專利名稱：重組人血清白蛋白－干擾素α2b 融合蛋白的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)基因工程蛋白藥物，具體說是從含有重組人血清白蛋白-干擾素α2b融合蛋白(rHSA-IFNα2b)基因的畢赤酵母高表達(dá)工程菌的發(fā)酵液中大規(guī)模純化rHSA-IFNα2b的方法。
背景技術(shù)：
人血清白蛋白-干擾素α2b融合蛋白(rHSA-IFNα2b)是由α-干擾素(Interferon-alpha)和人血清蛋白(Albumin)利用基因融合技術(shù)融合而成的長效干擾素。與普通干擾素相比，rHSA-IFNα2b在人體內(nèi)的平均半衰期要長30多倍，因而可減少干擾素治療時(shí)注射次數(shù)，減輕病人治療的痛苦。
干擾素(Interferon，IFN)是一類分泌性蛋白，具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能。目前干擾素已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于病毒性肝炎、癌癥及多發(fā)性硬化癥等多種疾病。由于干擾素半衰期短(在體內(nèi)大約2-4小時(shí))而治療時(shí)間長(6-12月)，因而需要多次給藥，(大約為1-2天一次)。
人血清白蛋白是血液循環(huán)中的一個(gè)非常重要的天然蛋白，在體液循環(huán)中可存在20天以上。研究表明將干擾素基因與人血清白蛋白基因融合所表達(dá)的融合蛋白可明顯降低體內(nèi)藥物的清除速率，延長生物半衰期。與人血清白蛋白融合表達(dá)的干擾素，即rHSA-IFNα2b有比普通干擾素更長的半衰期(70-140小時(shí))，從而可以大大減少干擾素治療的給藥次數(shù)(Blaire L.Osbor等，the journal ofpharmacology and experimental therapeutics，vol 303540-548)。但是，如何大規(guī)模制備符合藥用要求的重組人血清白蛋白-干擾素α2b融合蛋白一直未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種適合于工業(yè)生產(chǎn)的簡便、快速、高收率地從含有rHSA-IFNα2b的畢赤酵母發(fā)酵液中純化rHSA-IFNα2b的方法，大規(guī)模制備得到高純度的藥用rHSA-IFNα2b蛋白，從而滿足臨床要求。為了達(dá)到上述目的本發(fā)明采取下列措施一種重組人血清白蛋白-干擾素α2b融合蛋白的生產(chǎn)方法，包括以下步驟(1)整合有人血清白蛋白-干擾素α2b融合蛋白基因的畢赤酵母工程菌發(fā)酵表達(dá)。
(2)隨后將含有人血清白蛋白-干擾素α2b融合蛋白的發(fā)酵液通過親和柱層析、疏水柱層析、離子交換柱層析和凝膠柱層析順序組合純化，制備得到藥用重組人血清白蛋白-干擾素α2b融合蛋白。
通過基因重組技術(shù)構(gòu)建表達(dá)rHSA-IFNα2b畢赤酵母工程菌，按Invitrogen公司Pichia Fermentation Process Guidelines方法進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵結(jié)束后通過離心除去菌體，收集發(fā)酵上清，經(jīng)親和柱層析、疏水柱層析、離子交換柱層析和凝膠柱層析順序組合純化，得到高純度的藥用重組人血清白蛋白-干擾素α2b融合蛋白。
本發(fā)明的有益效果是，1)采用Blue親和層析的方法可直接純化發(fā)酵液，減少了發(fā)酵液的預(yù)處理的過程；2)采用親和層析的方法，可使一步純化所得的rHSA-IFNα2b的純度可達(dá)到85％以上；3)采用親和層析的方法，可去除大部分的內(nèi)毒素和雜質(zhì)為后續(xù)的純化工作帶來方便；4)純化的方法操作簡單、方便、省時(shí)，有利于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)；5)通過疏水層析的方法，使過親和層析所得的rHSA-IFNα2b得以精純化，經(jīng)反相高效液相層析(HPLC-RP)檢測，其純度大于95％，生物學(xué)活性達(dá)到1.0×106U/mg以上；6)離子交換柱用于需要獲得更高純度的樣品時(shí)。離子交換柱后的樣品可以到97％以上的純度；7)通過凝膠層析可以改變疏水目標(biāo)峰的緩沖體系，使所得目標(biāo)峰可以直接用于制劑的配制，而無須采用透析等其他改換溶液體系的處理，減少處理步驟中可能的污染與損失。


圖1是本發(fā)明的Blue-Sepharose親和層析圖；圖2是本發(fā)明的SOURCE PHE疏水層析圖；圖3是本發(fā)明的SOURCE Q離子交換層析圖；圖4是本發(fā)明的Sephadex G25 Coarse脫鹽層析圖；具體實(shí)施方式
本發(fā)明設(shè)計(jì)了顏料親和層析、疏水柱層析、離子交換柱層析和凝膠柱層析順序組合來去除雜蛋白、內(nèi)毒素、糖類等雜質(zhì)，最終得到高純度蛋白。
柱層析純化首先采用Blue顏料親和層析。因?yàn)楸磉_(dá)上清的成分較雜，使用Blue親和層析收集表達(dá)上清中的rHSA-IFNα2b具有較高的特異性，可以去除大部分的色素、熱原質(zhì)、核酸片段等非蛋白類雜質(zhì)和雜蛋白。同時(shí)，親和層析允許一定濃度的鹽的存在，對發(fā)酵上清超濾濃縮后的鹽濃度要求不高，非常適合發(fā)酵液的第一步柱層析收集。
Blue親和層析可選用10-150mM Tris-HCl或磷酸緩沖液，pH的范圍6.0-8.0，也可以在緩沖液中加入300mM以下的NaCl以增加吸附的特異性。洗脫緩沖液可以使用1.5M以上的NaCl或其他高鹽溶液，也可以使用各種濃度的有機(jī)溶劑。
疏水柱選用各種PHE，ISO，ETH，butyl-，phenyl-或octyl基團(tuán)的疏水填料，可選用20-50mM Tris-HCl、Gly-NaOH或磷酸緩沖液，pH范圍在4.0-10.0，加入0.5-1.6mol/L(NH4)2SO4或0.5-1.6mol/L Na2SO4的緩沖液為流動(dòng)相A，以不含(NH4)2SO4或Na2SO4的緩沖液為流動(dòng)相B。將Blue柱目標(biāo)峰用pH5.0-10.0，20-50mMTris-HCl、Gly-NaOH或磷酸緩沖液稀釋數(shù)倍，或在Blue目標(biāo)峰中直接加入高濃度的(NH4)2SO4或Na2SO4溶液至濃度為0.5-1.6mol/L(NH4)2SO4或0.5-1.6mol/LNa2SO4，上樣于疏水柱，然后以流動(dòng)相A沖洗柱子，再以流動(dòng)相B梯度進(jìn)一步洗脫，收集目標(biāo)峰。通過疏水層析可進(jìn)一步去除可能存在的寡聚體、降解蛋白、色素等雜質(zhì)，使目標(biāo)峰中rHSA-IFNα2b的純度可達(dá)到95％以上，這一步純化的回收率在60％左右。
疏水層析后的樣品可經(jīng)Q或DEAE等陰離子交換柱進(jìn)一步純化。通過與疏水層析不同的分離機(jī)理，離子交換層析可使目標(biāo)蛋白得到進(jìn)一步的純化?？梢赃x用pH在6.0-9.0之間的20-50mM Tris-HCl、Gly-NaOH或磷酸緩沖液下過Q或DEAE柱。疏水層析后過離子交換柱這一步是可選的，因?yàn)槭杷蟮臉悠吠ǔ？梢赃_(dá)到95％以上的純度，為了獲得更高的純度，可以選擇使用離子交換層析。經(jīng)過離子交換層析的樣品通常可以達(dá)到97％以上的純度。離子交換柱的收率在70％以上。
經(jīng)疏水層析或離子交換層析后收集的目標(biāo)峰，可直接上樣于Sephacryl、Superdex或Sephadex等凝膠層析柱，進(jìn)行脫鹽。凝膠層析用先以5-10mM的磷酸緩沖液為流動(dòng)相平衡，經(jīng)此凝膠層析得到的目標(biāo)蛋白rHSA-IFNα2b，此流動(dòng)相將前述疏水層析或離子交換層析條件下的體系改換為5-10mM磷酸鹽可以直接用于制劑的配制，而無須采用透析等其他改換溶液體系的處理，減少處理步驟中可能的污染與損失，這步脫鹽的回收率在95％以上。
整個(gè)純化過程中，發(fā)酵離心后的樣品可以直接使用Blue親和柱收集，收集的目標(biāo)蛋白加硫酸銨即可上疏水柱，疏水柱的洗脫電導(dǎo)較低，而且樣品得到高度濃縮，因此幾倍稀釋后即能滿足離子交換的要求，經(jīng)離子交換的樣品濃度高而體積小，剛好適合于脫鹽層析。因此整個(gè)純化組合相對比較合理。不需要其他的處理步驟，易于工業(yè)放大。純化的總回收率在25％左右，產(chǎn)品最終純度在97％以上。
以下實(shí)例將進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不僅限于這些實(shí)例。
實(shí)例1一、表達(dá)rHSA-IFNα2b畢赤酵母工程菌的構(gòu)建1.HSA基因的克隆按Genebank中HSA基因的編碼序列合成引物HSA15’GCTTCGAAACCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCT3’，HSA25’TAGGATCCACCACCACCAAGGCCTAAGGCAGCTTGACTTGC3’，用于擴(kuò)增包括信號(hào)肽在內(nèi)的HSA全長編碼序列，并在5’端加入了NspV酶切位點(diǎn)，并使其起始密碼子前的序列與pHIL-D2載體AOX1啟動(dòng)子的Kozak序列一致。在3’端，去除了終止密碼子，并在不改變氨基酸的條件下將最后一個(gè)氨基酸的密碼子由TTA改為CTT，以在該處形成一個(gè)StuI的酶切位點(diǎn)。3’端還加入了編碼GlyGlyGlyGlySer的接頭序列及一個(gè)BamHI的酶切位點(diǎn)。PCR條件為100μl反應(yīng)體系中，加入1μl人肝胎cDNA文庫，20μmol/L的HSAl和HSA2引物各3μl，2mmol/L的dNTP10ul，10X反應(yīng)緩沖液10μl，TaqplusI DNA聚合酶5U。用Perk-Elmer公司的9600PCR儀，PCR條件為94℃變性1分鐘，52℃退火1分鐘，72℃延伸3分鐘，35個(gè)循環(huán)后，再72℃延伸10分鐘。
PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖電泳純化，用DNA片段回收試劑盒回收純化約1.8kb的目標(biāo)帶。取純化的HSA cDNA 6μl，加入1μl pGEM-T載化，8μl 2X緩沖液，1μl T4DNA連接酶，15℃反應(yīng)過夜，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化菌輔于含X-gal、IPTG和氨芐青霉素(50μg/ml)的LB瓊脂平皿上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取白色菌落，接種至3ml含氨芐青霉素(50μg/ml)的LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜，用常規(guī)方法抽提質(zhì)粒，用NSPV/BamHI酶切，電泳分析鑒定陽性克隆。
2 hIFNα2b cDNA的克隆靜脈抽取正常成年人血液5mL，肝素鈉抗凝。將血液用1640培養(yǎng)基對倍稀釋后，加入淋巴細(xì)胞分層液，2000r/min離心20min，吸取白細(xì)胞環(huán)，用含10％小牛血清的1640培養(yǎng)基洗細(xì)胞3次，將細(xì)胞數(shù)調(diào)整為1×106/mL，加入終濃度60μg/mL的PHA和20U/ml rhIFNα2b，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱活化5h，收集細(xì)胞。用總RNA提取試劑盒(QIAGEN公司)從細(xì)胞中提取總RNA用于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，并按照RT-PCR試劑盒(QIAGEN公司)的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用作為PCR反應(yīng)的模板。PCR所用的引物IFN1和IFN2用寡聚核苷酸合成儀合成。
IFN15’ATGGATCCTGTGATCTGCCTCAAACCCACAG 3’IFN25’ATGAATTC TTA GGG CTG GGC AAG GTG GCG3’用于擴(kuò)增hIFN成熟肽編碼基因，并在其5’-端和3’端分別加入了BamHI位點(diǎn)和EcoR I位點(diǎn)。并在3’-端EcoR I位點(diǎn)前加入了終止密碼子。
PCR方法為100ul反應(yīng)體系中加入1μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，20μmol/L的IFN1、IFN2引物各3ul，2mmol/L的dNTP10μl，10X反應(yīng)緩沖液10μl，pfu DNA聚合酶5U，用Perk-Elmer公司的9600 PCR儀，PCR條件為94℃變性1分鐘，52℃退火30秒，72℃延伸1.0分鐘，循環(huán)35次。通過凝膠電泳分析，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)物顯出一預(yù)期大小(0.5kb)的條帶，PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒純化回收。用BamH I和EcoR I酶切，瓊脂糖凝膠電泳純化后，克隆到用BamHI/EcoRI酶解的pUC19質(zhì)粒上，形成pUC-IFNα2b。BamHI/EcoRI酶切鑒定，測序。取序列正確的克隆用于構(gòu)建融合蛋白表達(dá)載體。
3 pD2-HSA/IFN載體構(gòu)建為了將HSA與IFN以融合蛋白形式從畢赤酵母分泌表達(dá)，我們選擇pHIL-D2質(zhì)粒(簡稱pD2，Invitrogen公司)作為載體。在該載體AOX啟動(dòng)子下游位點(diǎn)間插入HSA/IFN基因，因pD2載體上有兩個(gè)NspV位點(diǎn)，為了方便操作，首先pD2載體用ClaI/Scal酶切成3段，回收4kb片段，自身連接后命名為pD3載體。pD3載體用NspV/EcoRI切，回收線性化載體，構(gòu)建的pUC19-IFN用BamHI/EcoRI切，回收約0.5kb的含IFN cDNA的片段，構(gòu)建的pGEMT-HSA用NspV/BamHI切，回收約1.8kb的含HSAcDNA的片段，將線性化pD3載體與含HSAcDNA，IFN cDNA的片段用T4連接酶催化連接，轉(zhuǎn)化JM109，挑選陽性克隆，分別用NspV/EcoRI和NspV/BamHI酶切鑒定，獲得陽性克隆JM109(pD3HSAGCSF)。pD3HSAGCSF質(zhì)粒，用ClaI/ScaI切，電泳回收線性化的約6.3kb片段，pD2空載體用ClaI/ScaI切回收約4.2kb的片段。T4連接酶催化連接pD3HSAIFN的6.3kb片段與pD2的4.2kb片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109后，輔于含氨芐青霉素(50μg/ml)的LB瓊脂平皿，挑選陽性克隆，抽提質(zhì)粒，酶切鑒定，獲得克隆JM109(pD2HAS-IFN)。經(jīng)測序分析，NspV/EcoRI兩個(gè)酶切位點(diǎn)間的序列應(yīng)與序列表中序列一致。
4質(zhì)粒轉(zhuǎn)化抽提pD2-HSA/IFN約10μg，用NotI酶切。線性化后用轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，鋪于含山梨醇的RDB瓊脂平皿，30℃培養(yǎng)4-7天。
5表達(dá)HSA/IFN的工程酵母的篩選挑取His+克隆。接種至裝有25mlBMGY培養(yǎng)基的300ml三角瓶，250轉(zhuǎn)/分鐘30℃培養(yǎng)48小時(shí)，加甲醇0.5％/24h，誘導(dǎo)培養(yǎng)4天，離心取上清，SDS-PAGE分析，篩選高表達(dá)菌株。
6誘導(dǎo)表達(dá) 取重組體單菌落接種于BMGY培養(yǎng)基中，30℃震蕩培養(yǎng)過夜，A600約為5.0。離心收集菌體，以BMMY培養(yǎng)基重懸菌體至A600為2.0后誘導(dǎo)表達(dá)，每隔24h補(bǔ)加甲醇至終濃度為2％，72h后離心收集上清。
二、表達(dá)rHSA-IFNα2b畢赤酵母工程菌的發(fā)酵篩選所得高表達(dá)菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基搖瓶，30℃300rpm振蕩培養(yǎng)至O.D.600約20左右，進(jìn)罐培養(yǎng)，接種量為1％-5％。發(fā)酵過程分二階段，生長階段以甘油為碳源，基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基，溫度30℃，pH5.0，通氣攪拌保證溶氧不低于40％飽和度，經(jīng)過約18-24小時(shí)培養(yǎng)，當(dāng)溶氧明顯上升時(shí)表明培養(yǎng)基中的甘油耗盡，此時(shí)菌濃度O.D.600約70左右，開始甘油補(bǔ)料，補(bǔ)料速度18ml/L/hr，補(bǔ)料4小時(shí)，此時(shí)菌濃度O.D.600約140左右。結(jié)束補(bǔ)料，開始誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)階段每隔24hr向發(fā)酵液中添加一次酵母粉和蛋白胨(分別為發(fā)酵初始體積的1％和2％，w/v，已滅菌)，控制甲醇補(bǔ)料速度使培養(yǎng)基中甲醇濃度為0.5-1％，誘導(dǎo)48-72小時(shí)放罐。離心收集發(fā)酵液上清。發(fā)酵上清液中rHSA-IFNα2b表達(dá)量經(jīng)SDS-PAGE分析應(yīng)不低于10mg/L。
三、rHSA-IFNα2b的親和柱純化在安瑪西亞的BPG 100/500L柱中裝入1L的Blue-Sepharose填料，以PBS為流動(dòng)相A，2M NaCl為流動(dòng)相B。用流動(dòng)相A平衡Blue親和柱后，以200ml/min流速將離心后的發(fā)酵液上清含有34克rHSA-IFNα2b的發(fā)酵上清直接上BLUE-Sepharose柱，上完樣后先以流動(dòng)相A平衡柱子，將所有未結(jié)合在柱上的組分沖干凈；再用100％的流動(dòng)相B脫目標(biāo)峰1(見圖1)，目標(biāo)峰1內(nèi)rHSA-IFNα2b的蛋白總量為21.8克，因而過此柱的回收率為64.2％。
四、rHSA-IFNα2b的疏水柱純化在安瑪西亞的BPG 100/500L柱中裝入2L的SOURCE PHE疏水膠，流動(dòng)相A為20mM pH 7.0加0.7mol/L(NH4)2SO4，流動(dòng)相B為20mM pH 7.0的PB緩沖液。先將親和目標(biāo)峰A用流動(dòng)相A稀釋3倍，然后再直接加入4mol/L的(NH4)2SO4溶液至(NH4)2SO4濃度為0.7mol/L左右，接著以100ml/min的流速上樣于用流動(dòng)相A平衡好的SOURCE PHE疏水柱，上完樣后用流動(dòng)相A平衡2個(gè)柱體積(將未結(jié)合于柱上的雜質(zhì)沖洗干凈)，再用85％的流動(dòng)相B洗脫，收集目標(biāo)峰2(見圖2)，經(jīng)RP-HPLC分析此時(shí)所得目標(biāo)峰2的純度為95.2％，rHSA-IFNα2b蛋白總量為13.1克，此步純化的回收率為60.4％。
五、rHSA-IFNα2b的離子交換柱純化在安瑪西亞的BPG 100/500L柱中裝入1L的SOURCE Q填料，流動(dòng)相A為20mMPH 7.0，流動(dòng)相B為20mM PH 7.0的PB緩沖液加1M NaCl。先將疏水目標(biāo)峰2用流動(dòng)相A稀釋5倍，接著以100ml/min的流速上樣于用流動(dòng)相A平衡好的SOURCE Q柱，上完樣后用流動(dòng)相A平衡2個(gè)柱體積，再用15％梯度洗脫可能的雜質(zhì)，最后以25％的流動(dòng)相B洗脫，收集目標(biāo)峰3(見圖3)。經(jīng)過此步層析，rHSA-IFNα2b蛋白總量為9.2克，純化的回收率為70.2％。
六、rHSA-IFNα2b的凝膠柱脫鹽在安瑪西亞的XK 50/100L柱中裝入2L的Sephadex G25 Coarse膠，離子交換目標(biāo)峰3過Sephadex G25 Coarse柱脫鹽，以5mM的磷酸緩沖液為平衡液，洗脫收集目標(biāo)峰4，即為高純度的rHSA-IFNα2b，可直接用于制劑的制備，不用再進(jìn)行透析等處理(見圖4)。經(jīng)RP-HPLC分析，純度大于95％。rHSA-IFNα2b蛋白總量為8.9g，因此過凝膠柱純化的回收率為96.7％。測定rHSA-IFNα2b的體外活性(《中國生物制品規(guī)程》干擾素效價(jià)測定細(xì)胞病變抑制法)，比活性為3.0×106U/mg。
人血清白蛋白-干擾素α2b融合蛋白(rHSA-IFNα2b)基因序列表<110>杭州九源基因工程有限公司<120>重組人血清白蛋白-干擾素α2b融合蛋白的生產(chǎn)方法<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2343<212>DNA<213>人工序列<400>1accatgaagt gggtaacctt tatttccctt ctttttctct ttagctcggc ttattccagg 60ggtgtgtttc gtcgagatgc acacaagagt gaggttgctc atcggtttaa agatttggga120gaagaaaatt tcaaagcctt ggtgttgatt gcctttgctc agtatcttca gcagtgtcca180tttgaagatc atgtaaaatt agtgaatgaa gtaactgaat ttgcaaaaac atgtgttgct240gatgagtcag ctgaaaattg tgacaaatca cttcataccc tttttggaga caaattatgc300acagttgcaa ctcttcgtga aacctatggt gaaatggctg actgctgtgc aaaacaagaa360cctgagagaa atgaatgctt cttgcaacac aaagatgaca acccaaacct cccccgattg420gtgagaccag aggttgatgt gatgtgcact gcttttcatg acaatgaaga gacatttttg480aaaaaatact tatatgaaat tgccagaaga catccttact tttatgcccc ggaactcctt540ttctttgcta aaaggtataa agctgctttt acagaatgtt gccaagctgc tgataaagct600gcctgcctgt tgccaaagct cgatgaactt cgggatgaag ggaaggcttc gtctgccaaa660cagagactca agtgtgccag tctccaaaaa tttggagaaa gagctttcaa agcatgggca720gtagctcgcc tgagccagag atttcccaaa gctgagtttg cagaagtttc caagttagtg780acagatctta ccaaagtcca cacggaatgc tgccatggag atctgcttga atgtgctgat840gacagggcgg accttgccaa gtatatctgt gaaaatcaag attcgatctc cagtaaactg900aaggaatgct gtgaaaaacc tctgttggaa aaatcccact gcattgccga agtggaaaat960gatgagatgc ctgctgactt gccttcatta gctgctgatt ttgttgaaag taaggatgtt 1020tgcaaaaact atgctgaggc aaaggatgtc ttcctgggca tgtttttgta tgaatatgca 1080agaaggcatc ctgattactc tgtcgtgctg ctgctgagac ttgccaagac atatgaaacc 1140
actctagaga agtgctgtgc cgctgcagat cctcatgaat gctatgccaa agtgttcgat 1200gaatttaaac ctcttgtgga agagcctcag aatttaatca aacaaaattg tgagcttttt 1260gagcagcttg gagagtacaa attccagaat gcgctattag ttcgttacac caagaaagta 1320ccccaagtgt caactccaac tcttgtagag gtctcaagaa acctaggaaa agtgggcagc 1380aaatgttgta aacatcctga agcaaaaaga atgccctgtg cagaagacta tctatccgtg 1440gtcctgaacc agttatgtgt gttgcatgag aaaacgccag taagtgacag agtcaccaaa 1500tgctgcacag aatccttggt gaacaggcga ccatgctttt cagctctgga agtcgatgaa 1560acatacgttc ccaaagagtt taatgctgaa acattcacct tccatgcaga tatatgcaca 1620ctttctgaga aggagagaca aatcaagaaa caaactgcac ttgttgagct tgtgaaacac 1680aagcccaagg caacaaaaga gcaactgaaa gctgttatgg atgatttcgc agcttttgta 1740gagaagtgct gcaaggctga cgataaggag acctgctttg ccgaggaggg taaaaaactt 1800gttgctgcaa gtcaagctgc cttaggcctt ggtggtggtg gatcctgtga tctgcctcaa 1860acccacagcc tgggtagcag gaggaccttg atgctcctgg cacagatgag gagaatctct 1920cttttctcct gcttgaagga cagacatgac tttggatttc cccaggagga gtttggcaac 1980cagttccaaa aggctgaaac catccctgtc ctccatgaga tgatccagca gatcttcaat 2040ctcttcagca caaaggactc atctgctgct tgggatgaga ccctcctaga caaattctac 2100actgaactct accagcagct gaatgacctg gaagcctgtg tgatacaggg ggtgggggtg 2160acagagactc ccctgatgaa ggaggactcc attctggctg tgaggaaata cttccaaaga 2220atcactctct atctgaaaga gaagaaatac agcccttgtg cctgggaggt tgtcagagca 2280gaaatcatga gatctttttc tttgtcaaca aacttgcaag aaagtttaag aagtaaggaa 2340taa 2343上述實(shí)施例用來解釋說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明進(jìn)行限制，在本發(fā)明的精神和權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)，對本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種重組人血清白蛋白-干擾素α2b融合蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將整合有人血清白蛋白-干擾素α2b融合蛋白基因的畢赤酵母工程菌發(fā)酵表達(dá)。(2)隨后將含有人血清白蛋白-干擾素α2b融合蛋白的發(fā)酵液通過親和柱層析、疏水柱層析、離子交換柱層析和凝膠柱層析順序組合純化，制備得到藥用重組人血清白蛋白-干擾素α2b融合蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人血清白蛋白-干擾素α2b融合蛋白的的生產(chǎn)方法，其特征在于，按照該方法制備所得的重組人血清白蛋白-干擾素α2b融合蛋白純度大于95％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人血清白蛋白-干擾素α2b融合蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述親和層析柱填料為以Cibacron Blue為結(jié)合基團(tuán)的各種顏料親和層析介質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組人血清白蛋白-干擾素α2b融合蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述親和層析柱填料為Blue-Sepharose 6 Fast Flow、Bluesepharose CL-6B、Affi-Gel Blue Gel或Blue-Sepharose 6 Fast Flow。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人血清白蛋白-干擾素α2b融合蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述疏水柱填料是以Butyl-、Phenyl-、Octyl-為結(jié)合基團(tuán)的Sepharose、Macro-Prep、Poros填料或SOURCE PHE、ISO、ETH疏水填料。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組人血清白蛋白-干擾素α2b融合蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于，所提及疏水柱填料為SOURCE PHE。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其等征在于所提及離子交換柱填料是以陰離子Q、DEAE結(jié)合基團(tuán)的各種層析填料。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其等征在于所提及離子交換柱填料是SOURCE Q。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從表達(dá)重組人血清白蛋白－干擾素α2b融合蛋白的畢赤酵母發(fā)酵液中純化rHSA－IFN α2b的生產(chǎn)方法，該方法將整合有人血清白蛋白－干擾素α2b融合蛋白基因的畢赤酵母工程菌高密度發(fā)酵表達(dá)，隨后將含有rHSA－IFN α2b的發(fā)酵液通過親和柱層析、疏水柱層析、離子交換柱層析和凝膠柱層析順序組合純化，大規(guī)模制備得到高純度的藥用重組人血清白蛋白－干擾素α2b融合蛋白蛋白。本發(fā)明操作簡單、方便、省時(shí)、有利于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/14GK1807646SQ200610049070
公開日2006年7月26日 申請日期2006年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月13日
發(fā)明者王同映, 楊志愉, 馬國昌, 裘霽宛, 王昌梅, 單劍鋒, 黃巖山 申請人:杭州九源基因工程有限公司