專利名稱：磺胺二甲氧嘧啶檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
磺胺二甲氧嘧啶檢測試劑盒技術領域：
:本實用新型涉及一種磺胺二甲氧嘧啶檢測試劑盒，特別是檢測動物源性食品中磺胺二甲氧嘧啶殘留量的試劑盒。背景技術：
:磺胺二甲氧嘧啶是應用廣泛的抗菌素，對畜禽疾病控制和治療起到重要作用。但由于磺胺二甲氧嘧啶存在嚴重副作用，人體中長期存在磺胺藥物會導致許多細菌對磺胺藥物產(chǎn)生抗藥性，且有潛在的致癌性。我國農(nóng)業(yè)部第235號文件規(guī)定其殘留限量為10(^g/kg，目前主要用儀器分析方法分析，由于高效液相色譜等儀器分析方法樣本前處理及測定操作繁瑣和費用高，不利于現(xiàn)場檢測，推廣使用受到限制。(三)實用新型內容:本實用新型提供一種小巧輕便的磺胺二甲氧嘧啶檢測試劑盒，其操作簡便，檢測靈敏度高，成本低，可進行一次連續(xù)進行多個樣品中磺胺二甲氧嘧啶殘留量的測定，減少了檢測樣本所需要的時間。
磺胺二甲氧嘧啶檢測試劑盒，包括固相載體、放試劑的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的試劑瓶，固相載體上設有微孔條，微孔條包括微孔、包被層；試劑瓶包括裝有磺胺二甲氧嘧啶單克隆抗體溶液的試劑瓶、裝有辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗抗體的試劑瓶。所述包被層由磺胺二甲氧嘧啶偶聯(lián)抗原組成。所述試劑盒還包括6瓶裝有磺胺二甲氧嘧啶標準液的試劑瓶，2瓶裝有底物顯色液的試劑瓶，I瓶裝有終止液的試劑瓶，I瓶裝有洗滌液的試劑瓶，I瓶裝有緩沖液的試劑瓶。所述固相載體由96孔聚苯乙烯試劑板組成。每一個試劑盒中的試劑足夠進行96次測定，既可進行一次連續(xù)多個樣品的檢測，也可以將板孔拆開多次檢測。檢測時，樣本中的磺胺二甲氧嘧啶將和微孔條包被層的磺胺二甲氧嘧啶偶聯(lián)抗原競爭磺胺二甲氧嘧啶單克隆抗體，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗抗體后，用底物顯色液顯色，樣本吸光度值與樣本中磺胺二甲氧嘧啶的殘留量成負相關，與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中磺胺二甲氧嘧啶殘留量。經(jīng)實驗表明本試劑盒具有很聞的靈敏度:檢測靈敏度為:1 P g/L。相對于其他橫胺二甲氧嘧啶檢測方法，本試劑盒所需儀器較少，同類實驗室一般均有配備，所需成本較低。本實用新型的有益效果是:能快速、簡便、靈敏、準確地用于動物源性食品中磺胺二甲氧嘧啶殘留量的檢測。


:圖1本實用新型試劑盒的固相載體一列微孔條圖。圖2本實用新型固相載體圖。圖3本實用新型盒體、下凹瓶位結構示意具體實施方式
:如圖1至圖3所示，磺胺二甲氧嘧啶檢測試劑盒，盒體I內具有固定模具形成的下凹瓶位2，下凹瓶位用于放置裝有溶液的試劑瓶，96孔聚苯乙烯試劑板組成的固相載體3，固相載體的微孔條4包括微孔5和包被層6，包被層由磺胺二甲氧嘧啶偶聯(lián)抗原組成，試劑瓶包括裝有磺胺二甲氧嘧啶單克隆抗體溶液的試劑瓶、裝有辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗抗體的試劑瓶。為了更有利于檢測磺胺二甲氧嘧啶殘留的檢測，試劑盒還可以包括有6瓶裝有磺胺二甲氧嘧啶標準液的試劑瓶，2瓶裝有底物顯色液的試劑瓶，I瓶裝有終止液的試劑瓶，I瓶裝有洗滌液的試劑瓶，I瓶裝有緩沖液的試劑瓶。試劑盒的試劑瓶內的具體成分如下:(I)磺胺二甲氧嘧啶單克隆抗體工作液7ml /瓶；(2)磺胺二甲氧嘧啶標準品溶液Iml/瓶，濃度分別為0μ g/L、l μ g/L、3l.! g/L、9 μ g/L、27 μ g/L、81μ g/L ；(3)辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗抗體工作液7ml/瓶；(4)底物顯色液，分別為底物顯色A液，底物顯色B液，底物顯色液A液為過氧化脲7ml/瓶，底物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺7ml/瓶；(5)終止液 7ml/瓶；(6)緩沖液50ml/瓶，為含有2-5%牛血清白蛋白、pH值為7.2,0.05-0.lmol/L磷酸鹽緩沖液。使用時2倍稀釋。(7)洗滌液 40ml/ 瓶，為含有 0.5-1.0% 吐溫 _80、0.5%。疊氮化鈉、0.05-0.lmol/L磷酸鹽緩沖液。使用時20倍稀釋。
試劑盒中用到的主要材料的制備方法:磺胺二甲氧嘧啶偶聯(lián)抗原的制備( I)磺胺二甲氧嘧啶偶聯(lián)抗原的制備將磺胺二甲氧嘧啶半抗原與人血清白蛋白通過混合酸酐法偶聯(lián)得到磺胺二甲氧嘧啶偶聯(lián)抗原。磺胺二甲氧嘧啶單克隆抗體的制備( I)動物免疫將免疫原(磺胺二甲氧嘧啶半抗原與牛血清白蛋白通過混合酸酐法偶聯(lián)得到)注入到Balb/c小鼠體內，免疫劑量為IOOyg/只，使其產(chǎn)生多克隆抗體血清。(2)細胞融合和克隆化小鼠血清測定結果較高后，取其脾細胞，按9:1比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，采用間接競爭ELISA測定細胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進行克隆化，直到得到分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。(3)細胞凍存和復蘇將磺胺二甲氧嘧啶單克隆雜交瘤細胞株用凍存液制成I X IO9個/ml的細胞懸液，在液氮中長期保存。復蘇時取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)。(4)單克隆抗體的生產(chǎn)與純化將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7天后腹腔注射磺胺二甲氧嘧啶單克隆雜交瘤細胞株5X IO7個/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進行腹水純化，-20°C保存。(5)羊抗鼠抗抗體的制備以羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病原體羊進行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。(6)辣根過氧化 物酶標記的羊抗鼠抗抗體的制備將羊抗鼠抗抗體與辣根過氧化物酶采用改良后的過碘酸鈉法進行偶聯(lián)得到。(一)使用磺胺二甲氧嘧啶檢測試劑盒檢測磺胺二甲氧嘧啶的操作步驟:1、取出需要數(shù)量的微孔板。2、加標準品/樣本:加標準品/樣本50 μ I到對應的微孔中，隨即加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗抗體50μ I/孔，在加入磺胺二甲氧嘧啶單克隆抗體工作液50μ I/孔，輕輕振蕩混勻，置25°C避光環(huán)境中反應60min。3、洗板:將孔內液體甩干，用洗滌工作液250 μ I/孔，充分洗滌4 — 5次，每次間隔IOs,用吸水紙拍干。4、顯色:加入底物液顯色液各50 μ I/孔，混勻，置25°C避光環(huán)境中反應30min。5、測定:加入終止液50 μ I/孔,混勻，設定酶標儀于450nm處測定每孔OD值。(二)結果判定(I)百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標準(O標準)的吸光度值，再乘以100%，即
權利要求1.一種磺胺二甲氧嘧啶檢測試劑盒，包括固相載體、放試劑瓶的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的試劑瓶，其特征在于:固相載體上設有微孔條，微孔條包括微孔、包被層；試劑瓶包括裝有磺胺二甲氧嘧啶單克隆抗體溶液的試劑瓶、裝有辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗抗體的試劑瓶。
2.如權利要求1所述的磺胺二甲氧嘧啶檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括7瓶裝有磺胺二甲氧嘧啶標準液的試劑瓶，2瓶裝有顯色液的試劑瓶，I瓶裝有終止液的試劑瓶，I瓶裝有洗滌液的試劑瓶，I瓶裝有緩沖液的試劑瓶。
3.如權利要求1所述的磺胺二甲氧嘧啶檢測試劑盒，其特征在于:所述固相載體由96孔聚苯乙烯試劑板組成。
專利摘要本實用新型涉及一種磺胺二甲氧嘧啶檢測試劑盒。該試劑盒包括固相載體、放試劑的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的試劑瓶，固相載體上設有微孔條，微孔條包括微孔、包被層，包被層由磺胺二甲氧嘧啶偶聯(lián)抗原組成；試劑瓶包括裝有磺胺二甲氧嘧啶單克隆抗體溶液的試劑瓶、裝有辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗抗體的試劑瓶。本實用新型試劑盒可用于磺胺二甲氧嘧啶的殘留量檢測，與儀器分析技術相比具有使用方便、高靈敏度、檢測樣本量大等特點。
文檔編號G01N33/577GK203069595SQ20122055740
公開日2013年7月17日 申請日期2012年10月29日 優(yōu)先權日2012年10月29日
發(fā)明者何方洋, 馮月君, 余厚美, 趙正苗, 羅貴昆, 劉福林, 蒲小容 申請人:北京勤邦生物技術有限公司