三羥基異黃酮脂質納米體的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及三羥基異黃酮脂質納米體的制備方法。該方法的操作步驟如下：(1)將膽甾醇-水合物和大豆卵磷脂溶于三氯甲烷，水浴恒溫旋轉蒸發(fā)，得均勻薄膜；(2)將三羥基異黃酮溶于無水乙醇，再加入PBS緩沖液，得三羥基異黃酮混合液；(3)將三羥基異黃酮混合液、三顆玻璃小珠和吐溫-80加入到均勻薄膜，水浴恒溫旋轉洗膜；(4)水浴超聲，過微孔濾膜；(5)冷凍干燥，得到三羥基異黃酮脂質納米體固體。包封率大于59.5%，載藥量大于17.45%，三羥基異黃酮脂質納米體固體為顆粒均勻的粉狀固體，顆粒的平均粒徑為50～60nm，96％的脂質體粒徑在100nm以內(nèi)。三羥基異黃酮脂質納米體提高了三羥基異黃酮在體內(nèi)的生物利用率。
【專利說明】三羥基異黃酮脂質納米體的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及納米體領域，具體涉及三羥基異黃酮脂質納米體的制備方法。
【背景技術】
[0002]大豆異黃酮主要分布于大豆種子的子葉和胚軸中，但含量極少，并且提取極為困難，I噸大豆里也只能提取大約10公斤的大豆異黃酮，故有“植物軟黃金”之稱。目前發(fā)現(xiàn)的大豆中異黃酮共有12種，分為游離型的甙元和結合型的糖甙兩類，甙元占總量的2%。一3%，包括3種異黃酮苷元，分別為5，7，4’ -三羥基異黃酮(染料木素，Genistein,簡稱Gen)、7，4’ - 二羥基異黃酮(大豆黃素，Daidzein,簡稱Dai)和7，4’ - 二羥基-6-甲氧基異黃酮(黃豆黃素，Glycitein，簡稱Gly)，組成比例為5: 4:1。其中，產(chǎn)生生理活性的組分主要是三羥基異黃酮和大豆黃素，三羥基異黃酮的生理活性高于大豆黃素。大豆異黃酮被稱為“植物雌激素”，具有抗氧化、調(diào)節(jié)血脂、提高免疫力和抗輻射等諸多保健功效，在抗腫瘤、降血脂和對抗疾病方面有著重要的意義。但三羥基異黃酮難溶于水，機體內(nèi)細胞很難吸收，故生物利用度低，影響其在體內(nèi)的生物活性，并且其容易受外界環(huán)境(溫度、濕度、氧氣等)的影響，極大限制了它的活性和潛在的健康效益。
[0003]脂質納米體(脂質小囊)是近年研究較多的一種劑型，它制備簡單，應用方便，可多用途給藥，是一種具有同生物膜性質類似的磷脂雙份子層結構載體。普通脂質體(I-100 μ m)在應用中遇到一些局限性，原因在于其粒徑太大，難以穿透細胞，而納米尺寸的脂質體由于在穿透性能和體內(nèi)被動靶向性等方面有特殊的性質，可以保護藥物免受降解、直接達到靶向部位和減少毒副作用。
[0004]脂質體的膜材與哺乳動物細胞相似，無毒，具有良好的生物相容性。將三羥基異黃酮包裹進納米脂質體中，可以增加其在體內(nèi)的吸收，提高它的生物利用度。應用在保健食品和醫(yī)藥領域可以滿足人們對高品質營養(yǎng)物質的需求社會效益和經(jīng)濟效益，應用前景廣闊。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了提高三羥基異黃酮的穩(wěn)定性以及其在人體內(nèi)的吸收和生物利用度，本發(fā)明提供一種三羥基異黃酮脂質納米體的制備方法。
[0006]三羥基異黃酮脂質納米體的制備方法包括以下操作步驟:
(1)按重量比0.1-0.2: I取膽甾醇-水合物0.02g-0.04g和大豆卵磷脂0.2g，溶于20ml的三氯甲烷中，在避光的條件下，用旋轉蒸發(fā)器水浴恒溫旋轉蒸發(fā)，蒸發(fā)溫度37°C ；在容器內(nèi)壁形成均勻薄膜，繼續(xù)旋轉10-15分鐘，除去殘余溶劑備用；
(2)按三羥基異黃酮和大豆卵磷脂的重量比0.015-0.025: 1，取三羥基異黃酮
0.003-0.005g，溶于15 ml無水乙醇中混勻，再加入30 ml PBS緩沖液，PBS緩沖液的pH值為7.0，充分混合，得到45ml三羥基異黃酮混合液；
(3)將45ml三羥基異黃酮混合液、3-5顆玻璃小珠、0.05ml吐溫-80加入到步驟(I)內(nèi)壁有均勻薄膜的容器中，用旋轉蒸發(fā)器水浴恒溫旋轉洗膜3小時，洗膜溫度37°C ;得到脂質體懸浮液；
(4)將脂質體懸浮液在常溫下超聲10分鐘，經(jīng)過0.8 μ m的微孔濾膜，獲得三羥基異黃酮脂質納米體膜過濾溶液；
(5)將三羥基異黃酮脂質納米體膜過濾溶液冷凍干燥24小時，得到三羥基異黃酮脂質納米體固體；所述三羥基異黃酮脂質納米體固體的包封率分別為59.5-67.5%，載藥量為17.45-22.12%，三羥基異黃酮脂質納米體固體為顆粒均勻的粉狀固體，且顆粒間彼此分散、獨立，顆粒的平均粒徑為50-60nm，96%的脂質體粒徑在IOOnm以內(nèi)。
[0007]所述PBS緩沖液由濃度0.2M的十二水磷酸氫二鈉62ml、濃度0.2M的二水磷酸二氫鈉38ml配制而成。
[0008]所述玻璃小珠的直徑為5-6mm。
[0009]本發(fā)明的有益技術效果體現(xiàn)在以下方面:
本發(fā)明制備的產(chǎn)品以卵磷脂和膽固醇為包材，用旋轉蒸發(fā)制膜的方法包裹三羥基異黃酮得到其脂質納米體。該法制備的產(chǎn)品三羥基異黃酮的載藥量和包封率較高，且脂質體的粒徑達到納米級。
[0010]本發(fā)明的工藝采取添加不同比值的膽固醇與卵磷脂、三羥基異黃酮與卵磷脂，改變制膜和洗膜的溫度以及緩沖液PH值，分析產(chǎn)品的載藥量、包封率、穩(wěn)定性、粒徑及其分布，從而得到較高載藥量、包封率、穩(wěn)定性和較小粒徑的三羥基異黃酮脂質納米體。即當溫度為37°C，緩沖液pH值為7.0，膽固醇與卵磷脂之比為0.15: 1，三羥基異黃酮與卵磷脂之比為0.02: I時，三羥基異黃酮脂質納米體包封率為65.7%，且分布均勻、顆粒間彼此分散、獨立，96%的脂質體粒徑在IOOnm以下，透視電子顯微鏡下三羥基異黃酮脂質納米體固體的結構見圖1、激光粒度分析儀中三羥基異黃酮脂質納米體固體的粒度分布見圖2。
[0011]三羥基異黃酮脂質納米體在4°C下貯藏十天，滲漏率、pH值、粒徑平均范圍為50-60nm,穩(wěn)定性良好。
[0012]本發(fā)明所產(chǎn)生的三羥基異黃酮脂質納米體固體將有利于生物體對三羥基異黃酮的吸收，動物實驗兩種飼喂對比，小鼠肝臟中三羥基異黃酮脂質納米體的吸收率比單體三羥基異黃酮高出34.61%，提高了三羥基異黃酮在體內(nèi)的生物利用率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為三羥基異黃酮脂質納米體固體的透視電子顯微鏡圖。
[0014]圖2為激光粒度分析儀中三羥基異黃酮脂質納米體固體粒度分布圖。
[0015]圖3為三羥基異黃酮脂質納米體固體照片圖。
【具體實施方式】
[0016]下面結合實施例對本發(fā)明作進一步地說明。
[0017]以下實施例中所用主要原料的來源說明如下:98%三羥基異黃酮購于西安飛達生物科技有限公司；大豆卵磷脂購于上海源聚生物科技有限公司；膽留醇-水合物購于中國惠興生化試劑；所述PBS緩沖液由濃度0.2M的十二水磷酸氫二鈉62ml、濃度0.2M的二水磷酸二氫鈉38ml配制而成；十二水磷酸氫二鈉、二水磷酸二氫鈉均購自于國藥集團化學試劑有限公司。[0018]實施例1
(1)按質量比0.1: I取膽留醇-水合物0.02g和大豆卵磷脂0.2g，溶于20ml的三氯甲烷中，倒入圓底燒瓶中，在避光的條件下，用旋轉蒸發(fā)器水浴恒溫37°C旋轉蒸發(fā)，在燒瓶內(nèi)壁形成均勻薄膜，繼續(xù)旋轉約10分鐘后，除去殘余溶劑后備用；
(2)按三羥基異黃酮和大豆卵磷脂的重量比0.015: 1，取三羥基異黃酮0.003g，溶于15 ml無水乙醇中混勻，再加入30 ml的pH為7.0的PBS緩沖液，充分混合，得到45ml三羥基異黃酮混合液；
(3)將45ml三羥基異黃酮混合液、三顆玻璃小珠、0.05ml吐溫_80加入到形成薄膜的圓底燒瓶中，用旋轉蒸發(fā)器水浴恒溫37°C旋轉洗膜3小時，得到脂質體懸浮液；
(4)將脂質體懸浮液在常溫下(25°C)超聲10分鐘，過0.8 μ m的微孔濾膜，得到三羥基異黃酮脂質納米體膜過濾溶液；
(5)將三羥基異黃酮脂質納米體膜過濾溶液冷凍干燥24小時，得到包封率為59.5%、載藥量為20.23%的三羥基異黃酮脂質納米體固體。三羥基異黃酮脂質納米體固體為顆粒均勻的粉狀固體，見圖3，且顆粒間彼此分散、獨立，顆粒的平均粒徑為50-60nm，96%的脂質體粒徑在IOOnm以內(nèi)。
[0019]實施例2
(1)按質量比0.15: I取膽留醇-水合物0.03g和大豆卵磷脂0.2g，溶于20ml的三氯甲烷中，倒入圓底燒瓶中，在避光的條件下，用旋轉蒸發(fā)器水浴恒溫37°C旋轉蒸發(fā)，在燒瓶內(nèi)壁形成均勻薄膜，繼續(xù)旋轉約10分鐘后，除去殘余溶劑后備用；
(2)按三羥基異黃酮和大豆卵磷脂的重量比0.02: 1，取三羥基異黃酮0.004g，溶于15 ml無水乙醇中混勻，再加入30 ml的pH為7.0的PBS緩沖液，充分混合，得到45ml三羥基異黃酮混合液；
(3)將45ml三羥基異黃酮混合液、三顆玻璃小珠、0.05ml吐溫_80加入到形成薄膜的圓底燒瓶中，用旋轉蒸發(fā)器水浴恒溫37°C旋轉洗膜3小時，得到脂質體懸浮液；
(4)將脂質體懸浮液在常溫下(25°C)超聲10分鐘，過0.8μπι的微孔濾膜，得到三羥基異黃酮脂質納米體膜過濾溶液；
(5)將三羥基異黃酮脂質納米體膜過濾溶液冷凍干燥24小時，得到包封率為65.7%、載藥量為22.12%的三羥基異黃酮脂質納米體固體。三羥基異黃酮脂質納米體固體為顆粒均勻的粉狀固體，且顆粒間彼此分散、獨立，顆粒的平均粒徑為50-60nm，96%的脂質體粒徑在IOOnm以內(nèi)。在4°C下密封保藏十天，其滲漏率、pH值、粒徑的變化均不大，穩(wěn)定性良好。
[0020]實施例3
(1)按質量比0.2: I取膽甾醇-水合物0.04g和大豆卵磷脂0.2g，溶于20ml的三氯甲烷中，倒入圓底燒瓶中，在避光的條件下，用旋轉蒸發(fā)器水浴恒溫37°C旋轉蒸發(fā)，在燒瓶內(nèi)壁形成均勻薄膜，繼續(xù)旋轉約10分鐘后除去殘余溶`劑后備用；
(2)按三羥基異黃酮和大豆卵磷脂的重量比0.025: 1，取三羥基異黃酮0.005g，溶于15 ml無水乙醇中混勻，再加入30 ml的pH為7.0的PBS緩沖液，充分混合，得到45ml三羥基異黃酮混合液；
(3)將45ml三羥基異黃酮混合液、三顆玻璃小珠、0.05ml吐溫_80加入到形成薄膜的圓底燒瓶中，用旋轉蒸發(fā)器水浴恒溫37°C旋轉洗膜約3小時，得到脂質體懸浮液；
(4)將脂質體懸浮液在常溫下(25°C)超聲10分鐘，過0.8μπι的微孔濾膜，得到三羥基異黃酮脂質納米體膜過濾溶液；
(5)將三羥基異黃酮脂質納米體膜過濾溶液冷凍干燥24小時，得到包封率為67.5%、載藥量為17.45%的三羥基異黃酮脂質納米體固體。三羥基異黃酮脂質納米體固體為顆粒均勻的粉狀固體，且顆粒間彼此分散、獨立，顆粒的平均粒徑為50-60nm，96%的脂質體粒徑在IOOnm以內(nèi)。
[0021]最終產(chǎn)物表征特性:
向制備好的三羥基異黃酮脂質納米體固體中加入乙酸乙酯，萃取游離的三羥基異黃酮,2000r/min離心5min,分離乙酸乙酯和脂質體。相同操作重復3次。上層有機層用旋轉蒸發(fā)儀減壓回收(34°C )，殘留物用無水乙醇溶解定容為10ml，用紫外分光光度計法于260nm處測定吸光度并代入標準曲線方程，計算其所對應的三羥基異黃酮的量作為M#。按下式計算包封率:包封率=(M總一 M游)/M總X 100%。
[0022]1.隨著大豆異黃酮與卵磷脂之比增加，包封率可增加，但是進一步增加其比例，導致包封率下降。這說明脂質體的囊泡空間有限，對藥物的包埋具有飽和性。一旦藥物用量超過脂質膜飽和限度，部分藥物就有可能進入外面膠團中無法形成穩(wěn)定的脂質體。
[0023]2.膽固醇使用量較低時能夠增加脂質體雙分子層膜的致密度，使芯材被更多的包埋于脂質中，但膽固醇比例過大時，雙分子層結構剛性增強，形成的脂質體雙分子層膜的總表面積減小，破壞了雙分子組成，使包封率下降。
[0024]隨著溫度的升高，包封率有所增加，但是溫度進一步升高，導致包封率降低，這可能是由于升高溫度加速脂質 氧化降解，使磷脂雙分子層膜穩(wěn)定性降低。
【權利要求】
1.三羥基異黃酮脂質納米體的制備方法，其特征在于包括以下操作步驟: (1)按重量比0.1-0.2: I取膽甾醇-水合物0.02g-0.04g和大豆卵磷脂0.2g，溶于20ml的三氯甲烷中，在避光的條件下，用旋轉蒸發(fā)器水浴恒溫旋轉蒸發(fā)，蒸發(fā)溫度37°C ；在容器內(nèi)壁形成均勻薄膜，繼續(xù)旋轉10-15分鐘，除去殘余溶劑備用； (2)按三羥基異黃酮和大豆卵磷脂的重量比0.015-0.025: 1，取三羥基異黃酮0.003-0.005g，溶于15 ml無水乙醇中混勻，再加入30 ml PBS緩沖液，PBS緩沖液的pH值為7.0，充分混合，得到45ml三羥基異黃酮混合液； (3)將45ml三羥基異黃酮混合液、3-5顆玻璃小珠、0.05ml吐溫-80加入到步驟(I)內(nèi)壁有均勻薄膜的容器中，用旋轉蒸發(fā)器水浴恒溫旋轉洗膜3小時，洗膜溫度37°C ;得到脂質體懸浮液； (4)將脂質體懸浮液在常溫下超聲10分鐘，經(jīng)過0.8 μ m的微孔濾膜，獲得三羥基異黃酮脂質納米體膜過濾溶液； (5)將三羥基異黃酮脂質納米體膜過濾溶液冷凍干燥24小時，得到三羥基異黃酮脂質納米體固體；所述三羥基異黃酮脂質納米體固體的包封率分別為59.5-67.5%，載藥量為17.45-22.12%，三羥基異黃酮脂質納米體固體為顆粒均勻的粉狀固體，且顆粒間彼此分散、獨立，顆粒的平均粒徑為50-60nm，96%的脂質體粒徑在IOOnm以內(nèi)。
2.根據(jù)權利要求1所述的三羥基異黃酮脂質納米體的制備方法，其特征在于:所述PBS緩沖液由濃度0.2M的十二水磷酸氫二鈉62ml、濃度0.2M的二水磷酸二氫鈉38ml配制而成。
3.根據(jù)權利要求1所述的三羥基異黃酮脂質納米體的制備方法，其特征在于:所述玻璃小珠的直徑為5-6mm。
【文檔編號】B82Y5/00GK103446055SQ201310368915
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月22日 優(yōu)先權日:2013年8月22日
【發(fā)明者】范遠景, 黃婷, 劉佳林, 王瑞歡, 榮煜, 張鈴, 曹迪 申請人:合肥工業(yè)大學