專利名稱：：D-對羥基苯甘氨酸及其中間體的測定新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明所屬的
技術(shù)領(lǐng)域：
是醫(yī)藥化工中間體分析領(lǐng)域，本發(fā)明涉及的是P-內(nèi)酰胺類半合成抗生素阿莫西林，阿撲西林，頭孢羥氨芐，頭孢拉宗和頭孢匹胺等的側(cè)鏈D-對羥基苯甘氨酸(D-pHPG)及中間體的測定新方法。
背景技術(shù)：
：近年來，雙酶法合成D-pHPG已成為酶工程合成領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。目前，雙酶法合成中D-對羥基苯甘氨酸及其中間體N-氨甲?；?D-對羥基苯甘氨酸(NCD-pHPG)的定量測定主要采用HPLC法和TLC法等。HPLC法和TLC法測定效率不高，式樣處理麻煩。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所建立的方法則是根據(jù)Weatherbum提出的原理，利用雙酶法合成反應(yīng)混合物中NH/的增加量的摩爾數(shù)與D-pHPG生成量的摩爾數(shù)相等的性質(zhì)，以酚-次氯酸法測出NH4+增量從而確定D-pHPG含量；另以PDAB法測定NCD-pHPG的含量。具體實施例方式1.材料與方法1.1、儀器721分光光度計(上海第三分析儀器廠)，TG328A分析天平(上海天平儀器廠)，25iU微量進(jìn)樣器(上海醫(yī)用激光儀器廠)。1.2試劑1.2.1(NH4)2S04標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱取(NH4)2S04，配制成2mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，密封，冰箱保存?zhèn)溆谩?.2.2溶液A的配制準(zhǔn)確稱取苯酚2g和硝普鹽(二水合亞硝基鐵氰化鈉，Na2Fe(CN)3.N0.2H20)10g,溶于200ml蒸餾水中，即得溶液A。密封，冰箱保存?zhèn)溆谩?.2.3溶液B的配制準(zhǔn)確稱取NaOHlg，量取NaOCl溶液(含5.2%有效氯)1.68ml溶于100ml蒸餾水中，即得溶液B。密封，冰箱保存?zhèn)溆谩?.2.4NCD-pHPG標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱取NCD-NCD-pHPG，配制成4mmo1/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，密封保存?zhèn)溆谩?.2.5PDAB溶液的配.制準(zhǔn)確稱取PDAB(對二甲氨基苯甲醛溶液)，用6mol/L鹽酸配制成5%溶液，避光保存?zhèn)溆谩?.3分析方法1.3.1NH/標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別取(NH4)2SO4標(biāo)準(zhǔn)溶液0，2，4，6，8，10，12，14ul，加入到裝有5ml溶液A的8支試管中，各補(bǔ)加蒸餾水20，18，16，14,12，10，8,4p1，以Parafilm封口，劇烈震蕩混勻，再各加溶液B5ml，徹底混勻，37。C水浴lh取出，以加蒸餾水20ul的一管做空白，于625nm處測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.3.2NCD-pHPG標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取6支試管，分別加入NCD-pHPG標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.4，0.8，1.2,1.6，2.0ml.，補(bǔ)加蒸餾水至2.0ml，再加入2,0mlPDAB溶液，混勻，以加蒸餾水2.0ml的一管做空白，于438nm處測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.3.3雙酶法合成反應(yīng)混合物的測定操作方法將雙酶法合成反應(yīng)混合物稀釋適當(dāng)倍數(shù)，4000r/min離心30min，先取20ul上清夜，加入到裝有5ml溶液A的試管中，以下同1.3.1操作，于625nm處測吸光度，査標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得上清NH4+摩爾濃度，乘以稀釋倍數(shù)即為雙酶法合成反應(yīng)混合物樣品中NH/摩爾濃度，再測出雙酶法合成反應(yīng)零時混合物中NH/摩爾濃度，求出增加量，即得樣品中D-pHPG的摩爾濃度；另取0.5ml上清，向其中加入1.5m].蒸餾水和2.0mlPDAB溶液，以下同1.3.2操作，于438nm處測吸光度，査標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得上清NCD-pHPG摩爾濃度，乘以稀釋倍數(shù)即為雙酶法合成反應(yīng)混合物樣品中NH/摩爾濃度.2.結(jié)果2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸曲線先作如下?lián)Q算(NH4)2S04質(zhì)量體積濃度(mg/ml"2mg/mlX實家加ml數(shù)；NH/摩爾濃度d(mmol/L"質(zhì)量體積濃度/132.13X2X1000.以C,為橫坐標(biāo)，A^為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，相應(yīng)的回歸方程為:A62^0.0388d+0.014(產(chǎn)0.9993);在試驗中采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，分別準(zhǔn)確加入一定量的(NH4)2S04，稀釋適當(dāng)倍數(shù)后按雙酶法合成反應(yīng)混合物的測量的操作，代入回歸方程即可得出結(jié)果。2，2NCD-pHPG標(biāo)準(zhǔn)曲線與回歸曲線先作如下?lián)Q算NCD-pHPG摩爾濃度(mmol/L)Cf4mmol/LX實加ml數(shù).以C2為橫坐標(biāo),A438為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，相應(yīng)的回歸方程為:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>在試驗中采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，分別準(zhǔn)確加入一定量的NCD-pHPG，稀釋適當(dāng)倍數(shù)后按1.3.3操作，代入回歸方程即可得出結(jié)果?；貧w率實例在-5批體積均為100ml的雙酶法合成反應(yīng)混合物中，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法,分別準(zhǔn)確加入一定量的(NH4)2S04和NCD-pHPG,稀釋適當(dāng)倍數(shù)后按1.3.3操作，測定NH/和NCD-pHPG的含量，結(jié)果見表1.表一NH/和NCD-pHPG回歸實驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>2.4D-pHPG含量的HPLC驗證取3批雙酶法合成反應(yīng)混合物離心上清夜，HPLC法(固定相島津OLC-ODS,流動相10%乙腈，流速0.5ml/min，檢測波長214nm)測定其中的D-pHPG含量。結(jié)果列于表二，對二氨甲基苯甲醛(PDAB)比色法與液相色譜(HPLC)法比較，相對平均偏差為3.54表二D-pHPG的含量測定序號對二氨甲基苯甲醛(PDAB)比色法液相色譜(HPLC)法<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3.結(jié)論因此,本法在用于雙酶法合成中D-pHPG及其中間體NCD-PhPG的測定時，是準(zhǔn)確可靠的。權(quán)利要求1、D-對羥基苯甘氨酸及其中間體的測定新方法，利用721分光光度計(上海第三分析儀器廠)，TG328A分析天平(上海天平儀器廠)，25μl微二量進(jìn)樣器(上海醫(yī)用激光儀器廠)，其特征還包括以下步驟；試劑的準(zhǔn)備、NH4+標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制、NCD-pHPG標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制、PDAB溶液的配制、雙酶法合成反應(yīng)混合物的測量、分析結(jié)果幾個過程。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的D-對羥基苯甘氨酸及其中間體的測定新方法，其特征是所述的試劑的準(zhǔn)備為(1)(NH4)2S04標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱取(NH4)2S04，配制成2mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，密封，冰箱保存?zhèn)溆茫?2)溶液A的配制準(zhǔn)確稱取苯酚2g和硝普鹽(二水合亞硝基鐵氰化鈉，Na2Fe(CN)3.N0.2H20)10g,溶于200ml蒸餾水中，即得溶液A,密封，冰箱保存?zhèn)溆茫?3)溶液B的配制準(zhǔn)確稱取NaOHlg，量取NaOCl溶液(含5.2%有效氯)1.68ml溶于100ml蒸餾水中，即得溶液B。密封，冰箱保存?zhèn)溆茫?4)NCD-pHPG標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱取NCD-NCD-pHPG，配制成4mmo1/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，密封保存?zhèn)溆茫?5)PDAB溶液的配制準(zhǔn)確稱取PDAB(對二甲氨基苯甲醛溶液)，用6mol/L鹽酸配制成5%溶液，避光保存?zhèn)溆谩?、根據(jù)權(quán)利要求1所述的D-對羥基苯甘氨酸及其中間體的測定新方法，其特征是所述的NH4+標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制為分別取(NH4)2S04標(biāo)準(zhǔn)溶液0，2，4，6，8，10，12，14iU，加入到裝有5ml溶液A的8支試管中，各補(bǔ)加蒸餾水20，18，16，14,12，10，8，4ul，以Parafilm封口，劇烈震蕩混勻，，再各加溶液B5ml，徹底混勻，37-C水浴lh取出，以加蒸餾水20lU的一管做空白，于625nm處測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的D-對羥基苯甘氨酸及其中間體的測定新方法:.其特征是所述的NCD-pHPG標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制為取6支試管，分別加入NCD-pHPG標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0補(bǔ)加蒸餾水至2.0ml，再加入2.0mlPDAB溶液，混勻，.以加蒸餾水2.0ml的一管做空白，于438nm處測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的D-對羥基苯甘氨酸及其中間體的測定新方法，其特征是所述的雙酶法合成反應(yīng)混合物的測量為將雙酶法合成反應(yīng)混合物稀釋適當(dāng)倍數(shù)，4000i7min離心30min，先取20lU上清液，加入到裝有5ml溶液A的試管中，以下同1.3.1操作，于625nm處測吸光度，査標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得上清NH4+摩爾濃度，乘以稀釋倍數(shù)即為雙酶法合成反應(yīng)混合物樣品中NH4+摩爾濃度，再測出雙酶法合成反應(yīng)零時混合物中NH(+摩爾濃度，求出增加量，即得樣品中D-pHPG的摩爾濃度；另取0.5ml上清液，向其中加入L5ml蒸餾水和2.0mlPDAB溶液，以下同1.3.2操作，于438nm處測吸光度，査標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得上清液NCD-pHPG摩爾濃度，乘以稀釋倍數(shù)即為雙酶法合成反應(yīng)混合物樣品中NH/摩爾濃度。6、根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的D-對羥基苯甘氨酸及其中間體的測定新方法，其特征是所述的分析結(jié)果為；(1)先作如下?lián)Q算(NH4)2S04質(zhì)量體積濃度(mg/ml^2mg/mlX實際加入毫升數(shù)；NH/摩爾濃度d(mmol/Lh質(zhì)量體積濃度/132.13X2X1000;以C為橫坐標(biāo),A625為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，相應(yīng)的回歸方程為:A62^0.0388d+0.014(F0.9993);在試驗中采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，分別準(zhǔn)確加入一定量的(NH4)2S04,稀釋適當(dāng)倍數(shù)后按雙酶法合成反應(yīng)混合物的測量的操作，代入回歸方程即可得出結(jié)果。(2)NCD-pHPG標(biāo)準(zhǔn)曲線與回歸曲線先作如下?lián)Q算NCD-pHPG摩爾濃度(mmol/L)C2:4mmol/LX實加ml數(shù).以C2為橫坐標(biāo),A438為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，相應(yīng)的回歸方程為:A43f0.156C2+0.0018r(r=0.9999)。在試驗中采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，分別準(zhǔn)確加入一定量的NCD-pHPG,稀釋適當(dāng)倍數(shù)后按雙酶法合成反應(yīng)混合物的測量的操作，代入回歸方程即可得出結(jié)果。全文摘要本發(fā)明所屬的
技術(shù)領(lǐng)域：
是醫(yī)藥化工中間體分析領(lǐng)域，具體地說是涉及D-對羥基苯甘氨酸及其中間體的測定新方法，包括以下步驟；試劑的準(zhǔn)備、NH₄⁺標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制、NCD-pHPG標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制、PDAB溶液的配制、雙酶法合成反應(yīng)混合物的測量、分析結(jié)果幾個過程，該發(fā)明具有分析數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠的特點(diǎn)。文檔編號G01N21/25GK101363794SQ20071005492公開日2009年2月11日申請日期2007年8月9日優(yōu)先權(quán)日2007年8月9日發(fā)明者謝建中申請人:謝建中