索拉非尼藥物脂質(zhì)納米混懸劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了索拉非尼藥物脂質(zhì)納米混懸劑及其制備方法。所述的索拉非尼藥物脂質(zhì)納米混懸劑，采用納米沉淀法或/和高壓均質(zhì)法制備；以磷脂和吐溫?80為穩(wěn)定劑。制備的索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑，生物相容性好、載藥量高，粒徑小，只需少量凍干保護(hù)劑的加入便可凍干，凍干產(chǎn)品重建性良好，制備的索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑，能改善藥物的體內(nèi)組織分布，顯著增強(qiáng)藥物在肝臟和腫瘤的分布；顯著增強(qiáng)其抗腫瘤效果；制備條件溫和，簡單可控，具有廣闊的開發(fā)前景。
【專利說明】
索拉非尼藥物脂質(zhì)納米混懸劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及藥物制劑技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及索拉非尼藥物脂質(zhì)納米混懸劑及其制備 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥是威脅人類健康和生命的重大疾病。肝癌是世界五大最常見的癌癥之一，其 死亡率在所有癌癥中排第Ξ，僅次于肺癌和胃癌。大多數(shù)晚期肝癌患者缺乏有效的系統(tǒng)性 治療措施，藥物治療在肝癌治療中有著不可替代的作用。近年來，分子祀向藥物在臨床上取 得顯著的治療效果，受到研究者的密切關(guān)注。
[0003] 索拉非尼是一種新型二芳基脈類和口服多祀點(diǎn)分子祀向藥物，它開創(chuàng)了肝癌系統(tǒng) 治療的里程碑。索拉非尼作為一種多祀點(diǎn)多激酶小分子抑制劑，可同時(shí)抑制多種激酶，具有 雙重抗腫瘤效應(yīng)。一方面，它可W通過抑RAF/MEK/E服信號傳導(dǎo)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖， 直接抑制腫瘤生長;另一方面，它又可通過抑制血管內(nèi)皮生長因子、血小板衍生生長因子及 其受體，而阻斷腫瘤新生血管的形成，間接抑制腫瘤細(xì)胞的生長。在歐美W及亞太地區(qū)進(jìn)行 的國際多中屯、隨機(jī)對照虹期臨床試驗(yàn)顯示，相比安慰劑組，索拉非尼組均明顯延長患者的 中位生存時(shí)間。因此索拉非尼被各大指南推薦用于晚期肝癌患者的一線標(biāo)準(zhǔn)用藥。
[0004] 索拉非尼溶解度差，疏水性極強(qiáng)。為提高其在水中的溶解度，臨床將其制成甲苯橫 酸鹽，但水溶性仍較差，口服生物利用度低，不足10%，且飲食對其吸收影響明顯。索拉非尼 臨床劑量大，不適用于吞咽困難的晚期肝癌患者；索拉非尼副作用明顯，包括高血壓、手足 皮膚反應(yīng)W及包括胃出血在內(nèi)的胃腸道反應(yīng)?，F(xiàn)有的有關(guān)索拉非尼制劑的報(bào)道，載藥量大 多較低，因此，當(dāng)前仍迫切需要提供一種替代性的索拉非尼藥物產(chǎn)品，W滿足安全高效的要 求。
[0005] 目前研究的索拉非尼納米給藥系統(tǒng)主要有W下幾種:脂質(zhì)類納米載體(脂質(zhì)體、固 體脂質(zhì)納米粒、納米脂質(zhì)載體）、聚合物納米粒和膠束。如專利CN104523607A公開了一種索 拉非尼脂質(zhì)體注射用凍干粉針劑及其制備方法，通過制備索拉非尼脂質(zhì)體，提高索拉非尼 在水溶液中的穩(wěn)定性和溶解度，提高生物利用度;張洪等(索拉非尼半乳糖神經(jīng)酷胺固體脂 質(zhì)納米粒的研制，廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2013,29巧））公開了一種索拉非尼半乳糖神經(jīng)酷胺固體 脂質(zhì)納米粒，采用乳化蒸發(fā)-低溫固化法制備S-GC-化N，所制脂質(zhì)納米粒子為類球形實(shí)體， 粒徑為（186.6±2.6)皿，2613電位為(-46.1±2.9)111￥，包封率為(83.47±1.54)%。但上述 方式存在載藥量低、藥物易泄露、突釋現(xiàn)象等問題。
[0006] 納米混懸劑是一種純藥物納米顆粒的亞微細(xì)粒膠態(tài)分散體，借助于穩(wěn)定劑對其進(jìn) 行穩(wěn)定而得到的給藥系統(tǒng)。納米混懸劑具有許多優(yōu)點(diǎn)：（1)理論上，納米混懸劑是近乎純藥 物的納米粒，具有最大限度的載藥量和藥物傳輸效率，特別適合大劑量難溶性藥物給藥； (2)適用范圍廣，無論是難溶于水的藥物，還是水、油都難溶的藥物，都可利用一定的方法制 得相應(yīng)的納米混懸劑；（3)納米混懸劑處方組成簡單、工藝簡單、制備快速，且可通過相應(yīng)技 術(shù)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大生產(chǎn)；（4)納米混懸劑經(jīng)過干燥后所得粉末，可進(jìn)一步制備成口服、注射、外 用等不同的劑型，方便攜帶，提高病人順應(yīng)性。
[0007] 納米混懸劑是近年來發(fā)展起來的新型劑型，其穩(wěn)定性問題一直是其應(yīng)用及產(chǎn)業(yè)化 的瓶頸。影響其物理穩(wěn)定性的因素主要有劑型(混懸劑和固體劑型）、分散介質(zhì)(水性介質(zhì)和 非水介質(zhì)）、給藥途徑（口腔、吸入、靜脈或其他）、生產(chǎn)技術(shù)Γ自上而下"、"自下而上"）和藥 物自身性質(zhì)（小分子或大分子)等。添加穩(wěn)定劑是維持納米混懸劑穩(wěn)定的最常用方法，但穩(wěn) 定劑的選擇很有挑戰(zhàn)性，主要是因?yàn)?缺乏對納米混懸劑內(nèi)在相互作用基礎(chǔ)的了解;穩(wěn)定劑 篩選過程復(fù)雜且會出現(xiàn)無效篩選的現(xiàn)象。如Lee等（Lee J, Choi JY, Park CH.Characteristics of polymers enabling nano-comminution of water-insoluble 化ugs[J].Int J Pharm, 2008,355(1-2) :328-336.)研究了巧巾穩(wěn)定劑（5種非離子型穩(wěn)定 劑:PEG、Pluronic F68和F127、HPC和PVP Κ30,2種離子型穩(wěn)定劑:SDS和苯乙胺)對η種藥物 (聯(lián)苯雙醋、伊曲康挫、紫杉醇、格列美脈、洋地黃毒巧、硝苯地平、氨化可的松、去氨氨化可 的松、布洛芬、糞普生和硫辛酸）的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的穩(wěn)定劑對于藥物混懸劑的穩(wěn)定性 影響差異明顯。
[0008] 此外，納米混懸劑由基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用，其生物利用度、藥物安全性及有效性等 方面的提高是否能夠?qū)崿F(xiàn)，也存在諸多困難。因此，針對索拉非尼，開發(fā)出物理及化學(xué)穩(wěn)定 性的納米混懸劑，并提高藥物的安全性、有效性W及實(shí)現(xiàn)祀向給藥，仍是本領(lǐng)域技術(shù)人員面 臨的技術(shù)難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，發(fā)明人通過試驗(yàn)研究，提供一種新型的索拉非尼藥 物脂質(zhì)納米混懸劑，所制備的索拉非尼藥物脂質(zhì)納米混懸劑及其凍干制劑，實(shí)現(xiàn)了索拉非 尼脂質(zhì)納米混懸劑的制備簡單、高載藥量、高穩(wěn)定性，并可改善索拉非尼在體內(nèi)的分布、增 強(qiáng)抗癌療效。本發(fā)明還提供了脂質(zhì)納米混懸劑及其凍干制劑的制備方法，具有操作簡便、重 現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)，適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
[0010] 具體的，本發(fā)明設(shè)及W下技術(shù)方案：
[0011] 首先，本發(fā)明提供一種索拉非尼藥物脂質(zhì)納米混懸劑，由索拉非尼藥物、穩(wěn)定劑及 注射用水制備而成，其中，所述穩(wěn)定劑為憐脂和吐溫。
[0012] 本發(fā)明所述的索拉非尼藥物，包括索拉非尼或索拉非尼甲苯橫酸鹽。本發(fā)明所述 索拉非尼甲苯橫酸鹽脂質(zhì)納米混懸劑的制備和性質(zhì)與索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑相同。 [001；3]索拉非尼試1)分子式為〔21出6〔化漏3，相對分子質(zhì)量為464.8;索拉非尼甲苯橫 酸鹽(式Π )分子式為C21出6C1F3N地3 · C7曲化S，相對分子質(zhì)量為637.0,兩者結(jié)構(gòu)式如下所 示：
[0014]
[0015] 本發(fā)明采用的穩(wěn)定劑為憐脂和吐溫，優(yōu)選的吐溫為吐溫80。在本發(fā)明的索拉非尼 納米混懸劑的穩(wěn)定劑篩選過程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，雖然現(xiàn)有技術(shù)納米混懸劑的水性介質(zhì)中常 用多種表面活性劑，但為特定藥物(索拉非尼)配對合適的穩(wěn)定劑沒有具體的法則可循，穩(wěn) 定劑的選擇仍很有挑戰(zhàn)性主要是因?yàn)?影響該藥物穩(wěn)定性的因素很多，如藥物表面能、溶解 性、分子量、官能團(tuán)、晶體結(jié)構(gòu)W及藥物性質(zhì)等;缺乏對納米混懸劑內(nèi)在相互作用基礎(chǔ)的了 解;穩(wěn)定劑篩選過程復(fù)雜且會出現(xiàn)無效篩選的現(xiàn)象。
[0016] 尤其在本發(fā)明過程中，預(yù)試驗(yàn)證明，由于索拉非尼的強(qiáng)疏水性，單靠憐脂作為穩(wěn)定 劑，無法形成粒徑較小、穩(wěn)定性良好的脂質(zhì)納米混懸劑；因此發(fā)明人對于穩(wěn)定劑進(jìn)一步采用 復(fù)配篩選，通過試驗(yàn)探索發(fā)現(xiàn)，W吐溫-80為輔助穩(wěn)定劑時(shí)，可形成穩(wěn)定、粒徑小且均勻的索 拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑(索拉非尼-LNS)。
[0017] 憐脂是一種表面活性劑，其中卵憐脂為天然的兩性離子表面活性劑，主要來自于 大豆和蛋黃。憐脂安全無毒，可作為注射制劑的輔料使用。因此W憐脂作為主要穩(wěn)定劑的脂 質(zhì)納米混懸劑（lipid based nanosuspen-sions，LNS)，可保證其安全性。
[001引通過憐脂和吐溫的使用，索拉非尼-LNS使藥物粒子變小促進(jìn)溶出，能解決與口服 生物利用度低相關(guān)的問題，還可改變藥物靜脈注射的藥物分布特征，實(shí)現(xiàn)有高效低毒的效 果;藥物呈固態(tài)可使其化學(xué)穩(wěn)定;小粒子沉降慢，使其物理穩(wěn)定。
[0019] 本發(fā)明所述索拉非尼藥物脂質(zhì)納米混懸劑，在確定藥物和穩(wěn)定劑后，可采用常規(guī) 的納米混懸劑的制備方法進(jìn)行制備，包括但不限于高壓勻質(zhì)法、沉淀法等。
[0020] 本發(fā)明所述索拉非尼藥物脂質(zhì)納米混懸劑中，優(yōu)選的，索拉非尼藥物、憐脂、吐溫 的質(zhì)量比為1: (5-20): (10-50);索拉非尼藥物與水溶液的質(zhì)量體積比（g/L)為1:1-1:5。在 此實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的脂質(zhì)納米混懸劑中粒子的平均粒徑為50~500nm，更優(yōu)選的， 平均粒徑在100~200nm。
[0021] 其次，本發(fā)明還提供所述索拉非尼藥物脂質(zhì)納米混懸劑的制備方法，采用納米沉 淀法、高壓均質(zhì)法中的一種或兩種結(jié)合來制備。
[0022] 優(yōu)選的實(shí)施方案中，采用納米沉淀法時(shí)，制備方法步驟如下：
[0023] (1)將索拉非尼藥物和憐脂溶于能與水混溶的有機(jī)溶劑中獲得有機(jī)相，將吐溫溶 于水中獲得水相；
[0024] (2)超聲或攬拌條件下將有機(jī)相加入到水相中；
[0025] (3)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)或透析法除去有機(jī)溶劑；
[0026] (4)可選的，采用高壓均質(zhì)進(jìn)一步減小粒徑。
[0027] 更為優(yōu)選的，步驟（1)所述的有機(jī)溶劑可W是甲醇、乙醇、丙酬、異丙醇、乙臘、 PEG400、PEG600、DMS0、DMF、乙酸乙醋、乳酸乙醋的一種或任意組合，優(yōu)選為甲醇；
[00%]索拉非尼藥物與有機(jī)溶劑的質(zhì)量體積比為50:1~1:1，優(yōu)選為10:1;
[0029] 索拉非尼藥物與憐脂的質(zhì)量比為(1-5): 20，優(yōu)選為:1:10;
[0030] 步驟(2)中有機(jī)溶劑與水相的體積比為1:2~50(v/v)，優(yōu)選為1:10;
[0031] 步驟(2)中有機(jī)溶劑的滴加速度為1~20mL/min，優(yōu)選為5mL/min。
[0032] 優(yōu)選的實(shí)施方案中，采用高壓均質(zhì)法時(shí)，制備方法步驟如下：
[0033] (1)取穩(wěn)定劑溶解于水中，得溶液A;
[0034] (2)將索拉非尼藥物分散于步驟(1)所得的溶液A中，得混懸液B;
[00巧](3)將混懸液B高速剪切1~3min，得混懸液C;
[0036] (4)將混懸液C采用高壓均質(zhì)法進(jìn)行均質(zhì)，即得索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑。
[0037] 優(yōu)選的，所述步驟(3)中，高速剪切的速度為1000~4000r/min，優(yōu)選為2000r/min;
[0038] 所述步驟(4)中，高壓均質(zhì)法的參數(shù)為：依次在100~300bar循環(huán)3~10次、500~ 15(K)bar循環(huán)5~25次，優(yōu)選為依次在2(K)bar循環(huán)5次，10(K)bar循環(huán)10次。
[0039] 此外，本發(fā)明還提供索拉非尼藥物脂質(zhì)納米混懸劑的凍干制劑，除包括所述索拉 非尼藥物和穩(wěn)定劑外，還包括凍干保護(hù)劑。
[0040] 所述索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑的凍干制劑的制備方法也屬于本發(fā)明的目的制劑。
[0041] 索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑的凍干制劑的制備方法，在上述索拉非尼脂質(zhì)納米混懸 劑的制備方法所述步驟外，還包括步驟:通過冷凍干燥、噴霧冷凍干燥或噴霧干燥等干燥方 式進(jìn)一步固化，所用凍干保護(hù)劑選自：甘露醇、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、麥芽糖、薦糖、乳 糖、果糖、海藻糖、右旋糖酢、氨基酸、氨基酸鹽、憐酸鹽中的一種或兩種及兩種W上的組合， 凍干保護(hù)劑在脂質(zhì)納米混懸劑中的濃度為0.005~0.2mg/mL優(yōu)選甘露醇為凍干保護(hù)劑，用 量為 0.05mg/mL。
[0042] 本發(fā)明所述的索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑，可用于制備注射劑，所述的注射劑包括 注射液和無菌凍干粉針;注射液可用高濃度的葡萄糖水溶液或氯化鋼溶液調(diào)成生理等滲體 系，適應(yīng)臨床應(yīng)用;本發(fā)明的索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑凍干粉可加入適量的含5%葡萄糖和 0.9 %氯化鋼的注射用水稀釋，重建成供靜脈給藥用的分散體系，適應(yīng)臨床使用。
[0043] 本發(fā)明取得了 W下有益效果：
[0044] 本發(fā)明制備的索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑及其凍干制劑，其優(yōu)點(diǎn)在于：
[0045] (1)本發(fā)明所述納米混懸劑W憐脂為主要穩(wěn)定劑，有更好的生物相容性和安全性， 而且索拉非尼具有強(qiáng)親脂性（log P = 3.8)，W憐脂為穩(wěn)定劑保證了穩(wěn)定劑與藥物的相容 性;通過與憐脂復(fù)合而形成前體藥物或載體系統(tǒng)，可增加藥物透過細(xì)胞膜的能力，有效提高 藥物的體內(nèi)吸收;可利用增強(qiáng)滲透與滯留效應(yīng)化PR effect)增加藥物在腫瘤部位的蓄積， 在增強(qiáng)抗腫瘤作用的同時(shí)降低藥物對正常組織的毒副作用;本發(fā)明制劑載藥量高、無藥物 泄露，載藥量可達(dá)10.55 %;
[0046] (2)本發(fā)明制劑外觀形態(tài)呈類球形，平均粒徑小且均勻，平均粒徑約為165nm，穩(wěn)定 性良好，zeta電位約為ll.OmV;
[0047] (3)本發(fā)明制劑處方簡單，最少可W只含有藥物和穩(wěn)定劑；
[0048] (4)本發(fā)明制得的凍干制劑呈疏松多孔狀態(tài)，再分散性良好，凍干保護(hù)劑用量少；
[0049] (5)本發(fā)明所述制劑安全性高、毒副作用低，包括：索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑，經(jīng) 肥2荷瘤小鼠組織分布試驗(yàn)證明，給藥后增加了藥物在肝臟和腫瘤中的濃度，實(shí)現(xiàn)了對腫瘤 組織的被動祀向；經(jīng)H22荷瘤小鼠藥效試驗(yàn)證明，表現(xiàn)出卓越的抗腫瘤治療，相同劑量下，納 米混懸劑較藥物溶液有更強(qiáng)的抗腫瘤活性;經(jīng)新西蘭兔血管刺激性試驗(yàn)，肉眼觀察，未出現(xiàn) 血管充血，紅斑及水腫；組織病理學(xué)檢查未出現(xiàn)血管細(xì)胞增生、炎癥細(xì)胞浸潤，證明其未出 現(xiàn)血管刺激性;經(jīng)小鼠組織切片試驗(yàn)，證明其沒有明顯的組織毒性；
[0050] (6)本發(fā)明所述制劑制備工藝簡單，重現(xiàn)性良好，可通過濾膜過濾除菌，因此可W 實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0051] 圖1為實(shí)施例2中索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑的粒徑分布圖。
[0052] 圖2為實(shí)施例2中索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑的透射電鏡照片（X 14000)。
[0053] 圖3為化pG2細(xì)胞(3)、日61-7402細(xì)胞化)給予索拉非尼溶液、索拉非尼脂質(zhì)納米混 懸劑及空白脂質(zhì)納米混懸劑4她后的生存率。
[0054] 圖4為H22小鼠靜脈注射索拉非尼溶液、索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑后各組織中的藥 物濃度。
[0055] 圖5為H22小鼠靜脈注射索拉非尼溶液、索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑后各個時(shí)間瘤內(nèi) 藥物分布。
[0056] 圖6為小鼠腫瘤體積變化圖。
[0化7]圖7為小鼠腫瘤直觀圖。
[005引圖8為小鼠體重變化圖。
[0化9]圖9為血管刺激性試驗(yàn)結(jié)果（X 400)。
[0060] 圖10為組織切片圖（X 100)。
【具體實(shí)施方式】
[0061] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的內(nèi)容完全不局限于此。
[0062] 實(shí)施例1索拉非尼納米混懸劑制備中穩(wěn)定劑的篩選
[0063] 索拉非尼納米混懸劑基本處方為:憐脂濃度為10mg/mレ藥脂比為1:10;輔助穩(wěn)定 劑用量為1 %;有機(jī)相水相體積比為1:10;有機(jī)相滴加速度為5mL/min;磁力攬拌速度為 SOOr/min;冰浴。
[0064] 采用單因素考察對基本處方進(jìn)行優(yōu)化，篩選索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑的輔助穩(wěn)定 劑，w粒徑及粒徑分布為主要考察因素，同時(shí)觀察其形態(tài)和均勻性考察其處方和工藝，結(jié)果 如表1所示。
[0065] 表1輔助穩(wěn)定劑種類對索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑粒徑和電位的影響
[0066]
[0067] 由表1可看出，吐溫-80作為輔助穩(wěn)定劑時(shí)，所得粒徑最小，分布最均勻。因此，選擇 吐溫-80為拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑的輔助穩(wěn)定劑。
[0068] 采用單因素考察優(yōu)化納米混懸劑配比，W粒徑及粒徑分布為主要考察因素，同時(shí) 觀察其形態(tài)和均勻性考察其處方和工藝?？疾斓奶幏揭蛩貫檩o助穩(wěn)定劑種類及用量、藥脂 比、有機(jī)相與水相體積比，結(jié)果如表2所示。
[0069] 表2單因素考察結(jié)果
[0070]
[0071 ]實(shí)施例2索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑的制備--納米沉淀法
[0072] 稱取索拉非尼9mg，憐脂75mg溶于ImL甲醇中，作為甲醇相;將吐溫-80溶于水中得 1.5%(旨/10〇1^)吐溫溶液，作為水相。在冰浴磁力攬拌條件下將甲醇相^511117111^的速度緩 慢滴加到lOmL水相中，滴加完畢，揮干甲醇，制得索拉非尼脂質(zhì)納米混懸液。
[0073] 上述制備的索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑平均粒徑164.5nm，多分散系數(shù)0.202,載藥 量10.8%，電位-11.2mV，粒徑分布如圖1所示。
[0074] 取上述制備的索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑適量，滴加于銅網(wǎng)上，用2%憐鶴酸進(jìn)行負(fù) 染，自然干燥后在透射電鏡下(TEM)觀察，如圖2所示，脂質(zhì)納米混懸劑粒徑較小，結(jié)構(gòu)圓整。
[0075] 實(shí)施例3索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑的制備--高壓均質(zhì)法
[0076] 精密稱取憐脂250mg及吐溫-80加至50mL蒸饋水中（吐溫-80濃度為1.0%(g/ lOOmU)溶解構(gòu)成分散介質(zhì)(溶液A)。加入25mg索拉非尼，超聲分散均勻得混懸液B。繼續(xù)采 用高速剪切機(jī)200(K)r/min高速剪切3min，制得混懸液C。然后將混懸液C采用高壓均質(zhì)法，分 別在200bar循環(huán)5次，lOOObar循環(huán)15次，制得索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑，平均粒徑為 178.6nm，多分散系數(shù)0.199,載藥量11.2%，電位-10.2mV。
[0077] 實(shí)施例4索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑-凍干劑
[0078] 稱取索拉非尼lOmg，憐脂lOOmg溶于ImL異丙醇中，作為有機(jī)相;將吐溫-80溶于水 中得1.5% (g/lOOi^W溫溶液，作為水相。于冰浴磁力攬拌條件下將有機(jī)相W4血/min的速 度緩慢滴加到lOmL水相中，滴加完畢，揮干異丙醇，10(K)bar條件下高壓均質(zhì)10次改善粒徑， 平均粒徑159.8nm，載藥量10.2%，電位-11.9111￥。
[0079] W上制備的混懸液加入0.05mg/mL甘露醇后裝入西林瓶中，置冰箱中-80°C預(yù)凍 2地，轉(zhuǎn)入冷凍干燥機(jī)中-40°C，0.5bar，4她，得白色疏松狀索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑凍干制 劑，該凍干制劑加入2mL蒸饋水經(jīng)振搖可于Imin內(nèi)完全復(fù)溶。
[0080] 索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑加入適量PBS后再分散，粒徑分布較均勻，平均粒徑為 190.6 ±5.化m，比凍干前有所增加，zeta電位為-11.5mV基本不變。透射電鏡觀察其外觀形 態(tài)，結(jié)果顯示其外觀圓整，無粘連，再分散性良好。初步穩(wěn)定性試驗(yàn)證明在4°C、-20°C條件下 放置3個月，凍干制劑的外觀無明顯變化，索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑凍干復(fù)溶后的粒徑略有 增加，可能是因?yàn)閮龈蛇^程中，表面活性劑保護(hù)作用在一定程度上降低從而導(dǎo)致部分粒子 團(tuán)聚，再分散后粒子表面的乳化膜厚度變薄等綜合作用所致。
[0081 ]實(shí)施例5索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑細(xì)胞毒性試驗(yàn)
[0082] 采用嚷挫藍(lán)比色法(MTT法），測定索拉非尼溶液、索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑(實(shí)施 例2,下同）對化pG2、Bel-7402兩種肝癌細(xì)胞的生長抑制作用，同時(shí)設(shè)置對照組及空白組。取 對數(shù)生長期兩種腫瘤細(xì)胞混懸液15化1(約7000個），分別置于96孔培養(yǎng)板中。然后置于C〇2 培養(yǎng)箱中，保持培養(yǎng)箱的環(huán)境恒定:溫度37 °C，0)2含量5 %，飽和濕度。細(xì)胞培養(yǎng)24h后，分別 加入50化不同濃度(0.5，2.5，5，10，20ymol/L)的索拉非尼溶液、索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑， 繼續(xù)培養(yǎng)4她。然后在96孔板中分別加入MTT，20μ1/孔，繼續(xù)解育4h。離屯、后棄去孔內(nèi)上清 液，加入15化1 DMS0/孔，并在搖床上振蕩5min，每組均有6個平行孔，并重復(fù)3次。在波長 490nm下用酶聯(lián)免疫檢測儀測定吸收度，考察各組制劑的體外抗腫瘤活性。
[0083] 細(xì)胞抑制率％ = [(A對照-A樣品）/(A對照-A空白）]X 100%
[0084] 式中：A樣品為各組制劑的吸光度;A對照為陰性對照組的吸光度;A空白為空白對 照組的吸光度。
[0085] 結(jié)果如圖3所示，納米混懸劑的細(xì)胞毒性明顯高于溶液組，與索拉非尼溶液組相 比，索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑在化pG2、Bel-7402細(xì)胞的IC50值顯著性降低;證明其能夠促 進(jìn)索拉非尼體內(nèi)遞送效率，顯著增強(qiáng)其細(xì)胞毒性。
[0086] 實(shí)施例6索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑在肥2荷瘤小鼠體內(nèi)分布
[0087] 動物模型的建立:將凍存的鼠源性H22肝癌細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于昆明小鼠腹腔中傳 代。取出含H22細(xì)胞的腹水，用無菌生理鹽水調(diào)整瘤細(xì)胞懸液濃度為1 X 107個備用。昆明 小鼠右蔽下部位皮下注射O.lmL的H22細(xì)胞（IXloVmU的生理鹽水懸液，待腫瘤體積生長 至大于200mm3,篩選腫瘤大小相對一致的小鼠進(jìn)行試驗(yàn)。
[0088] 取荷瘤小鼠，隨機(jī)分為溶液組和納米混懸劑2組，給藥前禁食12h，自由飲水，按照 9mg/kg的劑量進(jìn)行尾靜脈注射給藥。分別于給藥后0.5，1，2,4,6，1化處死小鼠，摘取腫瘤、 屯、、肝、脾、肺、腎臟器置于生理鹽水中清洗后，儲存于-20°C冰箱中待測。
[0089] 組織樣品處理：取待測動物臟器，精密稱重，加 ImL生理鹽水勻漿(肝組織加5mL)。 取勻漿樣品〇.4mL，置1.5mL離屯、管中，加入乙臘與甲醇溶液(2:l，V/V)0.6mL，滿旋Imin后， 1000化/min離屯、lOmin，將上清液0.5mL移至離屯、管中，40~50 °C水浴氮?dú)饬飨麓蹈?，溶?0.1 mL甲醇中，取20uL進(jìn)樣測定。
[0090] 結(jié)果：如圖4所示(每組從左至右依次為0.5，1，2，4，6，1化），小鼠尾靜脈注射索拉 非尼溶液后，索拉非尼在各組織臟器均有分布，分布無特異性;尾靜脈注射索拉非尼脂質(zhì)納 米混懸劑后，藥物在肝、脾和肺組織分布增多，降低了屯、、腎組織中索拉非尼的分布。如圖5 所示，與溶液組相比，脂質(zhì)納米混懸劑組在瘤組織內(nèi)藥物分布明顯提高，具有明顯的腫瘤祀 向性。
[0091] 實(shí)施例7索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑在H22荷瘤小鼠的抗腫瘤藥效研究
[0092] 動物模型的建立:同實(shí)施例6中相同。
[0093] 將荷瘤小鼠平均分為4組，6只/組。組別分別為:①生理鹽水組(N.S);②索拉非尼 溶液，口服組（18mg/kg);③索拉非尼溶液，靜注組(9mg/kg);④索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑， 靜注組(9mg/kg)。每組分別給予尾靜脈注射給藥，每Ξ天一次，共給藥3周。給藥后，每隔一 天即用游標(biāo)卡尺測量瘤的長和寬，并計(jì)算腫瘤體積大小，瘤體積的計(jì)算公式為:瘤體積=1/ 2LW2，L、W分別指腫瘤的長和寬；同時(shí)對小鼠的體重進(jìn)行稱量，繪制小鼠的體重變化曲線。最 后一次給藥一周后，把所有小鼠處死，剖離出瘤，對其質(zhì)量進(jìn)行稱量，并用相機(jī)對其大小進(jìn) 行拍照。
[0094] 結(jié)果:如圖6所示，納米混懸劑組抗腫瘤效果最佳，顯著高于溶液口服組及靜注組； 如圖7所示，納米混懸劑組腫瘤體積和瘤重明顯小于其他各組；圖8所示，小鼠體重未發(fā)生明 顯下降現(xiàn)象，初步說明索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑有較低的毒性。
[0095] 實(shí)施例8血管刺激性試驗(yàn)
[0096] 選用新西蘭兔，隨機(jī)分為兩組，每組Ξ只，采用自身對照法，每只兔子左耳注射生 理鹽水，組1兔右耳注射索拉非尼溶液，組2兔右耳注射索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑。每天給藥 一次，連續(xù)給藥5天，肉眼觀察注射部位血管變化。末次給藥4她后，取距離注射部位1cm及 3cm處耳緣靜脈區(qū)域進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。
[0097] 結(jié)果，如圖9所示，組織病理學(xué)檢查未出現(xiàn)血管細(xì)胞增生、炎癥細(xì)胞浸潤，證明其未 出現(xiàn)血管刺激性。
[0098] 實(shí)施例9組織切片試驗(yàn)
[0099] 使用健康雌性昆明小鼠15只，隨機(jī)分為兩組，分別為生理鹽水組、空白脂質(zhì)納米混 懸劑組、索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑組，進(jìn)行尾靜脈注射。索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑組小鼠劑 量為9mg/kg。給藥頻率與體內(nèi)藥效試驗(yàn)相同。在第21天時(shí)，處死所有小鼠，分離屯、臟、肝臟、 脾臟、腎臟和肺，使用PBS(pH=7.4)洗兩遍后，使用含有4%甲醒溶液中固定，石蠟包埋切 片，蘇木精-伊紅染色法化E染色法)進(jìn)行染色，觀察不同臟器情況。
[0100] 結(jié)果：如圖10所示，與給予生理鹽水的小鼠器官切片相比，空白脂質(zhì)納米混懸劑 組、索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑組切片無顯著性差異，均無明顯病理變化。
[0101] 應(yīng)注意的是，W上實(shí)例僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對其進(jìn)行限制。盡管參 照所給出的實(shí)例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，但是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可根據(jù)需要對本發(fā) 明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種索拉非尼藥物脂質(zhì)納米混懸劑，由索拉非尼藥物、穩(wěn)定劑及注射用水制備而成， 其特征在于，所述穩(wěn)定劑為磷脂和吐溫。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的索拉非尼藥物脂質(zhì)納米混懸劑，其特征在于，吐溫為吐溫80。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的索拉非尼藥物脂質(zhì)納米混懸劑，其特征在于，所述的索拉非尼 藥物，是索拉非尼或索拉非尼甲苯磺酸鹽。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的索拉非尼藥物脂質(zhì)納米混懸劑，其特征在于，索拉非尼藥物、 磷脂、吐溫的質(zhì)量比為1: (5-20): (10-50);索拉非尼藥物與水溶液的質(zhì)量體積比(g/L)為1: 卜1:5〇5. 權(quán)利要求1-4所述索拉非尼藥物脂質(zhì)納米混懸劑的制備方法，其特征在于，采用納米 沉淀法、高壓均質(zhì)法中的一種或兩種結(jié)合來制備。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，采用納米沉淀法時(shí)制備方法步驟如 下： (1) 將索拉非尼藥物和磷脂溶于能與水混溶的有機(jī)溶劑中獲得有機(jī)相，將吐溫溶于水 中獲得水相； (2) 超聲或攪拌條件下將有機(jī)相加入到水相中； (3) 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)或透析法除去有機(jī)溶劑； (4) 可選的，采用高壓均質(zhì)進(jìn)一步減小粒徑。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述的有機(jī)溶劑可以是甲醇、 乙醇、丙酮、異丙醇、乙腈、PEG400、PEG600、DMS0、DMF、乙酸乙醋、乳酸乙醋的一種或組合，優(yōu) 選為甲醇;或者，索拉非尼藥物與有機(jī)溶劑的質(zhì)量體積比為50:1~1:1，優(yōu)選為10:1;或者， 索拉非尼藥物與磷脂的質(zhì)量比為（1-5) :20,優(yōu)選為：1:10;或者，步驟(2)中有機(jī)溶劑與水相 的體積比為1:2~50(v/v)，優(yōu)選為1: 10;或者，步驟(2)中有機(jī)溶劑的滴加速度為1~20mL/ min，優(yōu)選為 5mL/min〇8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，采用高壓均質(zhì)法時(shí)制備方法步驟如 下： (1) 取穩(wěn)定劑溶解于水中，得溶液A; (2) 將索拉非尼藥物分散于步驟(1)所得的溶液A中，得混懸液B; (3) 將混懸液B高速剪切1~3分鐘，得混懸液C; (4) 將混懸液C采用高壓均質(zhì)法進(jìn)行均質(zhì)，即得索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑； 優(yōu)選的，所述步驟(3)中，高速剪切的速度為10000~4000r/min，更優(yōu)選為2000r/min; 或者， 所述步驟（4)中，高壓均質(zhì)法的參數(shù)為：依次在100~300bar循環(huán)3~10次、500~ 1500bar循環(huán)5~25次，優(yōu)選為依次在200bar循環(huán)5次，1000 bar 10次。9. 權(quán)利要求1-4所述索拉非尼藥物脂質(zhì)納米混懸劑制備的凍干制劑，其特征在于，將權(quán) 利要求1-4所述納米混懸劑加入凍干劑進(jìn)行冷凍干燥。10. 權(quán)利要求9所述凍干制劑的制備方法，其特征在于，包括權(quán)利要求5-8任一項(xiàng)所述索 拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑的制備方法，此外還包括固化步驟:通過冷凍干燥、噴霧冷凍干燥或 噴霧干燥方式將索拉非尼脂質(zhì)納米混懸劑進(jìn)一步固化;所用凍干保護(hù)劑選自：甘露醇、山梨 醇、聚乙二醇、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、果糖、海藻糖、右旋糖酐、氨基酸、氨基酸鹽、磷酸 鹽中的一種或兩種及兩種以上的組合，凍干保護(hù)劑在脂質(zhì)納米混懸劑中的濃度為0.005~ 0.2mg/mL;優(yōu)選甘露醇為凍干保護(hù)劑，用量為0.05mg/mL。
【文檔編號】A61P35/00GK105919935SQ201610257901
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月22日
【發(fā)明人】張娜, 楊紹梅, 張波, 蘇志會, 肖亞男, 王天琪
【申請人】山東大學(xué)