本申請(qǐng)要求美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.62/014,964的優(yōu)先權(quán)。
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及納米囊泡，并且更具體地涉及包含磷脂、卟啉-磷脂結(jié)合物和包封疏水核的肽的納米囊泡。
背景技術(shù)：
：：近年來(lái)，已開(kāi)發(fā)了用于多種應(yīng)用，如生物傳感器、診斷生物探針和靶向藥物遞送的多功能納米顆粒。很大程度上，由于需要改善診斷和治療中的生物學(xué)特異性驅(qū)使這些努力。卟啉(是來(lái)自葉綠素的顏料)和它們的衍生物已證明對(duì)于光動(dòng)力學(xué)治療(PhotodynamicTherapy，PDT)和癌癥熒光成像是特別成功的(1-4)。然而，它們?cè)谏項(xiàng)l件下在水溶液中較差的溶解度妨礙了它們的臨床應(yīng)用(5)。已進(jìn)行了不斷的努力來(lái)將這些疏水性光敏劑包封或連接到多種納米顆粒，包括脂質(zhì)體、聚合物、金和二氧化硅納米顆粒以改善它們的系統(tǒng)遞送效率(6-8)。然而，包封方法對(duì)于攜帶卟啉分子具有限制，例如，脂質(zhì)體僅可以攜帶小于15摩爾％以保持納米結(jié)構(gòu)穩(wěn)定(6)。最近，我們已開(kāi)發(fā)了通過(guò)甚至100％卟啉-磷脂結(jié)合物自組裝的卟啉體(nanophysome)納米結(jié)構(gòu)(9)。在脂質(zhì)體-樣雙層膜中充分布置的具有高卟啉分子密度的穩(wěn)定納米結(jié)構(gòu)(100-150nm直徑)為卟啉體提供了超出卟啉單體的新型生物光子學(xué)(biophotonic)功能。其納米結(jié)構(gòu)-依賴性“超”-吸收(“super”-absorption)(消光系數(shù)ξ680＝2.9×109M-1cm-1)和光活性(photoactivity)的“超”淬滅(“super”-quenching)以極高的效率將光能轉(zhuǎn)化為熱，從而為它們提供了對(duì)于有機(jī)納米顆粒來(lái)說(shuō)前所未有的理想光熱和光聲性質(zhì)。受體-介導(dǎo)的納米顆粒吸收有利于卟啉體胞內(nèi)內(nèi)化和納米結(jié)構(gòu)破環(huán)，從而導(dǎo)致卟啉對(duì)于無(wú)創(chuàng)熒光成像和有效PDT的光活性恢復(fù)(10)。另外，對(duì)于無(wú)創(chuàng)PET成像，可以將放射性銅-64(64Cu)直接引入到預(yù)先形成的卟啉體的卟啉-脂質(zhì)構(gòu)建塊(buildingblock)中(11-12)。因此，卟啉-組裝的納米顆粒的固有多模態(tài)性特性(multimodalnature)為癌癥治療診斷學(xué)和臨床轉(zhuǎn)化提供了很大可能。尺寸范圍在100-150nm的卟啉體通過(guò)提高的滲透性和保留(EPR)作用在惡性腫瘤中顯示出優(yōu)先積累，但是在腫瘤內(nèi)可能會(huì)遇到對(duì)于足夠滲透的擴(kuò)散障礙。近期研究已證明與較大的對(duì)應(yīng)物相比，小于40nm的納米顆粒在滲透深入至纖維性腫瘤方面表現(xiàn)的更有效(13-15)。例如，Cabral等人比較了不同尺寸負(fù)載藥物的聚合物膠束(直徑30、50、70和100nm)在高度和較差可滲透性腫瘤中的積累和有效性。所有聚合物膠束滲透小鼠中高度可滲透腫瘤，但僅30nm膠束可以較差滲透可滲透胰腺腫瘤以實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用(14)。因此，尺寸較小(<30nm)的卟啉納米顆粒的開(kāi)發(fā)具有提高它們通過(guò)腫瘤間質(zhì)(interstitium)的擴(kuò)散輸送的可能，特別是在低滲透性腫瘤中，從而允許有效滲透和積累以實(shí)現(xiàn)治療相關(guān)濃度。然而，由于表面彎曲所導(dǎo)致的生長(zhǎng)不穩(wěn)定性，通過(guò)卟啉-脂質(zhì)自組裝產(chǎn)生較小卟啉體的嘗試仍具有挑戰(zhàn)。此外，本申請(qǐng)人提及了先前的PCT專利公開(kāi)No.11/044671、12/167350、13/053042、13/082702、13/159185、14/000062和09/073984，所有以上專利作為參考并入本文。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：在一個(gè)方面，提供了包含磷脂單層、卟啉-磷脂結(jié)合物和包封疏水核的肽的納米囊泡，其中所述肽包含能夠形成至少一種兩親性α-螺旋的氨基酸序列；所述卟啉-磷脂結(jié)合物包含優(yōu)選地在sn-1或sn-2位置共價(jià)連接到一種磷脂的脂質(zhì)側(cè)鏈的一種卟啉、卟啉衍生物或卟啉類似物；卟啉-磷脂結(jié)合物相對(duì)于磷脂的摩爾％為35％或更?。凰黾{米囊泡的直徑為35nm或更小。在一個(gè)方面，提供了在受試者中的靶區(qū)域上成像的方法，包括：提供本文所述的納米囊泡；將所述納米囊泡施用至所述受試者；和對(duì)所述靶區(qū)域成像。在一個(gè)方面，提供了本文所述的納米囊泡對(duì)受試者中靶區(qū)域，優(yōu)選地腫瘤進(jìn)行成像的用途。在一個(gè)方面，提供了對(duì)受試者中靶區(qū)域?qū)嵤┕鈩?dòng)力的方法，包括：提供本文所述的納米囊泡；向所述受試者施用所述納米囊泡；和在所述靶區(qū)域用光的波長(zhǎng)照射所述納米囊泡，其中所述光的波長(zhǎng)激活了卟啉-磷脂結(jié)合物以產(chǎn)生單線態(tài)(singlet)氧。在一個(gè)方面，提供了將疏水性試劑遞送至受試者的方法，包括提供本文所述的納米囊泡，其中所述疏水核包含所述試劑；和向所述受試者施用所述納米囊泡。在一個(gè)方面，提供了本文所述的納米囊泡用于遞送對(duì)受試者中靶區(qū)域進(jìn)行成像的疏水性試劑的用途，其中所述疏水核包含所述試劑。附圖說(shuō)明在參考附圖的下列詳細(xì)說(shuō)明中，本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式的這些和其它特征將變得更顯而易見(jiàn)，其中：圖1(a)在0.1μm過(guò)濾后，具有不同pyro初始輸入(pyro脂質(zhì)(pyrolipid)/總磷脂＝5％、10％、30％和50％)的制劑的直徑尺寸(體積分布峰值)。(b)每種制劑的卟啉熒光猝滅效率。淬滅％＝(1-FIPBS中完整/FI通過(guò)Triton破壞)×100％。圖2顯示了USPV的體積尺寸分布和TEM圖。圖3USPV的UV-vis和CD光譜。圖4顯示了(a)卟啉體和(b)在PBS中完整的或通過(guò)TritonX-100破壞的USPV的熒光光譜和單線態(tài)氧產(chǎn)生。圖5顯示了(a)通過(guò)細(xì)胞溶解測(cè)定所測(cè)量的U87細(xì)胞中卟啉體相對(duì)于USPV的細(xì)胞吸收。(b)用卟啉體和USPV(10μMpyro脂質(zhì)，孵育3h)孵育的細(xì)胞的共聚焦成像。圖6顯示了USPV、PEG-USPV和葉酸鹽-PEG-USPV的血液清除曲線。圖7顯示了在相同pyro脂質(zhì)濃度(200nmol)下注射(a)卟啉體和(b)USPV的具有9Lluc神經(jīng)膠質(zhì)瘤的小鼠的生物發(fā)光圖像(左圖)和原位熒光圖像(中間圖)和白光照片(右圖)。圖8顯示了(a)來(lái)自具有9Lluc神經(jīng)膠質(zhì)瘤的小鼠的腦的白光圖像(whiteimage)(左)和離體熒光圖像(右)，(b)確認(rèn)腫瘤區(qū)域(白色虛線圍繞(squired)區(qū)域)的相應(yīng)H&E結(jié)果。(c)來(lái)自9Lluc小鼠的冷凍組織切片的顯微圖像(左圖，藍(lán)色：DAPI，紅色：pyro)以及顯示腫瘤和對(duì)側(cè)健康腦的相同區(qū)域的相應(yīng)H&E結(jié)果(右圖)。圖9顯示了(a)USPV-DiR-BOA的體積尺寸分布。(b)USPV-DiR-BOA的UV-Vis吸光度，(c)熒光光譜和(d)PBS中完整的或被TritonX-100破壞的USPV-DiR-BOA的單線態(tài)氧產(chǎn)生。圖10顯示了(a)靜脈注射后24h，注射了USPV-DiR-BOA的具有U87神經(jīng)膠質(zhì)瘤的小鼠的白光照片和相應(yīng)原位熒光圖像。獲得pyro通道(Ex：575-605nm，Em：680-750nm)和DiR-BOA通道(Ex：725-755nm，Em：780-950nm)。(b)使用深紅色長(zhǎng)通(Ex：660nm，Em：689-900nm)激光探針獲得的代表性體內(nèi)熒光顯微圖像。通過(guò)除去顱骨，檢查了腫瘤和對(duì)側(cè)腦。(c)主要器官的離體熒光成像。圖像中的器官列出如下：A：肌肉，B：具有腫瘤的腦，C：肺，D：心臟，E：脾，F(xiàn)：腎，G：肝。圖11顯示a)64Cu-USPV使得能夠?qū)β殉舶┺D(zhuǎn)移進(jìn)行PET成像；轉(zhuǎn)移腫瘤和淋巴結(jié)的離體生物發(fā)光圖像b)和熒光圖像c)；通過(guò)泛細(xì)胞角蛋白(pancytokeratin)(AE1/AE3)染色圖像d)和H&E染色圖像e)確認(rèn)轉(zhuǎn)移組織。圖12顯示(a)具有表達(dá)GFP的深度腫瘤的腦的Maestro成像和熒光分子斷層術(shù)(FMT)成像結(jié)果。在注射后24h進(jìn)行成像。(b)腦橫切面的圖示。(c)通過(guò)GFP通道、pyro通道和DiR-BOA通道的熒光成像結(jié)果。圖13顯示了組織學(xué)和腫瘤切片顯微成像結(jié)果。圖14顯示了在圖像-引導(dǎo)的腫瘤去除之后，具有多病灶的腦的白光圖像、生物發(fā)光圖像和熒光圖像。圖15顯示了USPV-PDT治療期間的溫度監(jiān)控。圖16顯示了激光對(duì)照組以及使用不同光劑量的USPV-PDT治療組中腫瘤區(qū)域和周?chē)X的H&E和TUNEL結(jié)果。圖17顯示了使用不同光劑量的USPV-PDT治療組中腫瘤和周?chē)X的TUNEL定量結(jié)果。圖18顯示了兔HNC模型中USPV-實(shí)現(xiàn)的(USPV-enabled)原發(fā)瘤和淋巴引流(lymphaticdrainage)的無(wú)創(chuàng)檢測(cè)；a)HNC兔中USPV的藥物動(dòng)力學(xué)曲線(n＝4)；b)靜脈注射64Cu-USPV后24h，HNC兔的代表性PET/CT3D圖像(紅色箭頭：腫瘤，白色箭頭：局部淋巴結(jié))；c)通過(guò)PET體積分析定量的肌肉、腫瘤和淋巴結(jié)中的64Cu-USPV的分布。吸收表示為標(biāo)準(zhǔn)吸收值(SUV)。USPV的腫瘤和淋巴結(jié)吸收顯著高于肌肉吸收(n＝4，P<0.05)；d)通過(guò)γ-計(jì)數(shù)測(cè)量的HNC兔(n＝5)和健康兔(n＝3)的主要器官中64Cu-USPV的分布；e)PET/CT成像后，HNC兔的切除的腫瘤、局部淋巴結(jié)以及其它主要器官的離體熒光。LN代表淋巴結(jié)，SG代表唾液腺。圖19顯示了2DPET/CT成像的代表性軸位視圖、矢狀位視圖和冠狀位視圖，顯示了腫瘤(紅色箭頭)和局部淋巴結(jié)(白色箭頭)。圖20顯示了靜脈注射64Cu-USPV24h之后，腫瘤(a)和轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)(b)的代表性H&E、泛細(xì)胞角蛋白染色和熒光顯微成像。(比例尺：100mm)。圖21顯示了USPV-實(shí)現(xiàn)的熒光-導(dǎo)向的腫瘤和轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)切除。靜脈注射USPV后24h，兔中HNC腫瘤的體內(nèi)熒光成像：a)切開(kāi)前，皮膚完整；b)手術(shù)期間，除去皮瓣時(shí)；c)術(shù)后，手術(shù)床非熒光確認(rèn)程序完成；d)切除的腫瘤組織切片的代表性H&E，泛細(xì)胞角蛋白染色和熒光顯微成像；e)除去皮瓣時(shí)，哨位(sentinel)淋巴結(jié)的術(shù)中熒光成像；f)通過(guò)USPV熒光繪制的淋巴網(wǎng)絡(luò)圖。跟蹤從哨位淋巴結(jié)至局部淋巴結(jié)的淋巴流獲得了一系列放大圖像(位置1-5)；g)通過(guò)USPV檢測(cè)的切除的懷疑的淋巴結(jié)的組織切片的代表性H&E，泛細(xì)胞角蛋白染色和熒光顯微成像。圖22顯示了HNC兔中USPV-實(shí)現(xiàn)的PDT。a)靜脈注射USPV之后24h，2-步PDT激光輻照的圖示；USPV-PDT前后兔的代表性照片(b)和軸向CT圖像(c)；d)通過(guò)體積CT測(cè)量確定的平均腫瘤生長(zhǎng)曲線；從原始腫瘤區(qū)切除的組織的代表性H&E和泛細(xì)胞角蛋白染色(e)；和USPV-PDT之后34天切除的淋巴結(jié)(f)。所有組織顯示無(wú)惡性腫瘤。圖23顯示了激光輻照期間腫瘤的溫度變化。在激光對(duì)照組和USPV-PDT組的激光輻照期間，通過(guò)熱感相機(jī)監(jiān)控溫度。圖24顯示了激光治療后通過(guò)CT成像監(jiān)控腫瘤尺寸變化。激光或USPV施用之后顯示的具有腫瘤的兔的激光對(duì)照組和USPV對(duì)照組的代表性CT矢向圖像。圖25顯示了代表性CT矢向圖像，其顯示了治療后USPV對(duì)照、激光對(duì)照和USPV-PDT組的兔的局部淋巴結(jié)。圖26顯示了對(duì)USPV-PDT的毒性的評(píng)價(jià)。a)USPV施用前和USPV-PDT治療后1周和3周，兔的血液測(cè)定(n＝4)；b)來(lái)自USPV-PDT兔的主要器官，包括心、肺、肝、脾、腎上腺和肌肉的代表性H&E染色切片，表明腫瘤摘除之后對(duì)健康組織無(wú)副作用。具體實(shí)施方式在以下說(shuō)明中，描述了多個(gè)細(xì)節(jié)以透徹理解本發(fā)明。然而，應(yīng)理解可以在沒(méi)有這些細(xì)節(jié)的情況下實(shí)踐本發(fā)明。在本發(fā)明中，我們引入了含有疏水性藥物核的新型超小卟啉囊泡(USPV)，其被包埋卟啉脂質(zhì)的磷脂單層包膜并受ApoA-1模擬肽網(wǎng)絡(luò)限制。我們證明由肽網(wǎng)絡(luò)形成的α-螺旋結(jié)構(gòu)在限制尺寸和穩(wěn)定顆粒方面起到至關(guān)重要的作用。在功能上類似于卟啉體，具有卟啉-脂質(zhì)封裝密度(packingdensity)的35％的USPV具有固有的多模態(tài)性(multimodal)生物光子學(xué)性質(zhì)。超小尺寸的納米結(jié)構(gòu)(<30nm)驅(qū)使了足夠的吸收提高(消光系數(shù)ξ680＝7.8×107M-1cm-1)和有效的光學(xué)性質(zhì)淬滅，這導(dǎo)致了卟啉熒光的沉默和單線態(tài)氧的產(chǎn)生。因此，完整的USPV是光動(dòng)力學(xué)無(wú)活性的，而當(dāng)納米結(jié)構(gòu)破壞時(shí)，它將成為PDT活性的。同時(shí)，USPV的疏水核可以有效負(fù)載疏水性生物活性藥物，并且其有利的血液循環(huán)特性(小鼠中10h和兔中27h的循環(huán)半衰期)使其成為溫和的藥物遞送系統(tǒng)而無(wú)需PEG化。使用臨床相關(guān)的小鼠正位的神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤模型和兔正位的頭頸癌(HNC)兔模型，我們已證明USPV有利于藥物負(fù)載穩(wěn)定和腫瘤特異的遞送。64Cu標(biāo)記的USPV使得能夠追蹤納米顆粒及其藥物負(fù)載的體內(nèi)去向。通過(guò)術(shù)前PET和術(shù)中熒光成像，可以將原發(fā)瘤、轉(zhuǎn)移瘤和淋巴結(jié)以及腫瘤至局部淋巴結(jié)的淋巴引流清楚成像。此外，在全身施用后24h，高密度填充的卟啉的有效光學(xué)性質(zhì)活化使得能夠在神經(jīng)膠質(zhì)瘤小鼠和HNC兔中實(shí)施準(zhǔn)確熒光-引導(dǎo)腫瘤切除和有效PDT。應(yīng)注意本工作明顯不同于我們先前報(bào)道的處于其納米結(jié)構(gòu)的卟啉體(20nm相對(duì)于100nm，單層相對(duì)于雙分子層，疏水核相對(duì)于水性核，a-螺旋肽相對(duì)于PEG涂覆)和納米結(jié)構(gòu)-依賴性功能(快速相對(duì)于緩慢胞內(nèi)運(yùn)輸，光動(dòng)力學(xué)療法相對(duì)于光熱療法)。在一個(gè)方面，提供了包含磷脂單層、卟啉-磷脂結(jié)合物和包封疏水核的肽的納米囊泡，其中所述肽包含能夠形成至少一種兩親性α-螺旋的氨基酸序列；所述卟啉-磷脂結(jié)合物包含優(yōu)選地在sn-1或sn-2位置共價(jià)連接到一種磷脂的脂質(zhì)側(cè)鏈的一種卟啉、卟啉衍生物或卟啉類似物；卟啉-磷脂結(jié)合物相對(duì)于磷脂的摩爾％為35％或更??；所述納米囊泡的直徑為35nm或更小。適合的骨架肽可以選自由以下各項(xiàng)組成的組中：A、H、L和M類螺旋或其片段。適合的骨架肽還可以包括A、H、L和M類兩親性α-螺旋的反向肽序列或其片段，這是因?yàn)樾纬蓛捎H性α-螺旋的性質(zhì)是由肽序列內(nèi)氨基酸殘基的相對(duì)位置決定的。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述骨架肽具有包含脫脂蛋白的連續(xù)氨基酸的氨基酸序列，優(yōu)選地選自由以下各項(xiàng)組成的組中：apoB-100、apoB-48、apoC、apoE和apoA。在本發(fā)明中使用的“氨基酸”以及在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求中使用的該術(shù)語(yǔ)包括已知的天然存在的蛋白質(zhì)氨基酸，其通過(guò)它們常見(jiàn)的三字母縮寫(xiě)和單字母縮寫(xiě)表示。一般地，參見(jiàn)SyntheticPeptides:AUser′sGuide,GAGrant主編,W.H.Freeman&Co.,NewYork,1992，該文獻(xiàn)的教導(dǎo)內(nèi)容作為參考并入本文，包括11至24頁(yè)中描述的正文和表格。如上所述，術(shù)語(yǔ)“氨基酸”還包括天然存在的蛋白質(zhì)氨基酸的立體異構(gòu)體和修飾、非蛋白質(zhì)氨基酸、翻譯后修飾的氨基酸，酶促合成的氨基酸、衍生化氨基酸、設(shè)計(jì)成模擬氨基酸的構(gòu)建體或結(jié)構(gòu)等。一般地，在以上引用的SyntheticPeptides:AUser'sGuide；HrubyVJ,Al-obeidiFandKazmierskiW:BiochemJ268:249-262,1990；和TonioloC:IntJPeptideProteinRes35:287-300,1990中描述了修飾和非常規(guī)氨基酸；以上文獻(xiàn)的教導(dǎo)內(nèi)容作為參考并入本文?！唉?螺旋”在本文中用于表示蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中常見(jiàn)的基序。α螺旋(α-螺旋)是類似彈簧的卷曲構(gòu)象，其中每個(gè)主鏈的N-H基為之前4個(gè)殘基的氨基酸的主鏈C＝O基提供了氫鍵。通常，由天然存在的氨基酸組成的α螺旋將是右旋的，但是左旋構(gòu)象也是已知的?！皟捎H性的”是描述具有親水和疏水性質(zhì)的化合物的術(shù)語(yǔ)。兩親性α螺旋是生物活性肽和蛋白質(zhì)中常見(jiàn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)基序，并且表示具有沿該螺旋長(zhǎng)軸取向的相對(duì)的極性和非極性面的α螺旋。小的兩親性螺旋肽的實(shí)例包括WO09/073984中描述的那些。用于檢測(cè)和表征具有假定兩親性螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白結(jié)構(gòu)域的方法如Segrest,J.P.etal.inPROTEINS:Structure,Function,andGenetics(1990)8:103-117中所述，該文獻(xiàn)的內(nèi)容作為參考并入本文。Segrest等人已鑒別出7種不同種類的兩親性螺旋，并且還已鑒別出與每個(gè)種類有關(guān)的肽/蛋白。在7種不同的種類中，存在四種脂質(zhì)-相關(guān)的兩親性螺旋種類(A、H、L和M)。其中，表示脫脂蛋白類的A類具有對(duì)于形成磷脂類顆粒最優(yōu)的性質(zhì)。如本文所使用的，“磷脂”是具有包含磷酸酯基的親水性頭部基團(tuán)和疏水性脂質(zhì)尾的脂質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，卟啉-磷脂結(jié)合物相對(duì)于磷脂的摩爾％為35％或更小，30％或更小，25％或更小或者20-30％。在一些實(shí)施方式中，所述納米囊泡為基本球形的并且直徑為35nm或更小，直徑為25nm或更小，直徑為20-30nm之間或直徑為約25nm。在一些實(shí)施方式中，所述卟啉-磷脂結(jié)合物中的卟啉、卟啉衍生物或卟啉類似物選自由以下各項(xiàng)組成的組中：血卟啉、原卟啉、四苯基卟啉、焦脫鎂葉綠酸(pyropheophorbide)、細(xì)菌葉綠素、葉綠素a、苯并卟啉衍生物、四羥基苯基二氫卟酚、紫紅素、苯并二氫卟酚、萘并二氫卟酚、膽綠素(verdin)、玫紅素(rhodin)、酮二氫卟酚、氮雜二氫卟酚、菌綠素、甲苯基卟啉(tolyporphyrin)、苯并菌綠素、擴(kuò)展卟啉和卟啉異構(gòu)體。優(yōu)選地，所述擴(kuò)展卟啉為德克薩卟啉(texaphyrin)、薩普卟啉(sapphyrin)或六元卟啉(hexaphyrin)，并且所述卟啉異構(gòu)體為卟啉烯(porphycene)、反轉(zhuǎn)卟啉(invertedporphyrin)、酞菁或萘酞菁(naphthalocyanine)。在一些實(shí)施方式中，所述卟啉-磷脂結(jié)合物中的卟啉為焦脫鎂葉綠酸-a酸。在一些實(shí)施方式中，所述卟啉-磷脂結(jié)合物中的卟啉為細(xì)菌葉綠素衍生物。在一些實(shí)施方式中，所述卟啉-磷脂結(jié)合物中的磷脂包括磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸或磷脂酰肌醇。優(yōu)選地，所述磷脂包含12至22個(gè)碳的?；鶄?cè)鏈。在一些實(shí)施方式中，所述卟啉-磷脂結(jié)合物中的磷脂為1-棕櫚酰基-2-羥基-sn-甘油基(glycero)-3-磷酸膽堿或者1-硬脂?；?2-羥基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿。在一些實(shí)施方式中，所述卟啉-磷脂結(jié)合物為pyro-脂質(zhì)(pyro-lipid)。在一些實(shí)施方式中，所述卟啉-磷脂結(jié)合物為氧-細(xì)菌葉綠素-脂質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，所述卟啉通過(guò)0至20個(gè)碳的碳鏈接頭結(jié)合至磷脂上的甘油基。在一些實(shí)施方式中，所述卟啉-磷脂結(jié)合物包含其中螯合的金屬，可選地金屬的放射性同位素，所述金屬優(yōu)選地選自由以下各項(xiàng)組成的組中：Zn、Cu、Mn、Fe和Pd。在一些實(shí)施方式中，所述磷脂為陰離子磷脂。優(yōu)選地，所述磷脂選自由以下各項(xiàng)組成的組中：磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰甘油及其組合。在一些實(shí)施方式中，所述磷脂選自由以下各項(xiàng)組成的組中：1,2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷脂酸(DPPA)、1,2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿(DPPC)、1,2-二硬脂?；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DSPC)、1,2-二肉豆蔻?；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DMPC)、1,2-二山崳酰基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DBPC)、1,2-二花生四烯基-sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿(DAPC)、1,2-雙二十四烷?；?dilignoceroyl)-sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿(DLgPC)、1,2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-[磷-外消旋-(1-甘油)](DPPG)及其組合。在一些實(shí)施方式中，所述肽選自由以下各項(xiàng)組成的組中：A、H、L和M類兩親性α-螺旋、其片段以及包含所述A、H、L和M類兩親性α-螺旋的反向肽序列的肽或其片段。優(yōu)選地，所述肽由脫輔基蛋白的連續(xù)氨基酸組成，優(yōu)選地選自由以下各項(xiàng)組成的組中：apoB-100、apoB-48、apoC、apoE和apoA。在一些實(shí)施方式中，所述肽選自由以下各項(xiàng)組成的組中：2F(DWLKAFYDKVAEKLKEAF)、4F(DWFKAFYDKVAEKFKEAF)和上述的反向序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述肽是R4F肽(Ac-FAEKFKEAVKDYFAKFWD)。在一些實(shí)施方式中，至少一種兩親性α-螺旋或肽的長(zhǎng)度在6至30個(gè)氨基酸之間，8至28個(gè)氨基酸之間，10至24個(gè)氨基酸之間，11至22個(gè)氨基酸之間，14至21個(gè)氨基酸之間，16至20個(gè)氨基酸之間或者長(zhǎng)度為18個(gè)氨基酸?？梢詫⒍喾N疏水性生物活性劑或治療劑、藥物物質(zhì)或藥物包封在USPV核內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，所述疏水核包含疏水性診斷劑或治療劑，優(yōu)選地，紫杉醇、多西他賽、1,1'-雙十八烷基-3,3,3′,3'-四甲基吲哚三碳菁碘化物雙-油酸酯(DiR-BOA)。術(shù)語(yǔ)“治療劑”是本領(lǐng)域承認(rèn)的并且表示作為生物學(xué)、生理學(xué)或藥理學(xué)活性物質(zhì)的任何化學(xué)部分。在熟知的參考文獻(xiàn)中描述了治療劑(也稱為“藥物”)的實(shí)例，如MerckIndex、thePhysicians'DeskReference和ThePharmacologicalBasisofTherapeutics，并且它們無(wú)限制地包括藥劑；維生素；礦物質(zhì)補(bǔ)充劑；用于疾病或病的治療、預(yù)防、診斷、治愈或緩和的物質(zhì)；影響身體結(jié)構(gòu)或功能的物質(zhì)；或者前體藥物，在置于生理環(huán)境中后，它們成為生物學(xué)活性的或更加活性的?？梢允褂枚喾N形式的治療劑，其一旦施用于受試者，則能夠從受試者組合物中釋放到鄰近組織或流體中。“診斷”或“診斷劑”是可以用于診斷的任何化學(xué)部分。例如，診斷劑包括成像劑，如含有放射性同位素，如銦或锝的那些；含碘或釓的造影劑；酶，如辣根過(guò)氧化物酶、GFP、堿性磷酸酶或β-半乳糖苷酶；熒光物質(zhì)，如銪衍生物；發(fā)光物質(zhì)，如N-甲基吖啶鎓(N-methylacrydium)衍生物等。在一些實(shí)施方式中，所述納米囊泡是無(wú)PEG的。在一些實(shí)施方式中，所述納米囊泡還包含PEG，優(yōu)選地PEG-脂質(zhì)，進(jìn)一步優(yōu)選地PEG-DSPE。在一些實(shí)施方式中，所述納米囊泡還包含靶向分子。在一些實(shí)施方式中，所述納米囊泡還包含靶向分子，優(yōu)選地抗體、肽、適體或葉酸?！鞍邢蚍肿?targetingmolecule)”是例如，通過(guò)結(jié)合至靶細(xì)胞表面上的受體或其它分子，可以將納米囊泡導(dǎo)向至特定靶標(biāo)的任何分子。靶向分子可以是蛋白質(zhì)、肽、核酸分子、糖類或多糖、受體配體或其它小分子?？梢酝ㄟ^(guò)靶向分子的選擇來(lái)調(diào)節(jié)特異性程度。例如，抗體通常顯示出高特異性。這些可以是多克隆、單克隆、片段、重組或單鏈的，它們中許多是可商購(gòu)的或使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)易得的。在一個(gè)方面，提供了在受試者中的靶區(qū)域上成像的方法，包括：提供本文所述的納米囊泡；將所述納米囊泡施用至所述受試者；和對(duì)所述靶區(qū)域成像。在一個(gè)方面，提供了本文所述的納米囊泡對(duì)受試者中靶區(qū)域，優(yōu)選地腫瘤進(jìn)行成像的用途。在一個(gè)方面，提供了對(duì)受試者中靶區(qū)域?qū)嵤┕鈩?dòng)力學(xué)的方法，包括a.提供本文所述的納米囊泡；向所述受試者施用所述納米囊泡；和在所述靶區(qū)域用光的波長(zhǎng)照射所述納米囊泡，其中所述光的波長(zhǎng)激活了卟啉-磷脂結(jié)合物以產(chǎn)生單線態(tài)氧。在一些實(shí)施方式中，所述靶區(qū)域是腫瘤。在一個(gè)方面，提供了將疏水性試劑遞送至受試者的方法，包括：提供本文所述的納米囊泡，其中所述疏水核包含所述試劑；和向所述受試者施用所述納米囊泡。在一個(gè)方面，提供了本文所述的納米囊泡用于遞送對(duì)受試者中靶區(qū)域進(jìn)行成像的疏水性試劑的用途，其中所述疏水核包含所述試劑。當(dāng)與常規(guī)卟啉體相比時(shí)，USPV的可能優(yōu)勢(shì)包括在具有卟啉體功能(光熱、光聲、PET、MRI、CT等)的同時(shí)，更小，對(duì)于體內(nèi)穩(wěn)定性的PEG化更少的或沒(méi)有需要，提高的單線態(tài)氧和熒光激活和/或在核(例如，藥物、CT造影劑等)內(nèi)部引入疏水性有效載荷(payload)和在表面上引入siRNA的能力。通過(guò)以下實(shí)施例，進(jìn)一步說(shuō)明了本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)。僅出于說(shuō)明的目的提供了在本文中描述的實(shí)施例以及它們的具體細(xì)節(jié)，并且不應(yīng)將這些視為對(duì)本發(fā)明的權(quán)利要求的限制。實(shí)施例方法和材料材料1,2-二肉豆蔻?；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DMPC)、二硬脂?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-甲氧基(聚乙二醇)(DSPE-PEG2000)和1,2-二硬脂?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-葉酸酯(聚乙二醇)(葉酸酯-DSPE-PEG2000)購(gòu)自AvantiPolarLipidsInc.(AL,USA)。膽甾醇油酸酯(CO)購(gòu)自Sigma-AldrichCo.(MO,美國(guó))。根據(jù)先前報(bào)道的方案(16)制備1,1'-雙十八基-3,3,3',3'-四甲基吲哚三碳菁碘化物雙-油酸酯(DiR-BOA)和卟啉-脂質(zhì)(焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)縮寫(xiě)為pyro-脂質(zhì))。ApoA-1模擬R4F肽(R4F)、Ac-FAEKFKEAVKDYFAKFWD購(gòu)自GLBiochemLtd.(上海,中國(guó))。細(xì)胞培養(yǎng)基伊格氏最低必須培養(yǎng)基(EMEM)得自ATCC(美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(AmericanTypeCultureCollection),Manassas,VA)。胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)溶液和Hoechst33258均購(gòu)自Gibco-InvitrogenCo.(CA,美國(guó))。超小卟啉囊泡(USPV)的制備和表征USPV的合成通過(guò)在氮?dú)庀?，在氯仿中蒸發(fā)脂質(zhì)混合物制備脂質(zhì)膜。USPV的脂質(zhì)混合物由0.9μmol卟啉-脂質(zhì)、2.1μmolDMPC和0.3μmol膽固醇油酸酯組成。對(duì)于負(fù)載物質(zhì)的顆粒，將用作模型藥物的3mol％DiR-BOA加入至脂質(zhì)混合物，對(duì)于聚乙二醇化的USPV制劑(PEG-USPV)，將1％DSPE-PEG2000加入到脂質(zhì)混合物中，并且對(duì)于葉酸酯受體-靶向的USPV(葉酸酯-PEG-USPV)，將1％葉酸酯-DSPE-PEG2000加入到脂質(zhì)混合物中。用1.0mLPBS緩沖液(150mM，pH7.5)使完全干燥的脂質(zhì)膜水化，并在40℃以低頻率(30s開(kāi)/30s關(guān))超聲30個(gè)循環(huán)。將R4F肽(2.3mg，5mg/ml)滴定至再水化溶液中，并且一旦加入肽溶液，混濁的乳液變透明。將混合物在4℃保持震蕩過(guò)夜。隨后，將溶液以12,000rpm離心20分鐘，用0.1μm膜(Sigma-Aldrich)過(guò)濾上清液。USPV的尺寸和形態(tài)通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射(ZS90Nanosizer,MalvernInstruments)測(cè)量USPV的尺寸分布和ζ電位。使用Hitachi(日本)H-7000電子顯微鏡的透射電子顯微鏡術(shù)(TEM)用于確定顆粒形態(tài)和尺寸。USPV的激發(fā)和發(fā)射用PBS稀釋USPV作為完整/淬滅樣品，或者用0.5％TritonX-100在PBS中的溶液稀釋作為破壞/未淬滅的樣品。通過(guò)UV/Vis分光光度計(jì)Cary50(Agilent,Mississauga,ON)測(cè)量完整和破壞的USPV的吸收光譜，并且通過(guò)使用Fluoromax-4熒光計(jì)(HoribaJobinYvon,美國(guó))(激發(fā)：420nm，發(fā)射：600-800nm，狹縫寬度：5nm)測(cè)量它們的熒光。通過(guò)下式計(jì)算熒光猝滅效率：(1-FI完整/FI破壞)×100％，F(xiàn)I完整和FI破壞分別代表完整樣品和破壞樣品的熒光強(qiáng)度。USPV的單線態(tài)氧(1O2)產(chǎn)生使用SOSG測(cè)定測(cè)量USPV(完整和破壞兩種)的1O2產(chǎn)生。簡(jiǎn)要地，SOSG(1O2傳感器綠色試劑(1O2sensorgreenreagent)，MolecularProves,Inc.)溶液是在甲醇中新鮮配制的(5mM)并與USPV(完整樣品在PBS中，破壞樣品在0.5％TritonX-100中)混合(最終pyro濃度為1μM)以獲得6μM的最終SOSG濃度。用0.5J/cm2至10J/cm2的光通量(lightfluence)，在671nm下用發(fā)光二極管陣列處理樣品，然后通過(guò)在504nm激發(fā)和在525nm采集來(lái)測(cè)量SOSG熒光。在該發(fā)射窗內(nèi)，沒(méi)有卟啉熒光貢獻(xiàn)。定量細(xì)胞吸收研究和共聚焦顯微鏡檢查將U87GFP和U87luc細(xì)胞在具有10％FBS的伊格氏最低必須培養(yǎng)基(EMEM，)中培養(yǎng)。為了比較USPV相對(duì)于卟啉體的細(xì)胞吸收，對(duì)U87神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行定量細(xì)胞吸收研究。簡(jiǎn)要地，培育前24h，將U87GFP細(xì)胞以106個(gè)細(xì)胞/孔接種到6-孔板中，并在37℃，在10mM卟啉濃度下與卟啉體和USPV培育3h。用PBS漂洗3次后，將細(xì)胞胰蛋白酶解并將混懸液以4000rpm離心5分鐘。然后，將細(xì)胞顆粒在500μL裂解緩沖液中再懸浮并在冰上培育1h。將溶液以10,000rpm離心10min，并收集上清液用于通過(guò)熒光分光光度計(jì)的卟啉熒光測(cè)量以定量卟啉分子的細(xì)胞吸收。為了進(jìn)一步檢驗(yàn)USPV相對(duì)于卟啉體的熒光激活，在細(xì)胞培育之后實(shí)施共聚焦成像以監(jiān)控卟啉熒光隨時(shí)間的變化。培育前24h，將5×104個(gè)細(xì)胞/孔接種到8-孔盒式載玻片(chamberslide)中。在37℃，在10μM卟啉濃度下，將細(xì)胞與卟啉體和USPV培育3h，用PBS漂洗3次，并在新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基中再培育。在更換培養(yǎng)基后立即和3h、6h通過(guò)共聚焦顯微鏡檢查(OlympusFluoView1000,Laser633nm,Emat)對(duì)細(xì)胞成像。USPV作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤治療的治療診斷劑的評(píng)價(jià)。動(dòng)物準(zhǔn)備和腫瘤模型按照UniversityHealthNetwork指南，進(jìn)行所有動(dòng)物試驗(yàn)。對(duì)具有正位9Lluc膠質(zhì)肉瘤、U87GFP和U87luc神經(jīng)膠質(zhì)瘤的裸鼠進(jìn)行動(dòng)物研究。Nu/nu雌性裸小鼠購(gòu)自HarlanLaboratory并且在UniversityHealthNetwork的動(dòng)物研究中心中保留。為了建立模型，分別通過(guò)腹膜內(nèi)注射氯胺酮(ketamine)、賽拉嗪(xylazine)和乙酰丙嗪(acepromazine)(80mg/kg、5mg/kg和2.5mg/kg)使動(dòng)物麻醉。使用Dremel工具，在左半球制備直徑1mm的鉆孔，暴露硬膜但保持完整。將3uL培養(yǎng)基中的5×104個(gè)U87細(xì)胞或1×104個(gè)9L細(xì)胞注射至左半球。通過(guò)磁共振成象(MRI)，每周監(jiān)控腫瘤尺寸。當(dāng)腫瘤達(dá)到4-5mm直徑時(shí)，在接種后約18天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。血液清除研究將USPV、PEG-USPV和葉酸酯-PEG-USPV以2.5mg/kg的劑量(n＝4)靜脈內(nèi)注射至BALB/c小鼠。在注射之前和之后(5min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h和48h)，順序地從小鼠腿靜脈采集血液。將血液置于室溫30min以分離血漿，然后以12,000rpm的速度離心10min。通過(guò)熒光分光光度計(jì)(HORIBAScientificInc.)測(cè)量上清液的熒光以計(jì)算血液中卟啉的量(激發(fā)420nm，發(fā)射675nm，狹縫寬度：5nm)。然后，通過(guò)Graphpad分析每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的卟啉的量以計(jì)算顆粒的半衰期。體內(nèi)和離體熒光成像為了研究USPV體內(nèi)特異性腫瘤吸收和圖像-導(dǎo)向的藥物遞送能力，在全身施用后進(jìn)行熒光成像。在USPV施用前，對(duì)具有腫瘤的小鼠飼喂低-熒光飲食(Harlan產(chǎn)品號(hào)No.TD.97184)3天。然后，以10mg/kg卟啉含量的劑量通過(guò)尾靜脈注射USPV-DiR-BOA。使用Maestro成像系統(tǒng)(CRI，USA)，對(duì)pyro信號(hào)使用575-605nm激發(fā)/680-750nm發(fā)射濾片，對(duì)DiR-BOA信號(hào)使用725-755nm激發(fā)/780nm長(zhǎng)通發(fā)射濾片，采集熒光圖像。在注射后24h，在具有或不具有頭皮以及具有顱骨開(kāi)孔的情況下，體內(nèi)進(jìn)行熒光成像。將動(dòng)物處死后，收獲腦和主要器官，包括心臟、肺、肝、脾、腎、腎上腺和肌肉并進(jìn)行離體熒光成像。還對(duì)具有腫瘤的腦進(jìn)行FMT(熒光分子斷層術(shù)，PerkinElmerVisEnFMT2500LXQuantitativeTomographySystem,VisEnMedicalInc,Bedford,MA)成像和體內(nèi)共聚焦顯微鏡成像(LeicaFCM1000,Technology,Ex:660nm,Em689-900nm)。對(duì)于具有9Lluc-和U87luc神經(jīng)膠質(zhì)瘤的小鼠，成像前10min腹膜內(nèi)注射熒光素酶溶液。還進(jìn)行了體內(nèi)和離體生物發(fā)光成像。光動(dòng)力學(xué)療法對(duì)具有U87GFP腫瘤的小鼠，研究了USPV的PDT效力。包括四組：沒(méi)有任何治療的空白對(duì)照組；單獨(dú)的PDT激光；單獨(dú)的USPV注射；USPV加PDT激光治療。當(dāng)腫瘤直徑達(dá)到1至1.5mm時(shí)，以5mg/kg(根據(jù)卟啉含量計(jì)算)的劑量將USPV靜脈內(nèi)注射至動(dòng)物。注射后24h，用2％(v/v)異氟烷麻醉小鼠，并用671nm激光(DPSSLaserGlowTechnologies,Toronto,加拿大)輻照腫瘤。激光強(qiáng)度測(cè)量為50mW/cm2，斑點(diǎn)大小直徑9mm，并且治療區(qū)域直徑為3.5mm。在本研究中，應(yīng)用了37.5J/cm2和50J/cm2的光劑量。使用紅外熱感相機(jī)(Mikroshot,LUMASENSETechnologies)監(jiān)控單獨(dú)激光組和PDT處理組的腫瘤溫度變化，并且每個(gè)處理組使用n＝5計(jì)算(用于平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差)。組織學(xué)分析為了限定腫瘤邊緣，在離體熒光成像后將腦在液氮中冷凍，然后使用LeicaCM3050S低溫恒溫器將其切成5μm厚的切片。在UniversityHealthNetwork的病理研究項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)室，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行H&E染色。以20×放大，通過(guò)亮場(chǎng)顯微術(shù)觀察切片并照相。為了評(píng)價(jià)治療效力，收獲來(lái)自每個(gè)處理組的腦并在處理后24h，在10％甲醛中固定。實(shí)施H&E染色和TUNEL染色，隨后根據(jù)上述相同標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程進(jìn)行分析。組織切片顯微成像用含DAPI的封固溶液(mountingsolution)封固冷凍切片，并通過(guò)OlympusFV1000激光共聚焦掃描顯微鏡(Olympus,Tokyo,日本)和QuorumWaveFX轉(zhuǎn)盤(pán)式共聚焦顯微鏡(Yokogawa,日本)以激發(fā)波長(zhǎng)405nm(DAPI通道)、491nm(GFP通道)和633nm(Cy5.5通道)進(jìn)行成像。VX-2頰癌兔模型使用其它處所述的方法，開(kāi)發(fā)了VX-2頰鱗狀細(xì)胞癌模型(17，18)。簡(jiǎn)要地，在無(wú)菌條件下從剛安樂(lè)死的兔收獲腫瘤，并將其置于Hanks平衡鹽溶液(HBSS,Sigma)中，用無(wú)菌HBSS清洗2次，切成小塊，并在存儲(chǔ)在-80℃直至使用。為了獲得單個(gè)腫瘤細(xì)胞的混懸液，將腫瘤塊融化、切碎并擠壓通過(guò)70μm細(xì)胞過(guò)濾器(cellstrainer)。將300μL高密度單細(xì)胞混懸液(～5×106個(gè)/mL)注入到麻醉的新西蘭白兔(2.8-3.3kg)的頰肌(頰區(qū)域)。HNC兔的藥物動(dòng)力學(xué)研究腫瘤誘導(dǎo)后約2周，當(dāng)腫瘤尺寸達(dá)到1.5-2.0cm時(shí)，通過(guò)導(dǎo)管在耳緣靜脈向兔靜脈內(nèi)注射64Cu-USPV(對(duì)于卟啉，0.33mg/kg，～5mCi)。在注射后5分鐘以及0.5、1、4、8、21、30h采集動(dòng)脈血(n＝4)。在γ計(jì)數(shù)器(Wizard1480:PerkinElmerInc.,MA,美國(guó))上，作為濃度的函數(shù)確定了血漿的放射性。通過(guò)log-線性回歸確定了清除半衰期。HNC兔的PET/CT成像在64Cu-USPV(對(duì)于卟啉，0.33mg/kg，～5mCi)注射后24h，將兔麻醉并在MicroPET系統(tǒng)(Focus220:Siemens,Munich,德國(guó))上進(jìn)行PET成像，并在注射5mLOmnipaque350(GEHealthcare,MississaugaON)后在microCT系統(tǒng)(LocusUltra:GEHealthcare,英國(guó))上進(jìn)行CT成像。使用Amira(FEIVisualizationSciencesGroup,Bordeaux,法國(guó))記錄(register)并合并PET/CT圖像。通過(guò)InveonResearchWorkplace(Siemens,Munich,德國(guó))在合并的CT圖像上繪出感興趣區(qū)(volume)，并根據(jù)記錄圖像定量64Cu-USPV的標(biāo)準(zhǔn)吸收值(SUV)。HNC兔上USPV的生物分布和離體熒光成像在PET/CT成像后，切除兔器官，包括腫瘤、淋巴結(jié)、唾液腺、肺、心、肝、肌肉、脾和腎，稱重并在γ計(jì)數(shù)器上測(cè)量放射性。對(duì)于每只兔，將器官吸收計(jì)算為每樣品的總動(dòng)物質(zhì)量的百分比的注射劑量的百分比(SUV)。使用Maestro(CaliperLifeSciences,MA,美國(guó))，以黃色濾片設(shè)置(激發(fā)：575-605nm；發(fā)射：≥645nm檢測(cè)，200ms暴露時(shí)間)進(jìn)行離體熒光成像。兔組織病理和顯微成像將冷凍組織切片固定并分別用DAPI、H&E和泛細(xì)胞角蛋白染色處理。在掃描激光共聚焦顯微鏡(TISSUEscope4000,HuronTechnologies)上采集染色切片的高分辨率圖像。術(shù)中熒光成像在靜脈注射4mg/kgUSPV后24h，使用內(nèi)部熒光成像內(nèi)鏡系統(tǒng)(650±20nm激發(fā)，700±25nm發(fā)射)對(duì)VX-2兔進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光導(dǎo)向的手術(shù)。通過(guò)熒光導(dǎo)向，切除腫瘤和懷疑的淋巴結(jié)直至在動(dòng)物手術(shù)床上留下非熒光結(jié)節(jié)(nodule)。HNC兔上的PDT治療研究中包括4組VX-2兔：空白對(duì)照(n＝3)；單獨(dú)PDT激光(n＝3)；單獨(dú)USPV注射(n＝3)；USPV加PDT激光治療(n＝4)。當(dāng)腫瘤尺寸達(dá)到～300mm3時(shí)，對(duì)USPV組和USPV-PDT組(4mg/kg卟啉劑量)，對(duì)兔靜脈內(nèi)注射USPV。對(duì)于PDT治療，在注射后24h將兔麻醉并進(jìn)行兩步PDT程序。第一步是以125J/cm2的光劑量，200mW的激光功率和直徑15mm的輻照面積將激光輻照(671nm)直射在腫瘤外表面。使用紅外熱感相機(jī)監(jiān)控激光輻照期間腫瘤的溫度變化。第二處理步驟包括將光纜(9mm漫射光纖(diffuselaserfiber))插入到腫瘤中，從而以120J/cm2的光劑量和100mW的激光功率從腫瘤內(nèi)部輻照。治療后，將兔置于標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理規(guī)程并使用microCT掃描持續(xù)監(jiān)控腫瘤生長(zhǎng)。當(dāng)腫瘤尺寸達(dá)到5000mm3時(shí)，對(duì)兔進(jìn)行終末手術(shù)(Terminalsurgeries)。在所有4只USPV-PDT兔中，在治療后約30天，發(fā)現(xiàn)無(wú)腫瘤。在PDT后34-36天，將它們安樂(lè)死以進(jìn)一步評(píng)價(jià)治療效力。為了評(píng)價(jià)治療毒性，分別在注射后24h，PDT之前，PDT治療后1周和3周，對(duì)所有治療的兔進(jìn)行綜合的生物化學(xué)和血液學(xué)血液檢查。在終末手術(shù)之后，在治療后24h，收獲來(lái)自腫瘤區(qū)域以及其它主要器官的組織，進(jìn)行H&E和泛細(xì)胞角蛋白染色，并通過(guò)AperioImageScope成像以確定惡性腫瘤的殘留。兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理學(xué)家對(duì)于惡性腫瘤鑒別以及腫瘤根除確認(rèn)評(píng)價(jià)所有組織病理學(xué)切片。統(tǒng)計(jì)分析使用學(xué)生t檢驗(yàn)(雙尾)確定TUNEL和毒性研究中不同組之間差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。認(rèn)為P-值小于0.05是顯著的。結(jié)果與討論USPV的合成和表征我們產(chǎn)生了具有膽甾醇油酸酯疏水核的超小卟啉運(yùn)載體(USPV)，其被卟啉脂質(zhì)以及DMPC的磷脂單層包膜并受18個(gè)氨基酸的ApoA-1模擬肽限制。我們發(fā)現(xiàn)USPV的結(jié)構(gòu)和光物理性質(zhì)取決于卟啉-脂質(zhì)相對(duì)于DMPC的比值。如圖1所示，提高卟啉脂質(zhì)相對(duì)于DMPC的比值導(dǎo)致卟啉熒光猝滅升高和顆粒尺寸增加。當(dāng)該比值大于30％時(shí)，實(shí)現(xiàn)高熒光猝滅(>95％)并且顆粒尺寸仍控制在30nm以下。選擇具有30％mol卟啉-脂質(zhì)/70％molDMPC的USPV作為最佳USPV用于進(jìn)一步應(yīng)用研究，這是因?yàn)樗鼘?duì)于穩(wěn)定且單分散的USPV含有最大的卟啉脂質(zhì)，具有良好的尺寸(<30nm，圖2)，并且顯示出有效的熒光猝滅。USPV的吸收和圓二色(CD)光譜基于焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)(pyro-脂質(zhì))的吸光光譜，估計(jì)的USPV消光系數(shù)ε680為7.8×107cm-1M-1。這種提高的光吸收表明了USPV中高密度的卟啉環(huán)境。CD光譜確認(rèn)了USPV的α螺旋結(jié)構(gòu)(圖3)。熒光和單線態(tài)氧的產(chǎn)生通過(guò)在相同卟啉濃度下，將PBS中完整顆粒的熒光和單線態(tài)氧的產(chǎn)生與TritonX-100中其結(jié)構(gòu)破壞樣品相比較，研究了USPV的光學(xué)性質(zhì)。如圖4所示，與對(duì)于卟啉體所觀察到的類似，高密度卟啉環(huán)境極大地限制了USPV的熒光產(chǎn)生和單線態(tài)氧產(chǎn)生。當(dāng)與納米結(jié)構(gòu)-破壞的樣品相比時(shí)，USPV熒光淬滅100倍。一旦在寬范圍光通量(0.5-10J/cm2)下進(jìn)行PDT激光(671nm)輻照，與納米結(jié)構(gòu)-破壞的樣品相比，USPV顯示出2-3倍更少的單線態(tài)氧產(chǎn)生。因此，完整的USPV是光動(dòng)力學(xué)無(wú)活性的，而當(dāng)納米結(jié)構(gòu)破壞時(shí)，它將成為PDT活性的。USPV的細(xì)胞吸收以及體外熒光激活為了研究小型顆粒是否對(duì)胞內(nèi)吸收有利，通過(guò)測(cè)量細(xì)胞溶解緩沖液中的卟啉熒光信號(hào)，在U87神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中檢查了USPV和卟啉體的細(xì)胞吸收。與卟啉體相比，通過(guò)相同濃度卟啉培育之后，在U87細(xì)胞中，USPV10顯示出約10倍更高的吸收(圖5a)。通過(guò)共聚焦研究，進(jìn)一步評(píng)價(jià)了細(xì)胞中卟啉熒光激活。與細(xì)胞中卟啉體破環(huán)(它是耗時(shí)的方法，通過(guò)細(xì)胞中卟啉熒光逐漸未淬滅所證實(shí))不同，在與USPV培育3h之后U87細(xì)胞中立即觀察到強(qiáng)烈的卟啉熒光(圖5b)，并且熒光信號(hào)不會(huì)隨時(shí)間進(jìn)一步顯著提高?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明小型USPV不但有利于細(xì)胞內(nèi)化，而且還有利于細(xì)胞中光學(xué)性質(zhì)激活。血液清除為了檢查USPV的藥物動(dòng)力學(xué)曲線，對(duì)健康小鼠進(jìn)行血液清除研究。本研究包括3組：USPV、PEG-USPV(聚乙二醇化USPV)和活性靶向FR-USPV(葉酸酯受體-靶向USPV)。使用熒光測(cè)量，在施用后不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)量了血清中卟啉的濃度。如圖6所示，不考慮PEG化，USPV和PEG-USPV具有類似且良好的緩慢循環(huán)半衰期(分別地，對(duì)于USPV9.9h，對(duì)于USPV-PEG9.5h)，表明不需要PEG化來(lái)改善體內(nèi)循環(huán)，而PEG化對(duì)于大多數(shù)脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)來(lái)說(shuō)是改善它們體內(nèi)穩(wěn)定性所必不可少的。有趣地，與我們先前的觀測(cè)結(jié)果(卟啉體制劑中葉酸酯-脂質(zhì)的加入縮短了顆粒體內(nèi)循環(huán)時(shí)間)相反(10)，F(xiàn)R-USPV顯示出顯著延長(zhǎng)的緩慢半衰期(葉酸酯-USPV的13.3h相對(duì)于FR-卟啉體的<4h)。由于EPR作用在納米顆粒腫瘤積累中起重要作用，因此該延長(zhǎng)的循環(huán)將有益于來(lái)自血液循環(huán)的納米顆粒直接向組織的滲透，并且提高了顆粒在靶向患病區(qū)域中的保留。因此，與葉酸酯-卟啉體相比，對(duì)于FR-陽(yáng)性癌癥類型，預(yù)期FR-USPV將具有更有效的靶向遞送和更有效的光學(xué)性質(zhì)(熒光和單線態(tài)氧的產(chǎn)生)激活。USPV的腫瘤-特異性積累我們最近開(kāi)發(fā)了亞40nm卟啉脂質(zhì)納米盤(pán)(nanodisc)并且證明與較大尺寸的卟啉體(130nm)相比，在擴(kuò)散通過(guò)腫瘤富含膠原蛋白的基質(zhì)中，小型納米盤(pán)顯示出擴(kuò)散系數(shù)提高5倍(19)。在本發(fā)明中，我們研究了小型USPV相對(duì)于卟啉體的體內(nèi)遞送優(yōu)勢(shì)。以200nmol的卟啉濃度，對(duì)具有9Lluc神經(jīng)膠質(zhì)瘤的小鼠注射USPV(21nm)和卟啉體(130nm)，并且施用后24h，在麻醉下除去小鼠顱骨以暴露出腫瘤用于原位熒光圖像。如圖7中列所示，通過(guò)熒光成像，USPV和卟啉體可以清楚顯示腫瘤與周?chē)】档哪X，這與BLI成像所限定的腫瘤位點(diǎn)匹配良好(圖7，左列)。然而，來(lái)自施用USPV的腫瘤的熒光信號(hào)比施用卟啉體的要強(qiáng)的多，這表明超小USPV(<30nm)對(duì)提高腫瘤-特異性積累的益處。通過(guò)離體腦組織成像(圖8a)進(jìn)一步證明了USPV在9Lluc神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤中的腫瘤積累特異性，其中腦中熒光核與H&E組織學(xué)切片所示的腫瘤區(qū)域匹配良好(圖8b)。我們使用冷凍腦組織切片的共聚焦成像在顯微水平進(jìn)一步驗(yàn)證了USPV的腫瘤-特異性吸收，其中僅在腫瘤邊緣區(qū)域觀察到了強(qiáng)烈的卟啉信號(hào)，但是在對(duì)側(cè)腦區(qū)域中未觀察到(圖8c)。USPV用于藥物遞送的可能由于USPV具有包含被脂質(zhì)單層包圍的疏水核的核-殼納米結(jié)構(gòu)，因此其具有負(fù)載和安全遞送疏水性生物活性化合物的有利可能。在本研究中，將近紅外熒光疏水性染料DiR-BOA用作藥物替代物以檢驗(yàn)USPV的藥物負(fù)載能力和遞送性能。通過(guò)在USPV制劑(0.9μmol卟啉-脂質(zhì)，2.1μmolDMPC和0.3μmolCO)中加入0.5molDiR-BOA，將DiR-BOA成功負(fù)載到顆粒中，負(fù)載效率85％。由于在30天內(nèi)觀察了最小尺寸變化和可忽略的DiR-BOA滲漏，因此尺寸22.5nm的所得USPV(DiR-BOA)(圖9a)在4℃，在PBS中相當(dāng)穩(wěn)定。然后，我們研究了USPV(DiR-BOA)在具有正位U87神經(jīng)膠質(zhì)瘤的小鼠中的體內(nèi)行為。注射USPV(DiR-BOA)24h后，在麻醉的情況下，對(duì)小鼠進(jìn)行顱骨去除手術(shù)，并且使用CRIMaestroTM成像系統(tǒng)分別在卟啉通道(Ex：615nm，Em：680-750nm)和NIR藥物替代物通道(Ex：750nm，Em：780-950)進(jìn)行熒光成像。如圖10a所示，卟啉和DiR-BOA信號(hào)高度集中在腫瘤中，其清楚顯示了腫瘤邊緣，同時(shí)免去了附近健康的腦。另外，很好地共定位了這兩種熒光信號(hào)，這表明USPV(DiR-BOA)使得能夠選擇性地在腫瘤中穩(wěn)定且有效地遞送藥物替代物。更有趣地，這種高效遞送使得能夠使用深紅色長(zhǎng)通濾片，通過(guò)體內(nèi)熒光共聚焦顯微鏡檢查在顯微水平上熒光檢測(cè)腫瘤細(xì)胞，同時(shí)免去非熒光的對(duì)側(cè)腦細(xì)胞(圖10b)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證USPV的腫瘤-特異性積累，當(dāng)處死動(dòng)物時(shí)，通過(guò)熒光成像檢查了其組織生物分布。如圖10c所示，僅神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤和肝顯示出強(qiáng)烈的卟啉和DiR-BOA熒光信號(hào)，而其它器官顯示出可忽略的熒光，從而證明了USPV(DiR-BOA)極高的腫瘤-特異性吸收。與大部分納米顆粒遞送類似，USPV的高肝臟吸收可能是由于它們的肝膽清除(hepatobillaryclearance)所造成的。但是與包括卟啉體的大部分納米顆粒遞送不同，USPV的脾吸收要低得多，這可能受益于其超小尺寸，而這種超小尺寸有助于從網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的濾出中“逃離”。在所有檢測(cè)組織中卟啉熒光和DiR-BOA熒光之間良好的相關(guān)性(圖10c)進(jìn)一步證明了在全身遞送中結(jié)構(gòu)完整的USPV(DiR-BOA)在各種組織中的積累?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明1)USPV為癌療法提供了高度腫瘤選擇性的且有效的藥物遞送系統(tǒng)，同時(shí)預(yù)先滲漏和脫靶效應(yīng)最低；2)由于穩(wěn)定的遞送性質(zhì)，USPV的卟啉信號(hào)(如熒光)可以用于追蹤藥物遞送以指導(dǎo)治療計(jì)劃。用于PET成像的USPV的固有64Cu-標(biāo)記由于卟啉是多種金屬的強(qiáng)螯合劑，從而形成了高度穩(wěn)定的金屬?gòu)?fù)合物(20)。我們先前的研究證明了放射性銅64(64Cu)對(duì)卟啉體的卟啉-脂質(zhì)的穩(wěn)定螯合作用，這使得能夠?qū){米顆粒的體內(nèi)去向進(jìn)行PET成像(11-12)。使用類似的標(biāo)記方法，我們以高64Cu標(biāo)記效率(>95％)成功地將64Cu摻入了預(yù)先形成的USPV并隨后研究了其遞送行為。如圖11所示，64Cu-USPV能夠選擇性地挑出卵巢癌轉(zhuǎn)移，其中轉(zhuǎn)移腫瘤顯示出超亮的PET信號(hào)，而周?chē)M織，如輸卵管顯示出最低的信號(hào)。通過(guò)離體組織卟啉熒光成像進(jìn)一步確認(rèn)了PET成像-實(shí)現(xiàn)的腫瘤-特異性挑選，其與來(lái)自腫瘤細(xì)胞的生物發(fā)光信號(hào)良好相關(guān)。通過(guò)組織學(xué)分析進(jìn)一步鑒別出轉(zhuǎn)移組織。因此，USPV固有64Cu標(biāo)記使得能夠無(wú)創(chuàng)且準(zhǔn)確追蹤納米顆粒遞送并且另外由于其腫瘤-優(yōu)先積累而檢測(cè)腫瘤，因此顯示出臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化的巨大前景。另外，USPV可以容易地與其它金屬螯合。例如，對(duì)于MRI，順磁Mn3+離子的插入可以產(chǎn)生對(duì)比度(21)，并且在USPV中摻入鈀(Pd)可以進(jìn)一步改善單線態(tài)氧的產(chǎn)生以使PDT效力最大(22)。USPV用于熒光-導(dǎo)向的腫瘤切除術(shù)(FGR)的可能腫瘤的手術(shù)去除仍是臨床實(shí)踐中神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療的主流，并且結(jié)局影響患者的存活。手術(shù)程序中的主要挑戰(zhàn)在于確定陽(yáng)性邊緣。不充分的手術(shù)將導(dǎo)致腫瘤局部復(fù)發(fā)和搶救療法失敗，而過(guò)度切除將導(dǎo)致重要神經(jīng)功能的損失。因此，手術(shù)期間準(zhǔn)確限定切除邊緣對(duì)于腦是必不可少的。我們已證明在全身施用后24h，USPV(DiR-BOA)通過(guò)固有卟啉熒光和DiR-BOA信號(hào)顯示腫瘤和限定腫瘤區(qū)與周?chē)】的X的能力。然后，我們研究了其在熒光-導(dǎo)向的神經(jīng)膠質(zhì)瘤手術(shù)中的潛在應(yīng)用。為了模擬臨床情況，使用了正位U87GFP神經(jīng)膠質(zhì)瘤小鼠模型，其具有深度植入腦內(nèi)部的腫瘤(距頂部表面5mm)。如圖12a所示，在USPV(DiR-BOA)注射24h后，使用Maestro成像系統(tǒng)從完整腦的頂部表面未觀察到固有卟啉熒光和DiR-BOA熒光，但是通過(guò)FMT成像可以清楚檢測(cè)到兩種熒光信號(hào)。在圖12b中所示的橫切過(guò)程后，通過(guò)除去腦的頂部部分暴露出神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤。由于底部部分含有該實(shí)體瘤整體，因此將具有最少腫瘤殘余的頂部部分認(rèn)為是手術(shù)床。如圖12c所示，由于與腫瘤細(xì)胞的GFP熒光良好相關(guān)，因此卟啉和DiR-BOA信號(hào)能夠準(zhǔn)確顯像并限定腫瘤組織。然后，采集卟啉熒光組織并送去進(jìn)行組織學(xué)分析和冷凍組織切片。如圖13所示，H&E染色顯示了該組織的癌細(xì)胞形態(tài)。同時(shí)，冷凍組織切片在顯微水平顯示了GFP信號(hào)(來(lái)自腫瘤細(xì)胞)和卟啉信號(hào)(來(lái)自USPV)，進(jìn)一步確認(rèn)了USPV顯示腫瘤用于成像-導(dǎo)向的手術(shù)的能力。此外，USPV的卟啉熒光可以鑒別出尺寸范圍在4mm至小于1mm的通過(guò)小鼠腦分散的U87luc腫瘤的多個(gè)病灶，這些甚至通過(guò)MRI掃描也不能檢測(cè)。如圖14所示，移除的熒光病灶清楚地顯示出腫瘤細(xì)胞的固有生物發(fā)光信號(hào)?？偟膩?lái)說(shuō)，這些結(jié)果證明了USPV對(duì)于腫瘤鑒別的高特異性和靈敏度，從而為熒光-導(dǎo)向的神經(jīng)膠質(zhì)瘤手術(shù)提供了優(yōu)良的工具。USPV作為可激活光動(dòng)力學(xué)納米信標(biāo)的可能由于在完整納米結(jié)構(gòu)中USPV的熒光和單線態(tài)氧的產(chǎn)生高度淬滅并且在腫瘤中積累后可以快速恢復(fù)。我們廣泛研究了USPV對(duì)于體內(nèi)PDT的潛在應(yīng)用。USPV的熒光激活可以用作評(píng)價(jià)納米結(jié)構(gòu)破壞和單線態(tài)氧激活的有用指示物。如先前所提到的，在注射后24h，神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤顯示出顯著提高的卟啉熒光。然后，我們選擇該時(shí)間點(diǎn)用于激光輻照。簡(jiǎn)要地，在USPV注射24h后，以4mg/kg卟啉劑量，以50J/cm2或37.5J/cm2的光通量，通過(guò)小皮膚切口跨顱應(yīng)用激光輻照(671nm，50mW/cm2)。通過(guò)熱感相機(jī)實(shí)時(shí)監(jiān)控激光輻照期間的腫瘤溫度。治療后24h，處死動(dòng)物并將腦組織制備用于組織學(xué)分析和TUNEL染色。將僅接受激光輻照的具有神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤的小鼠和僅接受USPV的具有神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤的小鼠分別用作激光對(duì)照和USPV對(duì)照。對(duì)于所有激光治療組，未觀察到腫瘤溫度顯著提高(穩(wěn)定保持在27℃左右)，表明無(wú)有助于治療的光熱效應(yīng)(圖15)。在以50J/cm2或37.5J/cm2的光通量的USPV-PDT之后，腫瘤組織在H&E染色中顯示出致密的細(xì)胞核和細(xì)胞結(jié)構(gòu)損失，而來(lái)自USPV的腫瘤組織和激光對(duì)照保持不受影響(圖16)，表明USPV-實(shí)現(xiàn)了有效的PDT以及單獨(dú)的USPV和激光輻照的非侵害性。TUNEL染色進(jìn)一步確認(rèn)USPV-PDT引起了明顯的細(xì)胞凋亡，對(duì)于50J/cm2組，75.4％的TUNEL-陽(yáng)性細(xì)胞，對(duì)于37.5J/cm2組，82.1％的TUNEL-陽(yáng)性細(xì)胞(圖17)，而對(duì)于對(duì)照組未觀察到顯著的細(xì)胞凋亡。另外，USPV-PDT組的周?chē)X組織中無(wú)可觀察的組織學(xué)變化和細(xì)胞凋亡，這表明USPV-PDT所引起的副作用可忽略。因此，USPV能夠以極低的光劑量進(jìn)行腫瘤-特異性PDT同時(shí)保持正常健康，因而提供了安全的PDT治療規(guī)程。USPV對(duì)于大型動(dòng)物兔模型中頭頸癌(HNC)控制的臨床前應(yīng)用。HNC患者的低存活率可歸因于疾病診斷晚以及復(fù)發(fā)率高。目前的HNC分級(jí)面臨對(duì)于適當(dāng)治療控制，診斷的準(zhǔn)確度不夠且靈敏度低。具有PET固有多模態(tài)性(multimodalities)、熒光成像和PDT的USPV可以提供提高HNC分級(jí)準(zhǔn)確性以及改革HNC管理的巨大可能。使用在腫瘤誘導(dǎo)后可以一致地發(fā)展向局部淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移的臨床相關(guān)VX-2頰癌兔模型，我們研究了USPV對(duì)于HNC診斷和管理的能力。USPV-PET使得能夠在HNC兔模型中檢測(cè)原發(fā)瘤和哨位淋巴結(jié)將VX-2兔中64Cu-USPV的血液清除曲線對(duì)二室模型進(jìn)行擬合，其顯示出最長(zhǎng)達(dá)27.7h的有利的緩慢半衰期(圖18a)。因此，靜脈注射64Cu-USPV(0.34mg/kg卟啉，～5mCi)后24h，對(duì)VX2兔進(jìn)行PET成像以將其生物半衰期與放射性核素半衰期(64Cut1/2＝12.7h)相匹配。如PET/CT共配準(zhǔn)圖像(co-registered)(圖18b，圖19)所示，腫瘤和哨位淋巴結(jié)(SLN)具有高對(duì)比度，清楚可辨。與渲染圖像(renderedimage)一致，腫瘤和SLN顯示出與周?chē)∪庀啾蕊@著更高的根據(jù)PET興趣體積(volume-of-interest)(VOI)測(cè)量定量的標(biāo)準(zhǔn)吸收值(SUV)，其分別為3.58±0.53、2.57±0.53和0.35±0.02(n＝5，P<0.05，圖18c)。通過(guò)γ-計(jì)數(shù)法進(jìn)一步評(píng)價(jià)了主要器官中64Cu-USPV的分布，其顯示了具有腫瘤和健康兔中USPV類似的分布圖案(圖18d)。肝的相對(duì)較高的標(biāo)準(zhǔn)吸收值(SUV)(對(duì)于具有腫瘤和健康的兔分別為9.34±0.92SUV和10.54±1.68SUV)可能是由于64Cu-USPV的肝膽清除造成的。然而，考慮到肝距頭頸區(qū)相對(duì)遠(yuǎn)的位置，這種高吸收將不會(huì)影響HNC檢測(cè)。根據(jù)γ-計(jì)數(shù)，腫瘤和SLN的平均吸收分別為3.14±0.26SUV和2.21±0.26SUV(圖18d，n＝5)，這與它們從PET圖像VOI定量獲得的相應(yīng)SUV一致(圖18c)。具有腫瘤的兔的SLN顯示出比健康的兔顯著更高的吸收(0.87±0.13SUV，n＝3，P<0.01)，這可能是由于淋巴流升高以及存在通過(guò)H&E分析和泛細(xì)胞角蛋白(PanCK)染色所鑒別的轉(zhuǎn)移性病變所造成的(圖20)。因此，64Cu-USPV能夠描繪來(lái)自健康個(gè)體的惡性SLN。以下切除組織的離體熒光成像進(jìn)一步確認(rèn)了具有腫瘤的兔的腫瘤和引流SLN中USPV顯著較高的積累和熒光激活(圖18e)。盡管64Cu-USPV的積累相對(duì)較高，但是唾液腺中觀察到的熒光信號(hào)是可忽略的(圖18e)，這可能是由于盡管USPV像其它PET圖像試劑(例如，18F-FDG)一樣在唾液腺中非特異性地積累，但是它保持完整且無(wú)熒光的事實(shí)。這些結(jié)果表明通過(guò)進(jìn)行PET和熒光成像，USPV能夠?yàn)檗D(zhuǎn)移性淋巴結(jié)的精確檢測(cè)提供補(bǔ)充信息，并且可以在唾液腺低背景熒光條件下，潛在地用于圖像-導(dǎo)向的淋巴結(jié)切除術(shù)。原發(fā)瘤和轉(zhuǎn)移性疾病的熒光-導(dǎo)向的切除術(shù)通過(guò)利用USPV在腫瘤和轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中的選擇性熒光激活，我們?cè)u(píng)價(jià)了USPV作為熒光術(shù)中指導(dǎo)在具有腫瘤的兔中用于原發(fā)瘤和SLN的手術(shù)切除術(shù)的能力。如圖21a所示，與周?chē)M織相比，在體內(nèi)熒光成像系統(tǒng)下腫瘤(具有完整皮膚)對(duì)于顯像是充分熒光的。在手術(shù)探索期間，一旦提起皮瓣，則腫瘤暴露并且通過(guò)卟啉熒光清楚顯示(圖21b)。通過(guò)熒光導(dǎo)向，手術(shù)除去檢查周?chē)袘岩傻膼盒阅[瘤。手術(shù)床顯示出可忽略的熒光信號(hào)，表明腫瘤完全切除(圖21c)。通過(guò)組織學(xué)分析確認(rèn)切除的組織是惡性的(圖21d)。組織的組織學(xué)切片中的卟啉熒光與癌細(xì)胞形態(tài)以及陽(yáng)性PanCK染色對(duì)應(yīng)良好，這表明USPV熒光在細(xì)胞水平以顯著的特異性和準(zhǔn)確性突出顯示了原發(fā)瘤(圖21d)。同樣地，USPV熒光還描繪了體內(nèi)引流SLN(圖21e)。值得注意地，通過(guò)熒光信號(hào)精巧地繪制了從原發(fā)瘤至SLN以及至局部淋巴結(jié)的淋巴網(wǎng)絡(luò)(圖21f)。按照淋巴網(wǎng)絡(luò)的取向(放大圖像，圖21f中的位置1-5)，鑒別了繼發(fā)性陽(yáng)性淋巴結(jié)(secondarypositivelymphnode)和淋巴擴(kuò)散圖案。組織學(xué)研究確認(rèn)了淋巴結(jié)中的轉(zhuǎn)移，并且在PanCK陽(yáng)性區(qū)中觀察到了強(qiáng)烈的卟啉熒光，這表明了轉(zhuǎn)移性區(qū)域中USPV的吸收(圖21g)?？傊?，USPV熒光不但清楚地描繪了原發(fā)瘤和惡性淋巴結(jié)，而且還描繪了區(qū)域淋巴網(wǎng)絡(luò)，這可以潛在地有助于HNC患者的結(jié)節(jié)分級(jí)，并且在切除術(shù)和病理學(xué)分析之前顯示惡性淋巴結(jié)。USPV-實(shí)現(xiàn)的PDT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡對(duì)HNC兔評(píng)價(jià)了USPV-PDT的長(zhǎng)期治療效果。將平均腫瘤尺寸300mm3的具有腫瘤的兔分為4組，其包括空白對(duì)照(n＝3)、僅激光的對(duì)照(n＝3)，僅USPV的對(duì)照(n＝3)和USPV-PDT組(n＝4)。如圖22a所示，在USPV注射后24h，將兩步激光輻照策略用于PDT以輻照整個(gè)腫瘤區(qū)域。激光治療期間無(wú)明顯溫度升高，這確認(rèn)了無(wú)治療的熱效應(yīng)，從而排除了熱效應(yīng)可能對(duì)鄰近健康組織造成無(wú)意的副作用的擔(dān)心(圖23)。從PDT后24h開(kāi)始，USPV-PDT在腫瘤周?chē)斐砂毯?，直至治療?6天。最終，在治療后34天，所有USPV-PDT兔無(wú)明顯腫瘤(圖22b)。通過(guò)3D重建microCT圖像的體積測(cè)量定量確定治療后的腫瘤體積。USPV-PDT組顯示在治療后第1周內(nèi)，腫瘤尺寸輕微增加，這可能歸因于預(yù)期的炎癥反應(yīng)以及由PDT所造成的水腫(圖22c)。然而，從PDT后6天開(kāi)始，腫瘤尺寸逐漸減小直至PDT后34天檢測(cè)不到腫瘤。相反，接受單獨(dú)的激光輻照或USPV施用的對(duì)照組顯示出指數(shù)腫瘤生長(zhǎng)，這類似于空白對(duì)照，表明它們均不會(huì)引起任何治療作用(圖22d，圖24)。對(duì)于空白對(duì)照、激光對(duì)照和USPV對(duì)照，對(duì)照組分別在第6、8和9天達(dá)到終點(diǎn)(腫瘤體積>5000mm3)(圖5d)。通過(guò)病理學(xué)分析進(jìn)一步確認(rèn)USPV-PDT使得能夠完全腫瘤切除，這表明除了其陰性PanCK染色外，在終末手術(shù)中從原始腫瘤區(qū)域切除的組織未顯示出病理細(xì)胞形態(tài)(圖22e)。值得注意地，盡管未接受直接激光輻照，但是USPV-PDT組的淋巴結(jié)顯示從PDT后14天開(kāi)始，尺寸逐漸減小(圖25)。在PDT后34天，發(fā)現(xiàn)來(lái)自USPV-PDT組的所有淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移，如通過(guò)病理和PanCK染色分析所顯示的(圖22f)。這些結(jié)果強(qiáng)烈表明對(duì)于通過(guò)手術(shù)難接近的或鄰近于重要解剖結(jié)構(gòu)，如口咽、鼻咽、下咽部的HNC亞型以及對(duì)于復(fù)發(fā)病例，USPV-PDT可以用作放療和化療的替代方法以提高治療效力并降低長(zhǎng)期毒性。USPV-PDT似乎是非常有效的，高度局部化的并且使得能夠保留健康組織功能。USPV是安全的多功能納米平臺(tái)通過(guò)定期血液測(cè)試評(píng)價(jià)了USPV-PDT對(duì)兔的毒性(圖26a)。除堿性磷酸酶(ALP)外，治療后兔的肝功能維持正常而無(wú)顯著變化，所述堿性磷酸酶在治療后1周，在正常范圍內(nèi)適度降低(從68.1±8.66至43.5±9.67U/L)并隨時(shí)間返回基線水平(正常范圍12-98U/L)。治療后，紅細(xì)胞水平保持穩(wěn)定，這表明內(nèi)源卟啉(亞鐵原卟啉(heme))對(duì)生理調(diào)控?zé)o干擾。白細(xì)胞計(jì)數(shù)也保持不受影響，這表明USPV未引起免疫原性作用。對(duì)USPV-PDT兔的死后組織學(xué)分析在心、肺、肝、脾、腎上腺或肌肉中未顯示出異常細(xì)胞形態(tài)(圖26b)。這些結(jié)果表明USPV-實(shí)現(xiàn)的PDT治療是安全的治療方法?？傊?，本文描述了具有疏水核的多模態(tài)性治療診斷卟啉運(yùn)載體，其被卟啉脂質(zhì)類磷脂單層包膜并受α螺旋結(jié)構(gòu)限制。在完整USPV中高密度堆積的卟啉導(dǎo)致它們的光活性顯著淬滅，包括熒光和單線態(tài)氧的產(chǎn)生，而當(dāng)納米結(jié)構(gòu)破壞時(shí)，它們成為光動(dòng)力活性的。USPV對(duì)于藥物遞送具有多種有利特征，如疏水性藥物-負(fù)載能力，超小尺寸(<30nm)和優(yōu)良的血液循環(huán)特性(小鼠中10h的循環(huán)半衰期，兔中27h)而無(wú)需PEG化。我們驗(yàn)證了USPV是腫瘤-特異性遞送的穩(wěn)定藥物遞送平臺(tái)。USPV的固有64Cu標(biāo)記使得能夠無(wú)創(chuàng)追蹤藥物遞送，因此為理性劑量學(xué)和治療計(jì)劃提供了有用的方式。在臨床相關(guān)淋巴轉(zhuǎn)移兔模型中，我們證明USPV有利于精確檢測(cè)原發(fā)瘤和轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)，并且使得能夠通過(guò)術(shù)前PET和術(shù)中熒光成像對(duì)從腫瘤至局部淋巴結(jié)的淋巴引流顯像。對(duì)轉(zhuǎn)移性淋巴途徑的理解可以允許以更高的靈敏度鑒別未知的原發(fā)和復(fù)發(fā)腫瘤以改善治療結(jié)局。此外，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤小鼠和HNC兔模型中，在腫瘤積累后，高密度堆積的卟啉的有效光學(xué)性質(zhì)激活允許精確的熒光-導(dǎo)向的腫瘤切除術(shù)和有效的PDT，從而提供了原發(fā)瘤的完全根除并且阻止腫瘤轉(zhuǎn)移而不會(huì)損害鄰近重要結(jié)構(gòu)。因此，USPV的固有多模態(tài)性和良好的遞送特征為癌癥治療診斷學(xué)和臨床轉(zhuǎn)化提供了很大可能，從而通過(guò)整合PET/CT和熒光成像提高癌癥診斷，并且通過(guò)調(diào)整通過(guò)熒光-導(dǎo)向的手術(shù)性和選擇性PDT的治療改善癌癥的治療效力和特異性。盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解在不背離本發(fā)明的精神或所附權(quán)利要求的范圍的情況下，可以對(duì)其作出改變。本文所公開(kāi)的所有文檔，包括以下參考文獻(xiàn)列表中的那些作為參考并入本文。參考文獻(xiàn)列表1.DoughertyTJ，etal.(1998)Photodynamictherapy.(Translatedfromeng)JNatlCancerInst90(12)：889-905(ineng).2.EthirajanM，ChenY，JoshiP，&PandeyRK(2011)Theroleofporphyrinchemistryintumorimagingandphotodynamictherapy.(Translatedfromeng)ChemSocRev40(1)：340-362(ineng).3.StefflovaK，ChenJ，&ZhengG(2007)Killerbeaconsforcombinedcancerimagingandtherapy.(Translatedfromeng)CurrMedChem14(20)：2110-2125(ineng).4.ZhengG，etal.(2007)Photodynamicmolecularbeaconasanactivatablephotosensitizerbasedonprotease-controlledsingletoxygenquenchingandactivation.(Translatedfromeng)ProcNatlAcadSciUSA104(21)：8989-8994(ineng).5.JosefsenLB&BoyleRW(2012)Uniquediagnosticandtherapeuticrolesofporphyrinsandphthalocyaninesinphotodynamictherapy，imagingandtheranostics.(Translatedfromeng)Theranostics2(9)：916-966(ineng).6.ChenB，PogueBW，&HasanT(2005)Liposomaldeliveryofphotosensitisingagents.(Translatedfromeng)ExpertOpinDrugDeliv2(3)：477-487(ineng).7.KomatsuT，MoritakeM，NakagawaA，&TsuchidaE(2002)Self-organizedlipid-porphyrinbilayermembranesinvesicularform：nanostructure，photophysicalproperties，anddioxygencoordination.(Translatedfromeng)Chemistry8(23)：5469-5480(ineng).8.GhoroghchianPP，etal.(2005)Near-infrared-emissivepolymersomes：self-assembledsoftmatterforinvivoopticalimaging.(Translatedfromeng)ProcNatlAcadSciUSA102(8)：2922-2927(ineng).9.LovellJF，etal.(2011)Porphysomenanovesiclesgeneratedbyporphyrinbilayersforuseasmultimodalbiophotoniccontrastagents.(Translatedfromeng)NatMater10(4)：324-332(ineng).10.JinSC，CuiL，WangF，ChenJ，&ZhengG(2014)Targeting-triggeredporphysomenanostructuredisruptionforactivatablephotodynamictherapy.Adv.HealthcareMater..11.LiuTW，MacDonaldTD，ShiJ，WilsonBC，&ZhengG(2012)Intrinsicallycopper-64-labeledorganicnanoparticlesasradiotracers.(Translatedfromeng)AngewChemIntEdEng/51(52)：13128-13131(ineng).12.LiuTW，etal.(2013)Inherentlymultimodalnanoparticle-driventrackingandreal-timedelineationoforthotopicprostatetumorsandmicrometastases.(Translatedfromeng)ACSNano7(5)：4221-4232(ineng).13.PluenA，etal.(2001)Roleoftumor-hostinteractionsininterstitialdiffusionofmacromolecules：cranialvs.subcutaneoustumors.(Translatedfromeng)ProcNatlAcadSciUSA98(8)：4628-4633(ineng).14.CabralH，etal.(2011)Accumulationofsub-100nmpolymericmicellesinpoorlypermeabletumoursdependsonsize.(Translatedfromeng)NatNanotechnol6(12)：815-823(ineng).15.SykesEA，ChenJ，ZhengG，&ChanWC(2014)InvestigatingtheImpactofNanoparticleSizeonActiveandPassiveTumorTargetingEfficiency.(TranslatedfromEng)ACSNano(inEng).16.CorbinRl，etal.(2007)EnhancedCancer-TargetedDeliveryUsingEngineeredHigh-DensityLipoprotein-BasedNanocarriersJ.Biomed.Nanotechnol.3：367-376.17.LiSJ，RenGX，JinWL，andGuoW.Establishmentandcharacterizationofarabbitoralsquamouscellcarcinomacelllineasamodelforinvivostudies.OralOncol.2011；47(1)：39-44.18.LinLM，ChenYK，ChenCH，ChenYW，HuangAH，andWangWC.VX2-inducedrabbitbuccalcarcinoma：apotentialcancermodelforhumanbuccalmucosasquamouscallcarcinoma.OralOncol.2009；45(11)：e196-203.19.NgKK，LovellJF，VedadiA，HajianT，&ZhengG(2013)Self-assembledporphyrinnanodiscswithstructure-dependentactivationforphototherapyandphotodiagnosticapplications.(Translatedfromeng)ACSNano7(4)：3484-3490(ineng).20.AliH&vanLierJE(1999)Metalcomplexesasphoto-andradiosensitizers.(Translatedfromeng)ChemRev99(9)：2379-2450(ineng).21.MacDonaldDT，LiuWT，&ZhengG(2014)AnMRI-Sensitive，Non-PhotobleachablePorphysomePhotothermalAgent.AngewandteChemie，Int.Ed.，53.22.RoxinA，ChenJ，PatonAS，BenderTP，&ZhengG(2014)ModulationofreactiveoxygenspeciesphotogenerationofbacteriopheophorbideaderivativesbyexocyclicE-ringopeningandchargemodifiications.(Translatedfromeng)JMedChem57(1)：223-237(ineng).當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3 當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3