專利名稱：磺胺對甲氧嘧啶快速檢測試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及獸藥殘留免疫分析技術(shù)領(lǐng)域的一種快速檢測器具，特別是涉及 以微球金膠顆粒標記抗體的磺胺對甲氧嘧啶膠體金快速檢測試紙條。
背景技術(shù)：
磺胺對甲氧嘧啶(Sulfamethoxydiazine， SMD):別名為2-磺胺-5-甲氧嘧啶、長效 磺胺D、磺胺-5-甲氧嘧啶，在獸醫(yī)臨床是一種主要用以預(yù)防或治療細菌性傳染病的 廣譜抗菌素。在漁業(yè)、畜牧業(yè)的生產(chǎn)過程中，為了控制某些動物性疾病，促進動物 的生長發(fā)育及其轉(zhuǎn)化效率，提高畜禽和漁產(chǎn)品的產(chǎn)量， 一些生產(chǎn)者除將磺胺對甲氧 嘧啶作為亞治療的抗菌素外，還將其摻入詞料中作為添加劑，通過在日糧或飲水中 長期違規(guī)、過量使用，當人們食入這些含有磺胺對甲氧嘧啶的動物源性食品后，不 僅能誘發(fā)癌癥和腎功能衰竭等系列毒害，還可引起耐藥菌株的增加，嚴重危害人們 的身體健康(聶芳紅，徐曉彬，陳進軍。食品動物獸藥殘留的研究進展。中國農(nóng)學 通報，2006，22(9):71-75)，因此導(dǎo)致動物源性食品的藥物殘留檢測問題受到監(jiān)測部 門的高度重視。目前，測定磺胺對甲氧嘧啶的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣/質(zhì)聯(lián)用分 析法(GC/MS)、氣相色譜法、薄層色譜法等等。上述這些方法由于其試驗操作煩瑣、 時間長，需要經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)、有豐富經(jīng)驗的操作人員，所需的儀器設(shè)備也比較昂貴、 檢測成本高，受限于實驗室內(nèi)進行，難于在基層普及與推廣，更不適于現(xiàn)場、野外 的大規(guī)?？焖贆z測。酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)也是一種常用檢測技術(shù)，ELISA既 可檢測多個樣品，也可定性、定量檢測，但目前市場上尚無商品化的此試劑盒出售。 而且，ELISA需要一定操作經(jīng)驗的專業(yè)人員，其操作過程比較復(fù)雜，檢測時間比較 長，不同人員操作往往會出現(xiàn)不同的檢測結(jié)果，且須配套的酶標板閱讀儀器，很難 實施現(xiàn)場檢測。本實用新型的實用新型磺胺對甲氧嘧啶快速檢測試紙條，無須專業(yè)操作人員及 任何輔助類儀器，根據(jù)反應(yīng)所顯現(xiàn)的條帶兒分鐘內(nèi)即可進行結(jié)果判定，不僅操作簡
便、快速、結(jié)果直觀準確、投資少、成本低，易于在中小型企業(yè)、基層普及應(yīng)用， 且填補了目前市場上殘留藥物磺胺對甲氧嘧啶檢測試劑盒的空白。發(fā)明內(nèi)容本實用新型的目的是提供一種磺胺對甲氧嘧啶快速檢測試紙條，其檢測簡便快 捷，操作簡單，不需要特定儀器設(shè)備輔助，且成本低，易于在中小型企業(yè)、基層普 及與推廣應(yīng)用，同時適于現(xiàn)場快速檢測。本實用新型所述的一種磺胺對甲氧嘧啶快速檢測試紙條，包括支撐固定粘襯層、 載體反應(yīng)溶物吸附層，所述的支撐固定粘襯層上粘貼所述的載體反應(yīng)溶物吸附層， 所述的載體反應(yīng)溶物吸附層從樣品端起到手柄接觸端依次為樣品吸附纖維層、用于 吸附待測磺胺對甲氧嘧啶藥物的金標抗體溶液(Wi)纖維層、微孔虹吸反應(yīng)層、吸水 材料層；載體反應(yīng)溶物各吸附層之間相互交疊0.1cm;所述的微孔虹吸反應(yīng)層包括在 距前端lcm處用于偶聯(lián)磺胺對甲氧嘧啶的載體蛋白溶液(Xi)印制檢測印跡"一"或 "I "的微孔虹吸反應(yīng)層；以及在距底端lcm處用于對照印跡溶液(Yi)印制對照印跡 "一"或"I "的微孔虹吸反應(yīng)層。金標抗體溶液(Wi)可采用含有pH 8.2, 20 mM Tris-HCL緩沖保護溶液的微球金膠 顆粒標記磺胺對甲氧嘧啶單克隆抗體或多克隆抗體復(fù)合物。偶聯(lián)磺胺對甲氧嘧啶的 載體蛋白溶液(Xi)可采用含有pH7.2， 10mMPBS緩沖印跡溶液的載體蛋白與磺胺 對甲氧嘧啶結(jié)合的復(fù)合物，載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA)、或為雞卵清白蛋白 (OVA)，或為鐵蛋白(FE)，或為血藍蛋白(KLH)等。對照印跡溶液(Yi)可采用 含有pH 7.2， lOmMPBS山羊抗小鼠IgG或山羊抗兔IgG的緩沖印跡溶液。優(yōu)選的是，所述的支撐固定粘襯層為硬質(zhì)的不吸水塑膠片條或者硬質(zhì)的不吸水 紙片條。優(yōu)選的是，所述的樣品吸附纖維層為玻璃棉或厚濾紙。優(yōu)選的是，所述的微孔虹吸反應(yīng)層為硝酸纖維素反應(yīng)膜或者聚偏氟乙烯反應(yīng)膜。 優(yōu)選的是，所述的吸水材料層為強吸水紙。優(yōu)選的是，所述的金標抗體溶液(Wi)纖維層為吸附有微球金膠顆粒標記磺胺對 甲氧嘧啶抗體復(fù)合溶液的玻璃棉，在樣品吸附纖維層與金標抗體溶液(Wi)纖維層及 吸水材料層上覆蓋有PVC保護膜，在樣品吸附纖維層與金標抗體溶液(Wi)纖維層交 界處對應(yīng)的PVC保護膜偏向玻璃棉一側(cè)0.5cm處印制出標記線，如"Max"及"
標記線。優(yōu)選的是,所述的微孔虹吸反應(yīng)層上用載體蛋白溶液(Xi)印制檢測印跡和用對照 印跡溶液(Yi)印制對照印跡組合為以下排列"+ ，，、 "11"、 " + "、 "丁"、"卜"、"丄" 或者""l "。本實用新型所述的磺胺對甲氧嘧啶快速檢測試紙條具有以下優(yōu)點 (l)特異性強，敏感性高。本實用新型所述的磺胺對甲氧嘧啶快速檢測試紙條 是以微球金膠顆粒標記高親和力的單克隆抗體或多克隆抗體為基礎(chǔ)制備而成，金標 抗體中金顆粒與抗體通過異性電荷間的范德華力相結(jié)合，膠體金標記單克隆抗體或 多克隆抗體的特異性和親和力影響很小，且具有較高的標記率。因此，快速檢測試 紙條具有較高的特異性和敏感性。本實用新型制備的磺胺對甲氧嘧啶快速檢測試紙 條產(chǎn)品可檢測到IO ppb，且對磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺間 甲氧嘧啶、磺胺吡啶、克倫特羅、鏈霉素、氯霉素等藥物檢測無交叉反應(yīng)性。(2) 操作簡便、快速。使用快速檢測試紙條時無需其它任何試劑，只要將其插入待檢測樣品中15秒左右取出，在3分鐘內(nèi)即可檢測出結(jié)果。 '(3) 顯示檢測結(jié)果形象、直觀準確?？焖贆z測試紙條以顯示紅色或"II" 及"一"或"|"印跡作為檢測的陰性和陽性標記，即在微孔虹吸反應(yīng)層上顯示兩 條紅色"="或"II"印跡表示被檢測樣品溶液中磺胺對甲氧嘧啶含量少于10ppb， 一條紅色"—"或"I "印跡表示在被檢測樣品中磺胺對甲氧嘧啶的含量在IO ppb 以上，結(jié)果判定直觀、準確、不易出現(xiàn)假陰性和假陽性誤判。(4) 成本低、投資少。使用快速診斷試紙條，不需另配儀器設(shè)備，節(jié)約大量投 資，成本低，具有廣闊的市場前景和較大的經(jīng)濟、社會效益。(5) 易于大范圍推廣應(yīng)用。快速檢測試紙操作簡單，無須專業(yè)培訓(xùn)，按說明書 即可完成操作，易于普及，廣泛適用于食品專業(yè)檢驗、海關(guān)檢疫、衛(wèi)生防疫、獸醫(yī) 站、質(zhì)量監(jiān)測、畜產(chǎn)品加工、集約化養(yǎng)殖到個體養(yǎng)殖等各層次的需求。


圖l:為磺胺對甲氧嘧啶快速檢測試紙條結(jié)構(gòu)示意圖。圖中，l為支撐固定粘襯 層；2為微孔虹吸反應(yīng)層；3為金標抗體溶液(Wi)纖維層；4為樣品吸附纖維層；5為 吸水材料層；81、 82均為PVC保護膜。圖2:為磺胺對甲氧嘧啶快速檢測試紙條俯視結(jié)構(gòu)示意圖。圖中，6為檢測印跡； 7為對照印跡；9為標記線。圖3:為磺胺對甲氧嘧啶快速檢測試紙條結(jié)果判定示意圖。圖中，A檢測結(jié)果 判定為陰性；B檢測結(jié)果判定為陽性；C、 D檢測結(jié)果判定為試紙條無效。
具體實施方式
要制成磺胺對甲氧嘧啶快速檢測試紙條，首先需制備偶聯(lián)磺胺對甲氧嘧啶的載 體蛋白溶液(Xi)，用于印制檢測印跡，進而制備磺胺對甲氧嘧啶的金標抗體，用于 金標抗體溶液(Wi)纖維層，其次需制備山羊抗小鼠IgG抗體或山羊抗兔IgG抗體的對 照印跡溶液(Yi)，用于印制對照印跡。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本實用新 型。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本實用新型而不用于限制本實用新型的范圍， 下列實施例中未提及的具體實驗方法。通常按照常規(guī)實驗方法進行，如現(xiàn)代免疫 學技術(shù)(湖北科學技術(shù)出版社)、蛋白實驗技術(shù)指南、分子克隆等，或者按照制造廠 商所建議的條件或操作方法進行。 實施例材料(A) 磺胺對甲氧嘧啶，亞硝酸鈉，疊氮鈉，蔗糖，氯化鈉，磷酸氫二鈉，磷酸二 氫鉀，三羥甲基氨基甲烷，十二垸基硫酸鈉，鹽酸，牛血清白蛋白(BSA)， 雞卵清蛋白(OVA),鐵蛋白(FE)，血藍蛋白(KLH)， PEG，弗氏完全佐劑，弗 氏不完全佐劑均為SIGMA產(chǎn)品，HAT(次黃嘌呤、氨甲蝶呤和胸腺嘧啶核苷 T，簡稱為HAT培養(yǎng)基)及HT均為GIBCO產(chǎn)品。(B) SPF級實驗動物雌性BALB/C小鼠，6-8周齡，購自廣州中醫(yī)藥大學；山羊， 12周齡，雌性新西蘭大白兔，購置廣東省醫(yī)學實驗動物中心。(C) 硝酸纖維素反應(yīng)膜美國密理博(Millipore)公司生產(chǎn)，型號Hi-FlowPlus HF1賺405(D) 玻璃棉上海金標生物技術(shù)有限公司，型號SB06(E) 吸水紙美國密理博(Millipore)公司生產(chǎn)，規(guī)格AP22(F) 紙片條上海金標生物技術(shù)有限公司實施例一(制備實施例)1.偶聯(lián)磺胺對甲氧嘧啶的載體蛋白溶液(Xi)的制備(1)采用重氮偶合反應(yīng)，以500 nL 0.25 mol/L的H2S(V溶解10 mg磺胺對甲氧嘧啶，
取200 (aL 2% NaN02溶液緩慢滴入上述溶液，4'C反應(yīng)10 min。(2) 磁力撹拌條件下，將所得的混合液滴入2mL事先分別加入牛血清白蛋白(BSA)、雞卵清蛋白(OVA)、鐵蛋白(FE)、血藍蛋白(KLH)溶液中，用l mol/LNaOH調(diào)pH值到9.5, 4'C緩慢攪拌過夜，形成以偶氮鍵相聯(lián)的四種連接產(chǎn)物。(3) 得到的四種連接產(chǎn)物分別裝入透析袋，用10mMpH7.4的磷酸緩沖液透析三天， 每天換2次，以去除游離未結(jié)合的磺胺對甲氧嘧啶小分子后，置于冷凍干燥儀中 抽干，分裝后于-8(TC保存?zhèn)溆谩?4) 另將步驟(3)抽干的四種連接產(chǎn)物分別稱取1.5mg，用含有pH7.2， lOmMPBS 緩沖印跡溶液(含0.P/。SDS， 0.1%NaN3， 0.1% Tween 20)充分溶解，即為磺 胺對甲氧嘧啶與載體蛋白偶聯(lián)復(fù)合溶液(Xi)，分別為SMD-BSA、 SMD-OVA、 SMD-FE、 SMD-KLH的偶聯(lián)復(fù)合溶液，-2(TC保存以備用于微孔虹吸反應(yīng)層上的 印制檢測印跡。2. 磺胺對甲氧嘧啶多克隆抗體的制備采用新西蘭大白兔作為免疫動物，以上述合成的磺胺對甲氧嘧啶與載體蛋白 偶聯(lián)復(fù)合物為免疫原，免疫劑量為0.5mg/只。首免時將免疫原與等量的弗氏完全 佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點注射，間隔3周取相同劑量免疫原加等量 弗氏不完全佐劑混合乳化加強免疫.總共免疫6次，免疫期間監(jiān)測血清抗體效價 及特異性。最后一次免疫不加佐劑，于免疫后7 10天后頸動脈放血，收集兔血 清，37。C放置2h，再置于4 °C 2h后4000rmp離心收獲上清，通過間接ELISA 方法檢測其效價，結(jié)果表明，抗體血清效價為5xl06，與其他抗生素交叉反應(yīng)率 均小于0.01%。3. 磺胺對甲氧嘧啶單克隆抗體的制備(1)動物免疫免疫5只雌性Balb/C小鼠，另取5只做陰性對照。每次免疫以50嗎/只磺胺 對甲氧嘧使與載體蛋白偶聯(lián)復(fù)合物的劑量免疫小鼠。免疫程序采用兩次基礎(chǔ)免疫及三次加強免疫，將免疫抗原用生理鹽水稀釋， 第一次免疫用弗氏完全佐劑乳化的抗原注射于小鼠的頸背部皮下(多點)或腹腔 內(nèi)，第二次免疫取用弗氏不完全佐劑乳化好的抗原注射于小鼠的頸背部皮下(多 點)或腹腔內(nèi)，以后幾次加強免疫同上述第二次免疫，最后一次加強免疫時取不 加佐劑抗原尾靜脈或腹腔內(nèi)注射。每次加強免疫后第8 d尾部采血，分離血清，
用間接ELISA實驗來檢測抗血清的效價，選擇高效價血清的Balb/C小鼠，取其 脾細胞進行細胞融合。(2)雜交瘤細胞系的建立細胞融合步驟提前制備小鼠飼養(yǎng)細胞層，步驟為頸椎脫臼法將Balb/C小鼠 處死，用眼科剪刀剪開腹部皮膚，利用一次性注射器將不完全1640培養(yǎng)液注入小 鼠腹腔內(nèi)，反復(fù)抽吸幾次，最后將注入的液體全部吸出，放入50 ml離心管中， 3000 rmp離心10 min，用HAT培養(yǎng)液懸浮沉淀，混勻后以100 ^L/孔鋪入細胞培 養(yǎng)板中。融合的具體方法將SP2/0骨髓瘤細胞與前述免疫小鼠脾細胞以1 : 5的 細胞個數(shù)，在50mL離心管中混勻，1000 r/min，離心10 min，棄上清(可用滅 菌的濾紙吸干)；將裝有細胞混合物的離心管放于37"C水浴中。然后在1 min內(nèi)慢 慢滴入預(yù)溫至37'C的50% PEG 1 mL，邊加邊輕輕用吸管尖攪拌；繼續(xù)攪拌30 sec 后，靜置lmin;然后慢慢加入37'C預(yù)溫的RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液10mL。具體 方法第1 min逐滴滴人1 mL。第2min力QlmL，第3~4 min力B 3 mL，第5 min 加其余的5 mL，每次加時需緩慢加入，并不斷輕輕攪拌。最后緩慢加入30 mL 1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)液，1000rmp離心7min，去上清，于37。C放置5min;用HAT完全培 養(yǎng)基懸浮，同時也用HAT培養(yǎng)基懸浮飼養(yǎng)脾細胞，與融合后的細胞混合，根據(jù)需 要補加適量的HAT，接種于96孔培養(yǎng)板中，約200 ^L/孔，然后置于37 °C ， 5% C02 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。雜交瘤細胞系的建立提前制備飼養(yǎng)細胞(方法同上)，再將雜交瘤細胞從培 養(yǎng)孔內(nèi)輕輕地吹下，用血細胞計數(shù)板對活細胞進行計數(shù)；將細胞用1640完全培養(yǎng) 基分別稀釋到5、 10、 50個細胞/毫升，將上述三個濃度的細胞懸液分別加入已制 備好飼養(yǎng)細胞的96孔培養(yǎng)板中，100 pL/孔，使相應(yīng)的孔平均分別含有0.5、 l和 5個細胞；培養(yǎng)第4天可換液一次，從第5 6天仔細觀察各孔內(nèi)細胞的生長情況， 并記錄；在克隆后第7 9d，細胞克隆長滿培養(yǎng)孔l/3 l/2時，即可用間接競爭法 去進行抗體特異性的檢測，如檢出特異性抗體陽性孔，可選擇抗體效價高、呈單 個克隆生長、生長狀況良好的細胞，繼續(xù)進行再克隆。將陽性孔的細胞可移至24 孔培養(yǎng)板，并在相對應(yīng)的原孔中補加新鮮培養(yǎng)基，以防二者同時污染或細胞死亡， 待24孔板中的細胞生長良好時，可轉(zhuǎn)至lOOmL細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，并及時凍存。動物體內(nèi)誘生腹水的方法制備腹水，在接種雜交瘤細胞前1 2周，先給 Balb/C小鼠腹腔注射0.5 mL液體石蠟或弗氏不完全佐劑；將克隆成功的雜交瘤細
胞1000rmp離心，棄上清，細胞用1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液懸浮，并將細胞數(shù)調(diào)至lx106 個/mL，每只小鼠腹腔注射0.5mL雜交瘤細胞懸液；接種雜交瘤細胞后約10 d， 可見小鼠腹部明顯膨大，此時用碘酒、酒精棉球?qū)π∈蟾共科つw消毒后，用5ml 注射器抽取腹水；將腹水于4'C 1000rmp離心10min，取上清，分裝后置-20。C保 存。(3)單抗的純化腹水的純化取上述制備的腹水3ml，加入0.06 mol/LpH 4.8的醋酸緩沖液 6 ml，混勻后在室溫下邊攪拌邊加入99 pL辛酸，持續(xù)攪拌30 min，然后置于4 °C 靜止2 h以上。將溶液4 'CIOOO rpm離心30 min，取上清，用2 mol/L的NaOH 調(diào)節(jié)pH值至7.4，向上清溶液中邊攪拌邊加入等體積的飽和硫酸銨溶液，30min 后，4。C靜止2h以上。10000 rpm離心30 min，取沉淀溶于5 mLPBS (10 mM/L， pH7.4)中，混勻后置入0.01 mol/L的PBS中透析，4 。C透析兩曰，其中8 h換一 次液，兩日后取出透析袋中的溶液，收集的液體，經(jīng)紫外分光光度計測定其蛋白 含量后，按5 mg/mL分裝凍存于-8(TC保存。4. 山羊抗小鼠IgG或山羊抗兔IgG對照印跡溶液(Yi)的制備 以飽和硫酸銨鹽析法分別提取純化小鼠和健康家兔的血清IgG，后用pH7.2 10mM PBS緩沖液置于4"C冰箱內(nèi)過夜透析兩天，每天換液2次，以紫外分光光度計 測定其蛋白濃度，取小鼠血清IgG和兔血清IgG以50 ug - 100 ug/kg計算經(jīng)皮下和 肌肉注射免疫健康山羊3-4次，末次免疫7-IO天后靜脈采血，以ELISA酶聯(lián)免 疫法測定其血清抗體效價在1:5000以上，頸動脈放血收集血清。以飽和硫酸銨鹽析 法純化山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG抗體，后置于冷凍干燥儀抽干，分裝凍存于 -20°(:備用。5. 金標抗體溶液(Wi)及金標抗體溶液(Wi)玻璃棉的制備微球金膠顆粒采用檸檬酸三鈉化學還原法進行合成，&卩0.01%氯金酸水溶液250 ml在磁力加熱攪拌器中加熱沸騰后，迅速一次性加入iy。檸檬酸三鈉溶液4ml，溶液 顏色即變黑且漸向紫紅色轉(zhuǎn)變，直至顏色保持不變l min后，即制得顆粒大小為35-40 nm左右的微球金膠溶液。與抗體標記前以0.5 mol/L K2C03調(diào)金膠溶液pH值至8.2左 右，采用經(jīng)典NaCl滴定法確定金膠溶液與磺胺對甲氧嘧啶抗體的最佳標記量為lO pg/ml，抗體可為磺胺對甲氧嘧啶單克隆抗體,或為磺胺對甲氧嘧咬多克隆抗體。然 后按最佳抗體標記量進行標記，10 min后，加10% BSA至終濃度1 %，充分混勻靜置10min， 4°C 12000 rpm離心25 min，棄上清以除去未結(jié)合的微球金膠顆粒，沉淀用 pH 8.2， 20 mM Tris-HCL緩沖保護溶液(配制Tris 3.0285 g， HCL 0.35 ml， BSA 10 g， 蔗糖50 g， NaN32g， PEG2000 2 g,去離子水900 ml，用lMNaOH調(diào)pH至8.2后 加補去離子水至1000mL)進行重懸，即獲得金標抗體溶液(Wi)。將金標抗體溶液(Wi) 平鋪于纖維玻璃棉上，用涂布棒來回均勻分布，制得磺胺對甲氧嘧啶金標抗體溶液 (Wi)纖維玻璃棉，真空低溫冷凍干燥，鋁鉑封裝備用。6. 纖維層玻璃棉的處理將玻璃棉浸泡于0.01M pH7.4磷酸緩沖液(含P/。BSA， 0.1% PVP K-30， 0.2% NaN3)中30min后，置于37。C烘干備用。7. 微孔虹吸反應(yīng)層的包被分別稱取山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG抗體1.5mg，用pH7.2， 10mMPBS 緩沖印跡溶液(配制SDSlg， Tween20 1ml， NaN3 1 g，磷酸氫二鈉2.9g，磷酸 二氫鉀0.2 g，氯化鈉8 g，氯化鉀0.2 g，去離子水900 ml，用1 M NaOH調(diào)pH至 7.2后加補去離子水至1000 mL)充分溶解，在距底端1 cm處的微孔虹吸反應(yīng)層上 印制0.05 cm寬的對照印跡，在距底端1.5 cm處的微孔虹吸反應(yīng)層上用偶聯(lián)磺胺對 甲氧嘧啶的載體蛋白溶液(Xi)印制0.05 cm寬的檢測印跡，兩印跡之間的距離為5 mm，于冷凍干燥儀抽干，鋁鉑袋封裝備用。8. 試紙條的組裝將支撐固定粘襯層l、微孔虹吸反應(yīng)層2、金標抗體溶液(Wi)纖維層3、樣品吸附 纖維層4、吸水材料層5、 PVC保護層81和82按圖l所示的順序相互交疊0.1cm依次粘 貼在支撐固定粘襯層片條上，切成3mm寬的小條，真空鋁鉑袋封裝，4-3(TC保存， 有效期10個月。 實施例二 (應(yīng)用實施例)1.檢測樣品液的制備1) 蜂蜜檢測樣品溶液的預(yù)處理稱取2g待檢蜂蜜于離心管中；若檢測蜂王漿，則需再加入1 ml蒸餾水振蕩溶 解樣品，于離心管中加入2ml乙酸乙酯；劇烈振蕩5 8min后，移取上清0.9 ml 于試管中，在55t:下氮氣吹干或用電吹風吹干。加入0.3ml 10mMPBS，振蕩溶解管底殘留，待檢。2) 組織(水產(chǎn)品、畜產(chǎn)品)檢測樣品溶液的預(yù)處理取切碎的組織樣本，于均質(zhì)機中均質(zhì)nOOOOrpm/min) 1 min，稱取5 g均質(zhì)物
置于50 ml離心管中，加入大約5 ml蒸餾水和10 ml乙酸乙酯；充分振蕩大約10 min 后，移取上清4ml于試管中，55"C下氮氣吹千，用1 mOmMPBS溶解殘留物， 加入正己烷lml，振蕩lmin，靜置分層，吸取至少100 pL下層溶液待檢。3)牛奶檢測樣品溶液的預(yù)處理牛奶樣品經(jīng)3500 rpm離心10 min后，吸取中層牛奶3 ml加入6 ml乙酸乙酯上下 振蕩IO min，室溫2000 g離心10 min，取2 ml上層液體用氮氣吹干，用1 m110 mM PBS 緩沖液溶解殘留物，待檢。2.檢測及結(jié)果判定如圖2、圖3所示將磺胺對甲氧嘧啶檢測試紙條樣品端插入以上預(yù)處理的各待檢測樣品溶液中，插入深度不超過標記線9，待檢溶液經(jīng)玻璃棉7吸附濾過金標抗體 溶液(Wi)纖維玻璃棉3，與微球金膠顆粒標記的磺胺對甲氧嘧啶抗體結(jié)合形成復(fù)合 物，通過虹吸作用一起向微孔虹吸反應(yīng)層2移動，若待檢樣品溶液中磺胺對甲氧嘧啶 含量在IO ppb以上，則阻止金標抗體與微孔虹吸反應(yīng)層上偶聯(lián)磺胺對甲氧嘧啶的載 體蛋白溶液(Xi)的檢測印跡6結(jié)合，在檢測印跡6處不能顯示紅色條帶，而對照印跡7 含山羊抗小鼠IgG抗體或山羊抗兔IgG抗體則可與金標抗體結(jié)合，形成紅色對照條帶 印跡7" I "，結(jié)果判定為陽性(B);反之樣品溶液中磺胺對甲氧嘧啶含量低于10ppb， 則不能阻止金標抗體與微孔虹吸反應(yīng)層上偶聯(lián)磺胺對甲氧嘧啶的載體蛋白溶液(Xi) 的檢測印跡6結(jié)合，顯示紅色檢測印跡"l"，同樣山羊抗小鼠IgG抗體或為山羊抗 兔IgG抗體可與金標抗體結(jié)合，顯示紅色對照條帶印跡"I "，形成兩條紅色印跡"ll"， 結(jié)果判定為陰性(A);若質(zhì)控線印跡上沒有紅色條帶出現(xiàn)，則該檢測試紙條(C、 D) 無效。實施例三(應(yīng)用實施例)1. 特異性試驗按實施例二所述的方法進行試驗，將磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲氧瞎 啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺吡啶、克倫特羅、鏈霉素、氯霉素等藥物濃度稀釋為500 ppb，用本實用新型試紙條進行樣品檢測，微孔虹吸反應(yīng)層上檢測印跡6及對照印跡 7呈"II" (A)排列，結(jié)果為陰性，即為磺胺對甲氧嘧啶檢測試紙條與磺胺啼啶、磺 胺二甲嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺吡啶、克倫特羅、鏈霉素、 氯霉素等藥物無交叉性反應(yīng)。2. 敏感性試驗
用實施例二所述的方法，用本實用新型檢測試紙條分別檢測0 ppb、 5ppb、 8 ppb、 10ppb、 20ppb、 40ppb的磺胺對甲氧嘧啶標準品，重復(fù)10次，其中10ppb、 20ppb、 40ppb標準品檢測的微孔虹吸反應(yīng)層對照印跡7上出現(xiàn)一條出現(xiàn)紅色"I " (B)，即為陽性；Oppb、 5ppb、 8ppb的磺胺對甲氧嘧啶標準品檢測的微孔虹吸反 應(yīng)層2上的檢測印跡6與對照印跡7呈紅色"II" (A)排列，即為陰性。因此本實 用新型檢測試紙條的靈敏度為10ppb。3.均一性試驗用本實用新型檢測試紙條按實施例二所述的方法，對0ppb， 10ppb磺胺對甲氧 嘧啶分別進行10次平行檢測，反應(yīng)時間3 min時觀察結(jié)果，0 ppb檢測印跡條帶和 對照印跡紅色條帶均顯現(xiàn)，10ppb則顯示單一對照印跡紅色條帶，檢測顯色深度均 一，反應(yīng)結(jié)果一致。4.穩(wěn)定性實驗將鋁鉑袋真空包裝完好的試紙條置于37T:進行破壞性實驗，時間為30天，各 項指標均符合以上l-3項指標，即檢測其它藥物無交叉性反應(yīng)，靈敏度達10ppb， 檢測顯色深度均一，反應(yīng)結(jié)果一致。
權(quán)利要求1、一種磺胺對甲氧嘧啶快速檢測試紙條，包括支撐固定粘襯層、載體反應(yīng)溶物吸附層，所述的支撐固定粘襯層上粘貼所述的載體反應(yīng)溶物吸附層，其特征在于所述的載體反應(yīng)溶物吸附層從樣品端起到手柄接觸端依次為樣品吸附纖維層、用于吸附待測磺胺對甲氧嘧啶藥物的金標抗體溶液纖維層、微孔虹吸反應(yīng)層、吸水材料層；載體反應(yīng)溶物各吸附層之間相互交疊0.1cm；所述的微孔虹吸反應(yīng)層包括在距前端1cm處用于偶聯(lián)磺胺對甲氧嘧啶的載體蛋白溶液印制檢測印跡“-”或“｜”的微孔虹吸反應(yīng)層；以及在距底端1cm處用于對照印跡溶液印制對照印跡“-”或“｜”的微孔虹吸反應(yīng)層。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的檢測試紙條，其特征在于所述的支撐固定粘襯層為硬質(zhì)的不吸水塑膠片條或者硬質(zhì)的不吸水紙片條。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的檢測試紙條，其特征在于所述的樣品吸附纖維層為玻璃棉或厚濾紙。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的檢測試紙條，其特征在于所述的微孔虹吸反應(yīng)層為硝酸纖維素反應(yīng)膜或者聚偏氟乙烯反應(yīng)膜。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的檢測試紙條，其特征在于所述的吸水材料層為強吸 水紙。
6、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的檢測試紙條，其特征在于所述的金標抗體溶液纖維 層為吸附微球金膠顆粒標記磺胺對甲氧嘧啶單克隆抗體或多克隆抗體復(fù)合溶液的玻 璃棉，在樣品吸附纖維層與金標抗體溶液纖維層及吸水材料層上覆蓋有PVC保護膜，在樣品吸附纖維層與金標抗體溶液纖維層交界處對應(yīng)的PVC保護膜偏向玻璃棉一側(cè) 0.5cm處印制出標記線。
7、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的檢測試紙條，其特征在于所述的微孔虹吸反應(yīng)層上 用載體蛋白溶液印制檢測印跡和用對照印跡溶液印制對照印跡組合為以F排列"+ "、 "ir'、 " + "、 "t"、"卜"、"丄"或者"。
專利摘要本實用新型屬于獸藥殘留免疫分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及以微球金膠顆粒標記抗體的磺胺對甲氧嘧啶膠體金快速檢測試紙條。所述的試紙條包括支撐固定粘襯層、載體反應(yīng)溶物吸附層，所述的支撐固定粘襯層上粘貼所述的載體反應(yīng)溶物吸附層，所述的載體反應(yīng)溶物吸附層從樣品端起到手柄接觸端依次為樣品吸附纖維層、用于吸附待測磺胺對甲氧嘧啶藥物的金標抗體溶液纖維層、微孔虹吸反應(yīng)層、吸水材料層；載體反應(yīng)溶物各吸附層之間相互交疊0.1cm；所述的微孔虹吸反應(yīng)層包括在距前端1cm處用于偶聯(lián)磺胺對甲氧嘧啶的載體蛋白溶液印制檢測印跡“—”或“丨”的微孔虹吸反應(yīng)層；以及在距底端1cm處用于對照印跡溶液印制對照印跡“—”或“丨”的微孔虹吸反應(yīng)層。
文檔編號G01N33/558GK201016977SQ200720048998
公開日2008年2月6日 申請日期2007年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月2日
發(fā)明者何文智, 張惠勇, 曾令文, 想 李, 宇 程, 陳巧林, 靜 雷, 高愛中 申請人:中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院