ml的水中溶解化合物13(2.471mmol，2.723g)，加入Ce(NH4)2(NO3)3(0.3當(dāng)量.，0.74mmol，406mg)。回流45分鐘。然后加入0.15當(dāng)量Ce(NH4)2(NO3)3(0.37mmol，205mg)，繼續(xù)回流1小時(shí)。然后，蒸發(fā)，用醚研制殘留物除去DMT，干燥不溶的產(chǎn)物，不再純化，進(jìn)一步使用。
2-芐氧基-6-(6-三氟乙酰氨基己基)-氨基嘌呤-3’-O-乙酰基-2’-脫氧核苷(15)將上面得到的化合物14(最大量5.385mmol)溶解于30ml的MeOH/50ml三氟乙酸乙酯/5ml Et3N中，在室溫下攪拌反應(yīng)混合物21.5小時(shí)。TLC(氯仿/17.5％MeOH)∶RF＝0.72)顯示完全轉(zhuǎn)化。蒸發(fā)，萃取殘留物(鹽水/乙酸乙酯)，干燥有機(jī)層，蒸發(fā)溶劑，用氯仿/1.5％MeOH，然后17.5％MeOH的一步梯度，通過(guò)硅凝膠柱層析純化殘留物。產(chǎn)量2.80g(4.714mmol，87％)泡沫。
2-芐氧基-6-(6-三氟乙酰氨基己基)-氨基嘌呤-3’-O-乙基-5’-三磷酸-2’-脫氧核苷(16)。
將咪唑(61當(dāng)量，306mg，4.5mmol，重結(jié)晶)溶解于乙腈(3.6ml)中，冷卻(0℃)。然后加入POCl3(19當(dāng)量，0.128ml)，和三乙胺(61當(dāng)量.，0.633ml)，在加入一部分(0.309ml)到15(1當(dāng)量，0.074mmol，44mg)之前攪拌混合物(0℃，0.5小時(shí))。在加入含有三丁基焦磷酸銨(2當(dāng)量，0.16mmol，73mg)的DMF(1.5ml)之前攪拌混合物(r.t.，0.5小時(shí))。然后，在24小時(shí)后淬滅反應(yīng)(2ml，10％NH4COO)，并且凍干。利用20％的MeCN和(NH4)2CO3/20％ MeCN的梯度，通過(guò)離子交換層析(DionexProPacTMSAX-10；Dionex，Sunnyvale，CA)純化產(chǎn)物。重復(fù)凍干回收的產(chǎn)物以除去過(guò)量的鹽。產(chǎn)量為0.007mmol(10％)，白色固體。
6-(6-氨己基)-氨基嘌呤-5‘-三磷酸-2‘-脫氧核苷(7)在加入Pd/C(10％，5mg)和NH4COO(0.05mmol，31mg)之前，將化合物16(0.007mmol)溶解于甲醇(2.5ml)中。在過(guò)濾掉催化劑之前回流(1小時(shí))懸浮液，并且蒸發(fā)溶劑。然后，在干燥反應(yīng)物之前，用28％的氫氧化銨(1.5ml，3小時(shí)，室溫)處理殘留物，利用20％的MeCN和(NH4)2CO3/20％ MeCN的梯度，通過(guò)陰離子交換層析(Dionex ProPacTMSAX-10；Dionex，Sunnyvale，CA)純化產(chǎn)物。重復(fù)凍干收集的產(chǎn)物，以除去過(guò)量的鹽。產(chǎn)量為0.0063mmol(90％)，白色固體。
6-(6-生物素酰氨基己基)-氨基嘌呤-5’-三磷酸-2’-脫氧核苷(8c)，6-(6-dabcyl酰氨基自己基)一氨基嘌呤-5’-三磷酸-2’-脫氧核苷(17a)，6-(6-QSY7TM酰氨基己基)-氨基嘌呤-5’-三磷酸-2’-脫氧核苷(17b)。
在7(0.88μmol，三乙銨鹽)的水溶液(40μl)中加入硼酸鈉(10.5μL，1M，pH8.5)，接著加入DMF(216ml)，其中含有生物素N-羥基琥珀酰亞胺酯，dabcylN-羥基琥珀酰亞胺酯，或QSY7TM-N-羥基琥珀酰亞胺酯(2.6μmol，3當(dāng)量)。在用20％的MeCN稀釋之前，進(jìn)行反應(yīng)(3小時(shí)，55℃)，利用20％MeCN和(NH4)2CO3/20％ MeCN梯度，通過(guò)陰離子交換層析(Dionex ProPacTMSAX-10；Dionex，Sunnyvale，CA)純化產(chǎn)物。產(chǎn)率50-80％。
實(shí)施例8通過(guò)位點(diǎn)特異地?fù)饺氪銣鐭晒獾姆菢?biāo)準(zhǔn)脫氧核苷酸三磷酸“實(shí)時(shí)”監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增在PCR反應(yīng)的循環(huán)中進(jìn)行PCR反應(yīng)的熒光的監(jiān)測(cè)。PCR反應(yīng)包括第一和第二引物，第二引物在它的5’末端含有與熒光團(tuán)偶聯(lián)的核苷酸(FAM-dT)。在模板核酸的擴(kuò)增過(guò)程中，與熒光淬滅化合物(Dabcy或QSY7TM)偶聯(lián)的標(biāo)準(zhǔn)核苷三磷酸(反應(yīng)A，dTTP)或isoG核苷三磷酸(反應(yīng)B；dGisoTP)摻入在第二引物的熒光團(tuán)偶聯(lián)核苷酸(FAM-dT)的對(duì)側(cè)和鄰接處，減少了PCR反應(yīng)中的熒光信號(hào)。
在這一實(shí)施例中，在PCR反應(yīng)中利用了下面的核酸
“c3” 表示了在第一引物的合成過(guò)程中，化學(xué)地裝配的代替核苷酸的丙基間隔基。在第一引物的合成中利用的亞磷酰胺是3-O-二甲基三苯甲基-丙基-1-[2-氰乙基]-(N，N-二異丙基)]亞磷酰胺(間隔基亞磷酰胺C3；Glen Research，Sterling，VA)。任選地，含有相同核苷酸序列，包括核苷酸修飾，但沒(méi)有丙基間隔基的寡核苷酸，可以用作PCR反應(yīng)中的第一引物的替代物。
以下成分(基本的PCR反應(yīng)成分)存在于所有PCR反應(yīng)，濃度如下
制備上面表示的成分。
第二引物A，第二引物B，dTTP，Dabcyl dTTP(Glen Research，Sterling，VA)，Dabcyl dGisoTP，和QSY7TMdGisoTP是下面的PCR反應(yīng)中的可變成分。這些成分加入在如下所示的PCR反應(yīng)A到J，濃度如下
反應(yīng)的終體積是25μl。反應(yīng)混合物加載在25μl的Smart Cycler PCR管中(Cepheid Sunnyvale，CA)。在微型離心機(jī)中離心PCR管6秒，使液體進(jìn)入反應(yīng)腔。然后，將進(jìn)行PCR反應(yīng)的管放置于Smart CycleTM(Cepheid，Sunnyvale，CA)，以便能在整個(gè)PCR反應(yīng)過(guò)程中提供恒定的熒光檢測(cè)。
熱循環(huán)參數(shù)
*在循環(huán)2-41的步驟3中，激活了Smart CyclerTM的光學(xué)系統(tǒng)，允許測(cè)定PCR反應(yīng)管中的熒光。
在41個(gè)PCR擴(kuò)增的循環(huán)后，將PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行解鏈曲線分析，方法是在熒光監(jiān)測(cè)光下將PCR管的溫度從60℃增加到95℃，增加的速度是每秒0.2℃。
來(lái)自PCR反應(yīng)A，B和C的PCR反應(yīng)產(chǎn)物的熒光淬滅表示在附圖17A，這些PCR產(chǎn)物的解鏈曲線分析表示在附圖17A。這些結(jié)果證明，PCR反應(yīng)的熒光是在樣品中淬滅的，樣品包括淬滅化合物偶聯(lián)的標(biāo)準(zhǔn)核苷三磷酸或淬滅化合物偶聯(lián)的isoG核苷三磷酸和含有偶聯(lián)熒光的標(biāo)準(zhǔn)核苷的第二引物或含有非標(biāo)準(zhǔn)核苷的第二引物。解鏈曲線的數(shù)據(jù)表明，通過(guò)從結(jié)合淬滅化合物的核酸鏈分離結(jié)合熒光團(tuán)的核酸鏈可以恢復(fù)反應(yīng)產(chǎn)物中的熒光。
附圖18A中表示了來(lái)自PCR反應(yīng)D，E，F(xiàn)和G的PCR反應(yīng)產(chǎn)物的熒光淬滅。附圖18B中表示了來(lái)自PCR反應(yīng)H，I和J的PCR反應(yīng)產(chǎn)物的熒光淬滅。
實(shí)施例9實(shí)時(shí)定量分析基因組DNA在PCR反應(yīng)的循環(huán)和從基因組DNA樣品擴(kuò)增核酸模板的過(guò)程中進(jìn)行PCR反應(yīng)的熒光的監(jiān)測(cè)。PCR反應(yīng)包括含有兩個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸(iso-G和iso-C)的第一和第二引物；將引物設(shè)計(jì)成可以雜交和擴(kuò)增小鼠基因組DNA的一個(gè)區(qū)域。PCR反應(yīng)也包括含有非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸(iso-G)的報(bào)道核酸，與熒光淬滅化合物偶聯(lián)的核苷酸(Dabcyl dT)，和與報(bào)道分子的5’堿基(T)結(jié)合的熒光團(tuán)(6FAM)。報(bào)道分子核酸與擴(kuò)增產(chǎn)物的退火，包括非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸的配對(duì)可以引起通過(guò)核酸聚合酶活性從含有與熒光淬滅化合物偶聯(lián)的核苷酸的報(bào)道核酸裂解熒光團(tuán)。
在這一實(shí)施例中，在PCR反應(yīng)中利用了下面的核酸
從Jackson實(shí)驗(yàn)室(Bar Harbor，ME)得到了小鼠基因組DNA，并且在1mMMOPS pH7.5，0.01mM EDTA中稀釋。對(duì)于模板A，將小鼠株A/J的基因組DNA系列地稀釋到5ng/μl，2.5ng/μl，1.25ng/μl，0.63ng/μl，0.31ng/μl，和0.16ng/μl的濃度。對(duì)于模板B，將小鼠株C57BL/6J的基因組DNA系列地稀釋到20ng/μl，2ng/μl，0.2ng/μl，20pg/μl，2pg/μl，和0.2pg/μl的濃度。將基因組DNA稀釋系列煮沸5分鐘，放置于冰上5分鐘，儲(chǔ)存在-20℃。
合成引物用于PCR擴(kuò)增和檢測(cè)小鼠基因組中的特異靶核酸序列。選擇最初的靶核酸序列，來(lái)評(píng)價(jià)利用A/J小鼠基因組DNA，基因座L11316，染色體3-9.679P(設(shè)計(jì)A)的這一過(guò)程的活力。選擇用于進(jìn)一步的基因組DNA定量的靶序列是小鼠株C57BL/6J，基因座R75378，染色體10-41.5F(設(shè)計(jì)B)。設(shè)計(jì)第一引物A和第一引物B，使它們的Tm在60.0-63.0℃之間。設(shè)計(jì)第二引物A和第二引物B，使其Tm在61.0-63.0℃之間。利用Macintosh的Oligo4.0TM軟件(NationalBiosciences，Minneapolis，MN)評(píng)價(jià)所有的引物二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。
下面的成分(基本的PCR反應(yīng)成分)出現(xiàn)在這一實(shí)施例的所有PCR反應(yīng)中，濃度如下所示。
制備了含有上面列出的成分的主混合物A(第一引物A和第二引物A)，濃度為1.04X，最終反應(yīng)體積是25μl。
制備了含有上面列出的成分的主混合物B具有(第一引物B和第二引物B)，濃度為1.25X，最終反應(yīng)體積為25μl。
通過(guò)在含有24uL的PCR A主混合物的25μl的Smart CyclerTMPCR管中加入1uL的A/J基因組靶DNA的5ng/μl，2.5ng/μl，1.25ng/μl，0.63ng/μl，0.31ng/μl，和0.16ng/μl的稀釋液制備了設(shè)計(jì)A的反應(yīng)混合物。在微型離心機(jī)上旋轉(zhuǎn)離心管6秒，使液體進(jìn)入反應(yīng)腔室。各個(gè)PCR管子含有5ng，2.5ng，1.25ng，630pg，30pg，和160pg A/J基因組靶DNA，對(duì)應(yīng)的核酸靶數(shù)目分別是1500，750，375，188，94和47個(gè)單倍體等同物。
在含有20uL的PCR主混合物B的熱循環(huán)平板的孔中或特異于各個(gè)實(shí)時(shí)熱循環(huán)的管中加入5uL的C57BL/6J基因組靶DNA的20ng/μl，2ng/μl，0.2ng/μl，20pg/μl和2pg/μl的稀釋液制備設(shè)計(jì)B的反應(yīng)混合物。各個(gè)PCR管或孔含有100ng，10ng，1ng，100pg，和10pg的C57BL/6J的基因組靶DNA，對(duì)應(yīng)的核酸靶的數(shù)目分別是30,000個(gè)靶，3,000個(gè)靶，300個(gè)靶，30個(gè)靶和3個(gè)靶。當(dāng)反應(yīng)在微量滴定板中進(jìn)行時(shí)，為了防止蒸發(fā)樣品體積，在熱循環(huán)之前在每個(gè)孔中加入15uL的礦物油覆層。
在Smart CyclerTM中加入設(shè)計(jì)A的反應(yīng)混合物，并在下面的條件下循環(huán)
*在循環(huán)#17-51的步驟2的過(guò)程中，激活了Smart CyclerTM的光學(xué)系統(tǒng)，允許測(cè)定PCR反應(yīng)管中的熒光，產(chǎn)生了動(dòng)力學(xué)圖線。
附圖19表示了這些反應(yīng)的熒光讀數(shù)。
將設(shè)計(jì)B的反應(yīng)混合物單個(gè)放置于下面的實(shí)時(shí)PCR熱循環(huán)儀中1)利用Smart CyclerTM25uL管(Cepheid；Sunnyvale，CA)的SmartCyclerTM(Cepheid；Sunnyvale，CA)2)利用Light CyclTM管(Roche；瑞士巴塞爾)的LightCyclerTM(Roche；瑞士巴塞爾)3)利用96孔微量滴定板(MJ Research Inc.；Waltham，MA)的iCyclerTM(BioRad；Hercules，CA)4)利用MicroAmpTM光學(xué)96孔反應(yīng)平板孔(Applied Biosystemsl；Foster City，CA)的7700(Applied Biosystems；Foster CA)
并且在下面的條件下循環(huán)
在循環(huán)#2-46的步驟3的過(guò)程中，激活實(shí)時(shí)PCR熱循環(huán)器儀的光學(xué)系統(tǒng)以便讀出FAM產(chǎn)生的熒光，允許確定PCR反應(yīng)管中的熒光，產(chǎn)生動(dòng)力學(xué)曲線。
通過(guò)臨界循環(huán)(Ct)和變異關(guān)聯(lián)(Cv)方法分析熒光讀數(shù)。臨界循環(huán)是系統(tǒng)開(kāi)始在對(duì)數(shù)線性階段檢測(cè)與PCR產(chǎn)物指數(shù)生長(zhǎng)相關(guān)的信號(hào)的增長(zhǎng)的時(shí)候。對(duì)數(shù)線性階段的斜率反應(yīng)了擴(kuò)增效率，斜率中的拐點(diǎn)，即對(duì)數(shù)線性期開(kāi)始時(shí)生長(zhǎng)曲線上的點(diǎn)，表示了真實(shí)的擴(kuò)增。這一點(diǎn)也代表沿著生長(zhǎng)曲線的最大的變化速度。核酸的量是與Ct相關(guān)的，其中核酸的起始量越大，Ct值越低。Ct應(yīng)該放置于任何基線活性之上，并且在指數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)。
實(shí)施例10實(shí)時(shí)定量RNA在PCR反應(yīng)的循環(huán)和從RNA樣品擴(kuò)增核酸模板的過(guò)程中進(jìn)行PCR反應(yīng)的熒光的監(jiān)測(cè)。合成DNA引物用于檢測(cè)和定量人β肌動(dòng)蛋白mRNA。cDNA/第一引物與人β肌動(dòng)蛋白mRNA的5’區(qū)上的序列雜交并且利用逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)cDNA的合成。然后利用含有兩個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸(iso-C和iso-G)的cDNA/第一引物和第二引物，使用cDNA作為模板擴(kuò)增人β-肌動(dòng)蛋白序列。PCR反應(yīng)也包括含有非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸(iso-G)的報(bào)道核酸，與熒光淬滅化合物偶聯(lián)的核苷酸(Dabcyl dT)，和與報(bào)道分子的5’堿基(T)偶聯(lián)的熒光團(tuán)(6FAM)。報(bào)道核酸與擴(kuò)增產(chǎn)物的退火，包括非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸的配對(duì)可以導(dǎo)致核酸聚合酶活性從與熒光淬滅化合物偶聯(lián)的報(bào)道核酸裂解熒光團(tuán)。
在這一實(shí)施例中，在逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)中利用了下面的核酸
從Clontech(Palo Alto，CA)得到來(lái)自單個(gè)供體的總的人心臟RNA。
將RNA樣品在5mM Bis-Tris-丙烷pH8.9，0.1mM EDTA，100ng/ml酵母tRNA(Sigma，St.Louis，MO)和100ng/ml的已剪切的鯡魚(yú)精子DNA(Sigma，St.Louis，MO)組成的緩沖液中稀釋到20ng/μl，2ng/μl，200pg/μl，20pg/μl，2pg/μl和0.2pg/μl。
在所有的PCR反應(yīng)中存在下面的成分(基本的PCR反應(yīng)成分)，濃度如下所示
用無(wú)核酸酶的水，將含有表X列出的試劑的RT-PCR主混合物制備成終體積25μl，濃度為1.25X。在25μl的Smart CyclerTMPCR管中的5uL的各個(gè)稀釋的RNA樣品中加入20μl的1.25X的RT-PCR主混合物來(lái)制備RT-PCR反應(yīng)混合物。然后，在微型離心機(jī)中旋轉(zhuǎn)離心管6秒，使液體進(jìn)入反應(yīng)腔室。
在離心后，將反應(yīng)混合物立即放入Smart CyclerTM并且在下面的條件下循環(huán)
*在循環(huán)#3-52的步驟2中，激活實(shí)時(shí)PCR熱循環(huán)器的光學(xué)系統(tǒng)，以讀出產(chǎn)生FAM的熒光，允許測(cè)定PCR反應(yīng)管中的熒光，生成動(dòng)力學(xué)曲線。結(jié)果表示在附圖20。
實(shí)施例11通過(guò)位點(diǎn)特異摻入已標(biāo)記的非標(biāo)準(zhǔn)堿基實(shí)時(shí)定量檢測(cè)RNA在PCR反應(yīng)的循環(huán)過(guò)程中進(jìn)行PCR反應(yīng)的熒光的檢測(cè)，和從RNA樣品擴(kuò)增核酸模板。合成DNA引物用于檢測(cè)和定量分析人β-肌動(dòng)蛋白mRNA。cDNA/第一引物與人β-肌動(dòng)蛋白mRNA的5’區(qū)上的序列雜交，并且利用逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)了cDNA合成。然后，利用cDNA作為模板，將cDNA/第一引物和含有與報(bào)道分子的5’堿基(T)偶聯(lián)的熒光團(tuán)(6FAM)和5’倒數(shù)第二個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸(iso-dC)的第二引物用于人β-肌動(dòng)蛋白序列的擴(kuò)增。在模板核酸的擴(kuò)增過(guò)程中，在PCR反應(yīng)中存在熒光淬滅化合物偶聯(lián)的非標(biāo)準(zhǔn)核苷三磷酸(Dabcyl-d-isoGTP)，并且摻入第二引物的非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸(iso-dC)的對(duì)側(cè)，該核苷酸與熒光團(tuán)偶聯(lián)的5’核苷酸(FAM-dT)鄰接，減弱了PCR反應(yīng)中的熒光信號(hào)。
在這一實(shí)施例中，將下面的核酸用于RT-PCR反應(yīng)中
從Clontech(Palo Alto，CA)得到來(lái)自單一供體的總的人心臟RNA。
在5mM Bis-Tris-丙烷pH8.9，0.1mM EDTA，100ng/ml酵母tRNA(Sigma，St.Louis，MO)和100ng/ml的已剪切的鯡魚(yú)精子DNA組成的緩沖液中將RNA樣品稀釋到20ng/μl，2ng/μl，200pg/μl，20pg/μl，2pg/μl和0.2pg/μl。
下面的成分(基本的PCR反應(yīng)成分)出現(xiàn)在所有的PCR反應(yīng)中，濃度如下所示
利用無(wú)核酸酶的水，將RT-PCR主混合物制備成25uL的最終反應(yīng)體積，濃度為1.25X。在5μl的Smart CyclerTM25μl管(Cepheid，Sunnyvale，CA)中的5μl的各個(gè)稀釋的RNA樣品中加入20uL的1.25X的RT-PCR主混合物以制備RT-PCR反應(yīng)混合物。然后，在微型離心機(jī)中旋轉(zhuǎn)離心管6秒，使液體進(jìn)入反應(yīng)腔室。
在離心后，將反應(yīng)混合物立即放置于Smart CyclerTM(Cepheid，Sunnyvale，CA)中，在下面的條件下循環(huán)
在循環(huán)#23-52的步驟3中，激活Smart CyclerTM的光學(xué)系統(tǒng)，以讀出產(chǎn)生FAM的熒光，允許檢測(cè)PCR反應(yīng)管中的熒光，生成附圖21所示的動(dòng)力學(xué)曲線。
實(shí)施例12多重的等位基因特異PCR進(jìn)行多重的基于熒光的PCR反應(yīng)，測(cè)定來(lái)自各種小鼠株的單核苷酸多態(tài)性小鼠STS序列27.MMHAP25FLA6的序列。在這一實(shí)施例中，多重PCR反應(yīng)包括與靶核酸上的下游非多態(tài)序列雜交的共用第一引物和兩個(gè)上游的第二引物，第二引物A和第二引物B，每個(gè)第二引物特異于等位基因，其中的特異性是通過(guò)不同的3’核苷酸確定的。第二引物A和第二引物B也具有不同的5’區(qū)，這些5’區(qū)對(duì)靶核酸的雜交沒(méi)有作用，但分別允許與報(bào)道分子A和報(bào)道分子B雜交。每個(gè)報(bào)道核酸含有5’倒數(shù)第二個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸和熒光淬滅化合物偶聯(lián)的核苷酸，每個(gè)含有5’核苷酸，該5’核苷酸具有與5’核苷酸偶聯(lián)的不同的熒光團(tuán)(FAM或HEX)。不同的熒光團(tuán)在激發(fā)時(shí)發(fā)射不同波長(zhǎng)的光。報(bào)道核酸與擴(kuò)增產(chǎn)物的退火，包括非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸的配對(duì)可以導(dǎo)致通過(guò)核酸聚合酶活性從淬滅化合物偶聯(lián)的報(bào)道核酸中裂解一個(gè)或多個(gè)熒光團(tuán)。特異于等位基因的核酸靶的優(yōu)勢(shì)導(dǎo)致熒光團(tuán)從裂解的報(bào)道分子發(fā)射特定的熒光。
在這一實(shí)施例中，RT-PCR反應(yīng)中利用了下面的核酸
±＝近交株。**＝F1雜交株從Jackson實(shí)驗(yàn)室(Bar Harbor，ME)購(gòu)買(mǎi)了小鼠gDNA樣品。所有的gDNA樣品在1mM的MOPS pH7.5，0.01mM EDTA中稀釋到2ng/μl。
制備含有上面列出的成分的主混合物，濃度是2X，最終反應(yīng)體積是10uL。將5μl的主混合物等分到測(cè)定平板的各個(gè)孔中，在各個(gè)孔中加入5μl的靶DNA(10ng)。為陽(yáng)性對(duì)照(完全匹配的模板)和陰性對(duì)照(錯(cuò)配的模板或沒(méi)有模板)準(zhǔn)備了PCR反應(yīng)。在加入模板核酸后，用15μl的礦物油覆蓋各個(gè)孔，并且短暫地離心。在進(jìn)行PCR反應(yīng)之前，掃描測(cè)定平板的熒光信號(hào)的強(qiáng)度，在530和580nm處確定基線熒光。
利用了下面的PCR參數(shù)
在PCR循環(huán)反應(yīng)后，測(cè)試測(cè)定平板中的熒光信號(hào)的發(fā)射。將測(cè)定平板轉(zhuǎn)移到CytofluorTM4000熒光平板讀數(shù)器(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)，儀器設(shè)置成從平板的頂部開(kāi)始讀數(shù)。平板讀數(shù)器的參數(shù)如下(6FAM熒光檢測(cè))激發(fā)濾器設(shè)置在485±10nm；發(fā)射濾器設(shè)置在530±12.5nm，PMT放大設(shè)置到50，(HEX熒光檢測(cè))，激發(fā)濾器設(shè)置在530±12.5nm；發(fā)射濾器設(shè)置在580±25nm，PMT放大設(shè)定到50。
實(shí)施例13因子V基因型的多重PCR分析進(jìn)行基于多重?zé)晒獾腜CR反應(yīng)確定人基因組DNA的因子V基因中特異于等位基因的核苷酸變異。用于這一實(shí)施例中的方法是與實(shí)施例12中利用的方法相似的。
通過(guò)自動(dòng)化的DNA合成制備了合成的因子V靶。從Cornell/NIGMS人遺傳細(xì)胞庫(kù)(Camden，NJ)得到了包括因子V靶的人基因組DNA。將所有的gDNA樣品在1mM MOPS pH7.5，0.1mM EDTA中稀釋到1或5ng/μl，煮沸5分鐘，然后，在PCR之前放置于冰上。將合成的靶在1mM Tris pH8.0(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)和0.1μg/ml的鯡魚(yú)精子DNA(St.Louis，MO)中系列稀釋到1或10fM。
制備含有上面列出的成分的主混合物，其最終反應(yīng)體積為10uL，濃度為2X。將5μl的主混合物等分到測(cè)定平板(Low Profile MultiplateTM，96孔；MJResearch，Waltham，MA)的各個(gè)孔中，在各個(gè)孔中加入5μl的靶DNA。在孔中加入5或50zmol(約3000或30,000分子)的突變的，野生型的或雜合的合成靶。在孔中加入5或25ng的雜合的，或野生型的人基因組DNA。將不含有靶DNA的孔用作對(duì)照。在加入模板核酸后，用15μl的礦質(zhì)油覆蓋各個(gè)孔，短暫地離心。在進(jìn)行PCR反應(yīng)之前，掃描測(cè)定平板的熒光信號(hào)的強(qiáng)度，在530nm和580nm處確定基線熒光。
利用了下面的PCR參數(shù)
在PCR循環(huán)反應(yīng)后，測(cè)試測(cè)定平板中熒光信號(hào)的發(fā)射。將測(cè)定平板轉(zhuǎn)移到CytofluorTM4000熒光平板讀數(shù)器(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)，將儀器設(shè)置成從平板的頂部開(kāi)始讀數(shù)。平板讀數(shù)器的參數(shù)如下(6FAM熒光檢測(cè))，激發(fā)濾器設(shè)置在485±10nm；發(fā)射濾器設(shè)置在530±12.5nm，PMT放大設(shè)置到50，(HEX熒光檢測(cè))激發(fā)濾器設(shè)置在530±12.5nm；發(fā)射濾器設(shè)置在580±25nm，PMT放大設(shè)置到50。HEX和FAM熒光的相對(duì)熒光單位(RFU)分別顯示在Y和X軸，結(jié)合進(jìn)行的每個(gè)多重PCR反應(yīng)，表示在附圖22。
實(shí)施例14利用外切核酸酶缺陷的核酸聚合酶和Flap內(nèi)切核酸酶作為裂解劑進(jìn)行多重的實(shí)時(shí)等位基因特異性PCR將來(lái)自各個(gè)小鼠株的基因組DNA的STS序列27.MMHAP25FLA6中的單核苷酸多態(tài)性的序列進(jìn)行多重的基于熒光的PCR反應(yīng)。在這一實(shí)施例中，多重的PCR反應(yīng)包括與靶核酸上的下游的非多態(tài)序列雜交的共用第一引物和兩個(gè)上游的第二引物，第二引物A和第二引物B，每個(gè)第二引物是特異于等位基因的，其中的特異性是通過(guò)不同的3’核苷酸來(lái)確定的。第二引物A和第二引物B也具有不同的5’區(qū)，這些5’區(qū)對(duì)靶核酸的雜交沒(méi)有作用，但分別允許與報(bào)道分子A和報(bào)道分子B雜交。每個(gè)報(bào)道核酸含有5倒數(shù)第二個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸和一個(gè)與熒光淬滅化合物偶聯(lián)的核苷酸，但含有具有與5’核苷酸偶聯(lián)的不同熒光團(tuán)(FAM或HEX)的5’核苷酸。不同的熒光團(tuán)在激發(fā)時(shí)發(fā)射出不同波長(zhǎng)的光。報(bào)道分子核酸與擴(kuò)增產(chǎn)物的退火，包括非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸的配對(duì)可以引起flap內(nèi)切核酸酶-1(FEN-1)酶活性從淬滅化合物偶聯(lián)的報(bào)道核酸裂解一個(gè)或多個(gè)熒光團(tuán)。特異于等位基因的核酸靶的優(yōu)勢(shì)導(dǎo)致熒光團(tuán)從裂解的報(bào)道分子發(fā)射特定的熒光。
在這一實(shí)施例中的RT-PCR反應(yīng)中利用了下面的核酸
±＝近交朱，**＝F1雜交株。
從Jackson實(shí)驗(yàn)室(Bar Harbor，ME)購(gòu)買(mǎi)小鼠gDNA樣品。將所有的gDNA樣品在1mM的MOPS pH7.5，0.01mM EDTA中稀釋到20ng/μl，加熱到95℃ 5分鐘，在冰上快速冷卻。
根據(jù)引入本文作為參考的Hosfield等人，生物化學(xué)雜志(1998)27327154-61所述的稍作修改的方法純化和表達(dá)Mja FEN-1。含有有Mja FEN-1序列的GenBank登記號(hào)是U67585。在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,843,669，和Bult等人，科學(xué)(1996)2731058-1073中敘述了Mja FEN-1，兩個(gè)文獻(xiàn)都引入作為參考。將含有詹氏甲烷球菌FEN-1基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株BL21(DE3)(Novagen，Madison，WI)，加入異丙基硫代吡喃半乳糖苷(Sigma，St.Louis，MO)到終濃度0.4mM，以便在對(duì)數(shù)期誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的過(guò)度表達(dá)。在再生長(zhǎng)2小時(shí)后，以3000Xg沉淀細(xì)胞，再懸浮于緩沖液1(10mM Tris，pH7.5(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)，150mM NaCl(Sigma，St.Louis，MO)，10mM咪唑(Aldrich，Milwaukee，WI))，短暫地超聲波處理，在75℃加熱裂解45分鐘，然后，快速在冰上冷卻到0℃。這一方法裂解了細(xì)胞，沉淀了大部分污染性嗜中溫的天然大腸桿菌蛋白質(zhì)。以25,000Xg離心得到的溶液，用緩沖液1預(yù)平衡的TALONTM金屬親和樹(shù)脂(Clontech，Palo Alto，CA)結(jié)合上清液，加載在重力流柱中，用緩沖液1充分洗滌。然后，用調(diào)節(jié)到含有逐步咪唑梯度100mM，200mM，350mM和500mM的緩沖液1洗脫FEN-1。收集含有FEN-1的級(jí)分，用含有10mM Tris，pH7.5(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)，150mMKCl，和1mM EDTA的緩沖液充分透析。將已透析的物質(zhì)調(diào)節(jié)到50％的甘油(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)，0.5％Tween20(EM Sciences，Gibbstown，NJ)，和0.5％NonidetTMP-40(Roche，Indianapolis，IN)。
制備含有上面列出的成分的主混合物，其濃度為上面的終濃度的1.5倍。將15μl的這些混合物等分到測(cè)定平板的各個(gè)孔中，在各個(gè)孔中加入5μl的靶DNA(100ng)，通過(guò)抽吸混合。制備PCR反應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照(完全匹配的模板)，陰性對(duì)照(錯(cuò)配的模板或沒(méi)有模板)，和雜合的樣品(匹配和錯(cuò)配的模板)。在加入模板核酸后，用20uL的礦質(zhì)油覆蓋每個(gè)孔，短暫地離心。
將測(cè)定平板轉(zhuǎn)移到iCycler iO實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)(BioRad，Hercules，CA)，并且利用上面列出的參數(shù)循環(huán)。用于信號(hào)檢測(cè)的濾器的設(shè)定包括(6FAM)-激發(fā)濾器490±10nm，發(fā)射濾器5301±15nm；(HEX)激發(fā)濾器530±15nm，發(fā)射濾器575±10nm。
利用了下面的PCR參數(shù)
*在循環(huán)#27-42的步驟2中，激活iCycler iOTM實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)的光學(xué)系統(tǒng)，讀出FAM和HEX生成的熒光，允許測(cè)定PCR反應(yīng)管中的熒光，以便生成動(dòng)力學(xué)曲線。結(jié)果表示在附圖23A-B。
實(shí)施例15淬滅熒光的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和淬滅熒光的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈曲線的分析含有被具有淬滅化合物的SSI淬滅的熒光團(tuán)的PCR反應(yīng)產(chǎn)物的解鏈曲線分析可以用于檢測(cè)摻入淬滅劑的引物/二聚體的存在。摻入淬滅劑的引物/二聚體通常在低于摻入淬滅劑的PCR產(chǎn)物的解鏈溫度時(shí)解鏈。如果兩者都是作為PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物存在的，解鏈曲線分析可以顯示熒光在摻入淬滅劑的引物/二聚體和摻入淬滅劑的PCR產(chǎn)物的解鏈點(diǎn)增加。
利用Smart CyclerTM(Ceoheid，Sunnyvale，CA)對(duì)來(lái)自實(shí)施例11的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行解鏈曲線分析。當(dāng)以每秒0.1℃的速度逐步增加PCR反應(yīng)產(chǎn)物的溫度時(shí)，檢測(cè)熒光的變化。目的產(chǎn)物(摻入淬滅劑的PCR產(chǎn)物)以及非特異的產(chǎn)物(摻入淬滅劑的引物/二聚體)的Tm說(shuō)明在附圖25。含有起始量1pg的RNA模板的RT-PCR反應(yīng)的解鏈分析顯示，明顯量的非特異產(chǎn)物的Tm約為71℃，目的產(chǎn)物的Tm約為79℃。含有100ng的RNA模板的反應(yīng)的解鏈分析顯示，只形成了Tm79℃的目的產(chǎn)物。一旦目的產(chǎn)物的Tm已知，可以考慮通過(guò)在非特異產(chǎn)物的Tm以上的溫度進(jìn)行反應(yīng)的熒光測(cè)量，以便特異地觀察目的產(chǎn)物產(chǎn)生的信號(hào)，在目的產(chǎn)物的Tm以下觀察也是有用的。附圖24表示了來(lái)自解鏈曲線分析的結(jié)果。
權(quán)利要求
1.在樣品中檢測(cè)靶核酸的方法，該方法包括a)將樣品與核酸聚合酶、第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物接觸，第一寡核苷酸引物含有與靶核酸的第一部分互補(bǔ)的序列；第二寡核苷酸引物含有第一區(qū)和第二區(qū)，第一區(qū)含有與靶核酸的第二部分互補(bǔ)的序列，第二區(qū)含有一個(gè)非天然堿基；b)如果樣品中存在靶核酸，利用第一和第二寡核苷酸引物通過(guò)PCR擴(kuò)增靶核酸，產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，該產(chǎn)物具有(i)雙鏈區(qū)，和(ii)含有非天然堿基的單鏈區(qū)；c)將樣品與含有一個(gè)標(biāo)記和一個(gè)與單鏈區(qū)的非天然堿基互補(bǔ)的非天然堿基的報(bào)道分子接觸；d)至少將報(bào)道分子的一部分與擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈區(qū)退火；e)在退火后，至少裂解報(bào)道分子的一部分，從而釋放至少一個(gè)報(bào)道分子片段；和f)將至少一個(gè)報(bào)道分子片段的釋放與樣品中靶核酸的存在進(jìn)行關(guān)聯(lián)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中核酸聚合酶具有5’到3’核酸酶活性，并且裂解的步驟包括用核酸聚合酶至少裂解報(bào)道分子的一部分以釋放至少一個(gè)報(bào)道分子片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中核酸聚合酶是耐熱聚合酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中通過(guò)PCR擴(kuò)增靶核酸包括，如果樣品中存在靶核酸，通過(guò)Fast-shotTM擴(kuò)增方法擴(kuò)增靶核酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中如果樣品中存在靶核酸，通過(guò)Fast-shotTM擴(kuò)增方法擴(kuò)增靶核酸，包括將靶核酸和第一和第二寡核苷酸引物在90℃到100℃和約50℃到65℃之間循環(huán)，在每個(gè)溫度約持續(xù)1秒。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將樣品與第一和第二寡核苷酸引物接觸的步驟包括將第一和第二寡核苷酸引物與靶核酸退火，其中當(dāng)與靶核酸退火時(shí)，第一和第二寡核苷酸引物具有在第一和第二寡核苷酸引物的3’末端之間的0到5個(gè)堿基的空位。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中第二寡核苷酸引物第二區(qū)的非天然堿基鄰接于第二寡核苷酸引物的第一區(qū)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中報(bào)道分子具有(i)與單鏈區(qū)的至少一部分互補(bǔ)和具有非天然堿基的第一區(qū)和(ii)鄰接于非天然堿基的第二區(qū)，其中報(bào)道分子的第二區(qū)是與第二核苷酸引物的第一區(qū)不互補(bǔ)的。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中第二寡核苷酸引物的非天然堿基選自異-胞嘧啶和異鳥(niǎo)嘌呤。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中報(bào)道分子的標(biāo)記包含信號(hào)產(chǎn)生元件和信號(hào)淬滅元件，并且裂解的步驟包括至少裂解報(bào)道分子的一部分以釋放至少一個(gè)報(bào)道分子片段，至少一個(gè)報(bào)道分子片段具有信號(hào)產(chǎn)生元件和信號(hào)淬滅元件中的一個(gè)，而不是具有兩者。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中標(biāo)記位于報(bào)道分子的5’末端。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中信號(hào)產(chǎn)生元件包括熒光團(tuán)，信號(hào)淬滅元件包括熒光淬滅劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中報(bào)道分子的標(biāo)記包含信號(hào)產(chǎn)生元件和信號(hào)淬滅元件，并且裂解的步驟包括至少裂解報(bào)道分子的一部分以釋放至少一個(gè)報(bào)道分子片段，至少一個(gè)報(bào)道分子片段具有信號(hào)產(chǎn)生元件和信號(hào)淬滅元件中的一個(gè)，而不是具有兩者。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中報(bào)道分子具有寡核苷酸，并且退火的步驟包括至少將報(bào)道分子的寡核苷酸的一部分與擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈區(qū)退火。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中第二寡核苷酸引物的第二區(qū)至少包含兩個(gè)非天然堿基。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中擴(kuò)增步驟包括，如果樣品中存在靶核酸，利用第一和第二寡核苷酸引物通過(guò)PCR擴(kuò)增靶核酸，產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，其中第二寡核苷酸的非天然堿基基本上阻止了第一寡核苷酸引物的延伸超過(guò)非天然堿基，從而產(chǎn)生了單鏈區(qū)。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中第二寡核苷酸引物的第二區(qū)包含至少兩個(gè)鄰接于第二寡核苷酸引物的第一區(qū)的非天然堿基，并且擴(kuò)增步驟包括，如果樣品中存在靶核酸，利用第一和第二寡核苷酸引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增靶核酸，產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，其中核酸聚合酶在最靠近第一區(qū)的第二寡核苷酸引物的第二區(qū)的非天然堿基的對(duì)側(cè)錯(cuò)誤摻入了一個(gè)核苷酸，但沒(méi)有在次最靠近第二寡核苷酸引物的第一區(qū)的非天然堿基的對(duì)側(cè)摻入核苷酸。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中退火步驟包括將溫度降低，至少使得報(bào)道分子的一部分與擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈區(qū)退火。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中關(guān)聯(lián)步驟包括檢測(cè)至少一個(gè)報(bào)道分子片段。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中關(guān)聯(lián)步驟包括在釋放所述至少一個(gè)報(bào)道分子片段后檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。
21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟a)和c)是在擴(kuò)增靶核酸之前同時(shí)進(jìn)行的。
22.在樣品中檢測(cè)靶核酸的方法，該方法包括a)將樣品與核酸聚合酶、第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物接觸，第一寡核苷酸引物含有與靶核酸的第一部分互補(bǔ)的序列；第二寡核苷酸引物含有第一區(qū)和第二區(qū)，第一區(qū)含有與靶核酸的第二部分互補(bǔ)的序列，第二區(qū)含有一個(gè)非天然堿基；b)如果樣品中存在靶核酸，利用第一和第二寡核苷酸引物通過(guò)PCR擴(kuò)增靶核酸，產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，該產(chǎn)物具有(i)雙鏈區(qū)，和(ii)含有非天然堿基的單鏈區(qū)；c)將樣品與含有一個(gè)標(biāo)記和一個(gè)與單鏈區(qū)的非天然堿基互補(bǔ)的非天然堿基的報(bào)道分子接觸；d)將報(bào)道分子摻入擴(kuò)增產(chǎn)物中單鏈區(qū)的非天然堿基對(duì)側(cè)；和e)將報(bào)道分子的摻入與樣品中的靶核酸的存在相關(guān)聯(lián)。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中將樣品與報(bào)道分子接觸的步驟包括將樣品與具有一個(gè)標(biāo)記和一個(gè)與單鏈區(qū)的非天然堿基互補(bǔ)的非天然堿基的核苷酸三磷酸的報(bào)道分子接觸。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中將樣品與報(bào)道分子接觸的步驟包括將樣品與基本由一個(gè)標(biāo)記和一個(gè)與單鏈區(qū)的非天然堿基互補(bǔ)的非天然堿基的核苷酸三磷酸組成的報(bào)道分子接觸。
25.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中摻入步驟包括利用核酸聚合酶，將報(bào)道分子摻入擴(kuò)增產(chǎn)物中單鏈區(qū)的非天然堿基對(duì)側(cè)。
26.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中摻入步驟包括利用連接酶，將報(bào)道分子摻入擴(kuò)增產(chǎn)物中單鏈區(qū)的非天然堿基對(duì)側(cè)。
27.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中的標(biāo)記包括熒光團(tuán)。
28.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中第二寡核苷酸引物的第二區(qū)進(jìn)一步包含一個(gè)標(biāo)記，并且報(bào)道分子和第二寡核苷酸引物的第二區(qū)的標(biāo)記包括一個(gè)信號(hào)產(chǎn)生/信號(hào)淬滅對(duì)。
29.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中第二寡核苷酸引物的第二區(qū)進(jìn)一步包含一個(gè)標(biāo)記，并且報(bào)道分子和第二寡核苷酸引物的第二區(qū)的標(biāo)記包括一對(duì)熒光團(tuán)，其中一個(gè)熒光團(tuán)的發(fā)射刺激另一個(gè)熒光團(tuán)的發(fā)射。
30.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中第二寡核苷酸引物的第二區(qū)包含至少一個(gè)另外的堿基。
31.一種試劑盒，包括a)核酸聚合酶；b)含有與靶核酸的第一部分互補(bǔ)的序列的第一寡核苷酸引物；c)含有第一區(qū)和第二區(qū)的第二寡核苷酸引物，第一區(qū)含有與靶核酸的第二部分互補(bǔ)的序列，第二區(qū)含有一個(gè)非天然堿基；和d)含有一個(gè)標(biāo)記和一個(gè)與單鏈區(qū)的非天然堿基互補(bǔ)的非天然堿基的報(bào)道分子。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的試劑盒，其中報(bào)道分子包含具有非天然堿基的寡核苷酸。
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的試劑盒，其中的報(bào)道分子不包含除非天然堿基以外的任何堿基。
34.根據(jù)權(quán)利要求31所述的試劑盒，其中第二寡核苷酸引物的第二區(qū)進(jìn)一步包含一個(gè)標(biāo)記，并且報(bào)道分子和第二寡核苷酸引物的第二區(qū)的標(biāo)記包括一對(duì)熒光團(tuán)，其中一個(gè)熒光團(tuán)的發(fā)射刺激另一個(gè)熒光團(tuán)的發(fā)射。
35.根據(jù)權(quán)利要求31所述的試劑盒，其中第二寡核苷酸引物的第二區(qū)進(jìn)一步包含一個(gè)標(biāo)記，并且報(bào)道分子和第二寡核苷酸引物的第二區(qū)的標(biāo)記包括一個(gè)信號(hào)產(chǎn)生元件和一個(gè)信號(hào)淬滅元件。
全文摘要
本發(fā)明描述了利用非天然堿基的測(cè)試分析。在一個(gè)實(shí)施方案中，本方法包括將懷疑含有靶核酸的樣品與聚合酶和第一和第二引物接觸；如果樣品中存在靶核酸，利用第一和第二引物通過(guò)PCR擴(kuò)增靶核酸，以便產(chǎn)生具有一個(gè)雙鏈區(qū)和一個(gè)含有非天然堿基的單鏈區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物；將該樣品與含有標(biāo)記和與單鏈區(qū)的非天然堿基互補(bǔ)的非天然堿基的報(bào)道分子接觸；至少將報(bào)道分子的一部分與擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈區(qū)退火；在退火后，至少將報(bào)道分子的一部分裂解，以便至少釋放一個(gè)報(bào)道分子片段；并且將該至少一個(gè)報(bào)道分子片段的釋放與樣品中的靶核酸的存在進(jìn)行關(guān)聯(lián)。本發(fā)明也提供了用于檢測(cè)樣品中的靶核酸的對(duì)應(yīng)的試劑盒?；蛘?，將報(bào)道分子摻入擴(kuò)增產(chǎn)物而不是退火和然后裂解。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1592792SQ01812665
公開(kāi)日2005年3月9日 申請(qǐng)日期2001年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月19日
發(fā)明者詹姆斯R·普魯?shù)翘? 戴維J·馬歇爾, 克里斯多弗B·謝里爾, J·L·普塔辛, 克雷格S·里奇蒙, 詹尼弗K·格倫尼爾, 西蒙娜·朱西克, 吉迪恩·夏皮羅 申請(qǐng)人:伊拉根生物科學(xué)公司