一種檢測環(huán)境中多環(huán)芳烴化學(xué)物的質(zhì)粒及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明為一種檢測環(huán)境中多環(huán)芳烴化學(xué)物的質(zhì)粒及應(yīng)用，涉及分子生物學(xué)及環(huán)境生物【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明通過提取人源性AHR基因啟動子，以含螢火蟲熒光素酶、海腎熒光素酶雙報告基因的CV060質(zhì)粒為載體，插入特定序列的AHR基因啟動子，構(gòu)建了含AHR基因啟動子的內(nèi)參內(nèi)置型雙熒光素酶報告基因的重組慢病毒質(zhì)粒。本發(fā)明的檢測方法重復(fù)性好、靈敏度高、檢測結(jié)果可靠，且操作簡單方便，可廣泛地應(yīng)用于環(huán)境中多環(huán)芳烴類物質(zhì)的檢測。
【專利說明】一種檢測環(huán)境中多環(huán)芳烴化學(xué)物的質(zhì)粒及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及環(huán)境生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，是涉及一種含人源性AHR基因啟動子及雙熒光素酶報告基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，從而應(yīng)用于環(huán)境中多環(huán)芳烴的存在及含量的檢測。
【背景技術(shù)】:
[0002]多環(huán)芳經(jīng)化合物(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,簡稱PAHs)是指分子中含有兩個或兩個以上苯環(huán)的一類碳氫化合物，主要來源于煤炭、石油、木材等有機物的裂解和不完全燃燒。目前已知的PAHs約有200種，廣泛分布于人類生活的環(huán)境中。PAHs引起的環(huán)境污染越來越受到人們的重視，它已成為許多國家的優(yōu)先監(jiān)測物。1976年EPA列出了 16項PAHs為優(yōu)先控制污染物。1990年我國提出的68種水體優(yōu)先控制污染物中有7種屬于PAHs0多數(shù)的PAHs有致癌性，流行病學(xué)研究表明PAHs通過皮膚、呼吸道、消化道等均可被人體吸收，可誘發(fā)皮膚癌、肺癌、直腸癌、膀胱癌、白血病等(BoffettaP, JourenkovaN, Gustavsson P.Cancer risk from occupational and environmental exposure to polycyclicaromatic hydrocarbons.Cancer Causes Control, 1997, 8 (3):444-472.)D 一些 PAHs 還有免疫毒性、生殖和發(fā)育毒性。值得注意的是，絕大多數(shù)PAHs在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，其致突變性和致癌性較之原型化學(xué)物強數(shù)十至數(shù)千倍，對人體造成的危害更為嚴重。
[0003]PAHs毒性作用的機理為，PAHs可誘導(dǎo)機體細胞內(nèi)芳香烴受體(AHR)的表達，同時作為配體與AHR 結(jié)合使之激活，轉(zhuǎn)位于核內(nèi)后與核中的芳香烴受體核轉(zhuǎn)位子蛋白(ARNT)結(jié)合，形成配體-AHR-ARNT復(fù)合體，然后結(jié)合于特異基因上游的芳香烴受體反應(yīng)元件(AhRE)，從而導(dǎo)致特異基因如細胞色素P4501A1和1A2等的表達增強，最終通過代謝活化產(chǎn)生毒性作用。由此可見，PAHs類化合物的毒性大小與其誘導(dǎo)AHR能力及活化受體結(jié)合AhRE的能力有密切相關(guān)性，因此測定PAHs類化學(xué)物誘導(dǎo)AHR的能力對于評估其毒性及環(huán)境濃度具有主要的參考價值。
[0004]如何高效、快速地檢測環(huán)境中的PAHs受到了國內(nèi)外政府部門及相關(guān)科研工作者的關(guān)注。目前，環(huán)境中的PAHs的檢測方法主要為化學(xué)和生物兩大類方法:前者如分光光度法及色譜法，儀器設(shè)備大型昂貴、樣本前處理復(fù)雜，且無法檢測未知污染物；后者如細胞增殖實驗等，過程繁瑣、耗時長、且對操作人員有較高的技術(shù)要求，并且上述兩種方法都不能準確表達該環(huán)境污染物的人體效應(yīng)。本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種簡單、快速、靈敏的檢測手段。PAHs進入人體后，激活芳烴受體(AHR)，啟動一系列下游生物學(xué)效應(yīng)，從而發(fā)揮毒作用效應(yīng)，因此，利用人源性AHR啟動子構(gòu)建的質(zhì)粒檢測環(huán)境中的PAHs，可優(yōu)于直接的化學(xué)檢測或簡單的細胞增殖，反映化學(xué)物存在的同時，還能提示該類化合物對人類健康的潛在的損害效應(yīng)。
[0005]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種簡單、快速、靈敏的檢測手段。PAHs進入人體后，激活芳烴受體(AHR)，啟動一系列下游生物學(xué)效應(yīng)，從而發(fā)揮毒作用效應(yīng)，因此，利用人源性AHR啟動子構(gòu)建的質(zhì)粒檢測環(huán)境中的PAHs，可優(yōu)于直接的化學(xué)檢測或簡單的細胞增殖，反映化學(xué)物存在的同時，還能提示該類化合物對人類健康的潛在的損害效應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種含人源性AHR基因啟動子及雙熒光素酶報告基因的重組慢病毒質(zhì)粒及其構(gòu)建方法，從而應(yīng)用于環(huán)境中多環(huán)芳烴類物質(zhì)的檢測。
[0007]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述目的:
[0008]本發(fā)明利用人源性AHR基因啟動子受到多環(huán)芳烴類物質(zhì)上調(diào)的特性，建立一種通過檢測多環(huán)芳烴類物質(zhì)對上述啟動子的激活情況，實現(xiàn)對環(huán)境中多環(huán)芳烴類物質(zhì)檢測的方法。
[0009]本發(fā)明通過提取人AHR基因啟動子，以含有螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶報告基因的CV060質(zhì)粒為載體，插入AHR基因啟動子，構(gòu)建一種含有AHR基因啟動子和雙熒光素酶報告基因的重組慢病毒質(zhì)粒。
[0010]所述的人源性AHR基因的啟動子序列見SEQIDN0:1。
[0011]所述的AHR基因的啟動子，獲取該啟動子使用的引物序列為:AHR-pix)m0ter-Pl:
[0012]TGGTTAATTAAGGCACTACACTATACTGTATTC, SEQIDN0:2 ；AHR-promoter-P2:
[0013]CGGGCTAGCAACAGAGCGTCGACGGGACTC, SEQIDNO:3。
[0014]所述的重組慢病毒質(zhì)粒，其特征是含螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶報告基因，兀件順序為 MCS-f iref ly_Luc-Tk-ReniIla_Luc。
[0015]所述的重組質(zhì)粒中的AHR基因啟動子序列長度為2111bp。
[0016]本發(fā)明所述的含AHR基因啟動子和雙報告基因的重組質(zhì)粒，其中的載體質(zhì)粒和AHR基因啟動子都含有PacI/和NheI雙酶切位點。
[0017]本發(fā)明通過以下方法和步驟構(gòu)建所述的含有人源性AHR基因啟動子和報告基因的重組質(zhì)粒:
[0018]1.制備含有AHR基因啟動子基因組DNA
[0019](1)提取含有AHR基因啟動子的基因組DNA ；
[0020](2)擴增、純化AHR基因啟動子目的片段；
[0021]2.大量制備慢病毒表達載體CV060
[0022]3.構(gòu)建穩(wěn)定表達AHR基因啟動子的重組質(zhì)粒
[0023](I)含有AHR基因啟動子目的片段和CV060載體質(zhì)粒的雙酶切；
[0024](2)酶切后的AHR基因啟動子目的片段和CV060載體質(zhì)粒的酶連；
[0025](3)篩選連接后的重組質(zhì)粒并大量擴增制備。
[0026]本發(fā)明的另一個目的是提供一種含上述重組慢病毒質(zhì)粒的用途，所述的重組慢病毒質(zhì)粒主要用于環(huán)境中多環(huán)芳烴類物質(zhì)的檢測。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案:
[0027]將上述的重組慢病毒質(zhì)粒，經(jīng)慢病毒包裝后，轉(zhuǎn)染人293T細胞，多環(huán)芳烴類物質(zhì)刺激轉(zhuǎn)染后的人293T細胞，可以誘導(dǎo)AHR啟動子的調(diào)控序列表達調(diào)控作用的蛋白，誘導(dǎo)表達熒光素酶，加入熒光素酶底物后，能夠產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，檢測雙熒光素酶報告基因的活性，通過螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性比值來反映環(huán)境中多環(huán)芳烴類物質(zhì)的存在，且比值大小嚴格受到誘導(dǎo)物含量的控制。[0028]本發(fā)明通過以下步驟實現(xiàn)含有AHR基因啟動子的重組慢病毒質(zhì)粒在環(huán)境中多環(huán)芳烴類物質(zhì)的檢測用途:
[0029]1.含AHR基因啟動子的重組質(zhì)粒的慢病毒包裝
[0030](I)將該重組質(zhì)粒及其兩種輔助包裝原件載體質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染人293T細胞，收集轉(zhuǎn)染后的細胞上清液，并進行濃縮；
[0031](2)測定病毒滴度；
[0032]2.目的細胞的轉(zhuǎn)染
[0033](I)將人293T細胞按一定的比例接種到細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過夜；
[0034](2)將制備的病毒液稀釋至合適的滴度，轉(zhuǎn)染人293T細胞；
[0035](3)轉(zhuǎn)染8-12小時后，換新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3-4天；
[0036]3.分別加入待測樣品、不同濃度的多環(huán)芳烴標準品處理轉(zhuǎn)染后的細胞
[0037]4.檢測轉(zhuǎn)染后的細胞的雙熒光素酶報告基因活性
[0038](I)裂解經(jīng)待檢測樣本、標準品處理24小時的293T細胞；
[0039](2)利用雙報告基因檢測試劑盒，檢測雙報告基因的活性；
[0040](3)根據(jù)雙熒光素酶報告基因活性的比值大小，對照標準曲線可計算出待測樣本中多環(huán)芳烴類物質(zhì)的含量。
[0041]本發(fā)明構(gòu)建的重組慢病毒質(zhì)粒具有以下優(yōu)點:
[0042](I)雙熒光素酶報告基因法具有靈敏度高、檢測速度快、費用低的特點，且能克服轉(zhuǎn)染效率對結(jié)果的影響；
[0043](2)螢火蟲熒光素酶(報告基因)和海腎螢光素酶基因(內(nèi)參基因)被置于同一載體上，各自含有獨立的啟動子，活性穩(wěn)定，線性范圍廣，可以滿足檢測多環(huán)芳烴類物質(zhì)的需要；
[0044](3)慢病毒載體具有感染譜廣、效率高、免疫原性較低等特點，感染宿主細胞后可長期、穩(wěn)定地表達外源基因；
[0045](4)可應(yīng)用于所有多環(huán)芳烴類物質(zhì)的檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0046]圖1.質(zhì)粒表達檢測數(shù)據(jù)分析圖，結(jié)論:從定量PCR結(jié)果可以看出，293T細胞中，OE組Luciferase表達豐度是NC組的82478倍(Ρ〈0.05)。
[0047]圖2.建立檢測苯并芘的雙報告基因活性比值的標準檢測曲線。
【具體實施方式】
[0048]本發(fā)明利用PCR方法，從人外周血白細胞中擴增出AHR基因的啟動子序列，將目的載體進行酶切，酶切產(chǎn)物電泳回收后進行交換，將其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細菌感受態(tài)細胞，對長出的克隆先進行菌落PCR鑒定，再對PCR鑒定陽性的克隆進行測序和比對分析，比對正確的即為構(gòu)建成功的目的質(zhì)粒。將該重組慢病毒質(zhì)粒及其兩種輔助包裝原件載體質(zhì)粒，分別進行高純度無內(nèi)毒素抽提，按Inv itrogen公司Lipofectamine2000使用說明進行共轉(zhuǎn)染人293T細胞，轉(zhuǎn)染后8h更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h后，收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，對其濃縮后得到高滴度的慢病毒濃縮液，在293T細胞中測定并標定病毒滴度。培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的人293T細胞,質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前一天將細胞接種到96孔板中，實驗當天按照最佳感染條件進行慢病毒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染8-12小時后，觀察細胞的狀態(tài)，并更換為新鮮的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3-4天，多環(huán)芳烴物質(zhì)刺激轉(zhuǎn)染后的293T細胞，培養(yǎng)24小時后裂解細胞，利用雙報告基因檢測試劑盒，測定雙報告基因的活性，根據(jù)雙熒光素酶報告基因活性的比值大小，對照標準曲線可計算出特異性物質(zhì)的含量。
[0049]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的描述，但具體實施例并不對本發(fā)明做任何限定。
[0050]實施例1
[0051]1.過表達慢病毒質(zhì)粒的制備
[0052]含有AHR基因啟動子基因組DNA (NM_001621-promoter)提取自正常人外周血白細胞，采用基因組DNA純化試劑盒(天根生化，DP318)的操作方法提取人基因組DNA。根據(jù)已知人的AHR基因啟動子序列設(shè)計并合成兩端引物:上游引物:TGGTTAATTAAGGCACTACACTATACTGTATTC 見 SEQIDN0:2 ;下游引物:CGGGCTAGCAACAGAGCGTCGACGGGACTC，見 SEQIDN0:3。以基因組DNA為模板，利用常規(guī)PCR反應(yīng)進行擴增，擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根生化，DP209-03)回收純化。
[0053]慢病毒表達載體CV060 (兀件的順序為 MCS-firefly-Luc-Tk-Renilla-Luc),購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司，通過PacI和NheI限制性內(nèi)切酶(Takara公司)，于 37°C孵育 2h 酶切回收 firefly_Luc-Tk-Renilla_Luc 基因片段。利用 In-Fusion?PCRCloningKit (clontech公司，Cat.N0.639626)將AHR基因啟動子目的片段連接入線性化的慢病毒表達載體。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，長出的陽性克隆進行后續(xù)的PCR鑒定，與預(yù)期結(jié)果符 合，對其進行測序分析表明，測序結(jié)果采用NCBIBLAST比對，結(jié)果100%匹配，沒有發(fā)生移碼改變，表明克隆的目的基因序列正確，AHR過表達的慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功。
[0054]2.慢病毒包裝與滴度檢測
[0055]人293T細胞用含10%血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。定量PCR檢測重組質(zhì)粒的表達豐度。轉(zhuǎn)染前2h將細胞培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。向一滅菌離心管中加入所制備各DNA溶液(pGC-LV 載體 20 μ g, pHelperl.0 載體 15 μ g, pHelper2.0 載體 10 μ g),與相應(yīng)體積的Opt1-MEM混合均勻，調(diào)整總體積為2.5ml,在室溫下溫育5min。將Lipofectamine2000(Invitrogen 公司，Cat.N0.11668-500)試劑輕柔搖勻，取 100 μ lLipofectamine2000試劑在另一管中與2.4ml0pt1-MEM混合，在室溫下溫育5min。把稀釋后的DNA和Lipofectamine2000進行混合，輕輕地顛倒混勻，在室溫下溫育20min。將DNA與Lipofectamine2000稀釋液的轉(zhuǎn)染復(fù)合物轉(zhuǎn)移至293T細胞培養(yǎng)液中，混勻，于37°C，5%C02細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)8h后倒去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)基，加入新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h。收集轉(zhuǎn)染48h的293T細胞上清液，進行濃縮，得到濃縮的病毒液。
[0056]本發(fā)明采用Realtime定量PCR法測定病毒的滴度。樣品準備:檢測前一天，對293T細胞傳代，每個24孔中加I X IO5個細胞，體積為500 μ I ;次日，準備7~10個無菌EP管，在每個管中加入90 μ I的培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS);將待測定的病毒原液10 μ I加入到第一個管中，混勻后，取10μ I加入到第二個管中，繼續(xù)相同的操作直到最后一管。選取所需的細胞孔，吸去90 μ I培養(yǎng)基。加入稀釋好的病毒溶液繼續(xù)培養(yǎng)24h后，加入新鮮培養(yǎng)基500 μ L.4天后，抽提RNA準備做RT-qPCR。總RNA抽提根據(jù)Invitrogen公司的TRIZOL操作說明書進行，均為RNase-free操作。將獲得的RNA，根據(jù)Promega公司的M-MLV操作說明書進行逆轉(zhuǎn)錄獲cDNA，均為RNase-free操作。M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和dNTP購自Promega公司，OligodT 購自上海生工，RNase-free 物品都購自 Axygen。Real-timePCR 在 Takara 的TP800上完成，SYBRMasterMixture來自Takara。通過比較對照組和試驗組的Ct值差異判斷滴度值。從RealtimePCR結(jié)果(圖1)可以看出，293T細胞中，OE組(為目的基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T后樣品)Luciferase表達豐度是NC (為293T細胞樣品，即對照組)組的82478倍(P〈0.05)。本次滴度檢測中，在ΙΟΛιΙ組中檢測到目的基因表達，故認為在ΙΟΛιΙ組樣品中存在病毒顆粒。假定該組樣品含有至少I個病毒顆粒，則病毒的滴度為:1/(1.00Ε-04)*20=2.00E+5TU/ul=2.00E+8TU/ml。
[0057]試驗數(shù)據(jù)如下:
【權(quán)利要求】
1.一種質(zhì)粒，其特征在于用人源性AHR基因啟動子連接內(nèi)參內(nèi)置型雙熒光素酶報告基因的慢病毒載體，構(gòu)建AHR過表達的重組慢病毒質(zhì)粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種質(zhì)粒，其特征在于所述的人源性AHR基因的啟動子序列見 SEQ ID NO:1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種質(zhì)粒，其特征在于所述的AHR基因的啟動子，獲取該啟動子使用的引物序列為:TGGTTAATTAAGGCACTACACTATACTGTATTC，見 SEQ ID NO:2 ；CGGGCTAGCAACAGAGCGTCGACGGGACTC，見 SEQ ID NO: 3。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒，其特征在于所使用的內(nèi)參內(nèi)置型雙熒光素酶報告基因的慢病毒載體為CV060，元件的順序為MCS-firefly-Luc-Tk-ReniIIa-Luc，包含PacI/和NheI雙酶切位點。
5.利用權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒檢測環(huán)境中多環(huán)芳烴化學(xué)物的方法，其特征在于利用所述的重組質(zhì)粒經(jīng)慢病毒包裝后，轉(zhuǎn)染人293T細胞株，感染復(fù)數(shù)MOI為2，轉(zhuǎn)染8 - 12小時，換新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3 - 4天，利用多環(huán)芳烴類物質(zhì)刺激轉(zhuǎn)染后的293T細胞，通過檢測雙熒光素酶報告基因活性的比值來檢測樣本中多環(huán)芳烴類物質(zhì)的存在。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測環(huán)境中多環(huán)芳烴化學(xué)物的方法，其特征在于檢測時間是在多環(huán)芳烴類物質(zhì)刺激轉(zhuǎn)染后的人293T細胞之后的24小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測環(huán)境中多環(huán)芳烴化學(xué)物的方法，其特征在于:在多環(huán)芳烴誘導(dǎo)物刺激轉(zhuǎn)染后的人293T細胞后，檢測雙熒光素酶報告基因的活性，根據(jù)雙熒光素酶報告基因活性的比值大小 ，對照標準曲線可計算其含量。
【文檔編號】C12Q1/68GK103898162SQ201410105958
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月20日
【發(fā)明者】顧愛華, 嚴麗鋒, 吉貴祥, 趙鵬 申請人:南京醫(yī)科大學(xué)