一種同時(shí)制備d-和l-型叔亮氨酸的方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明屬于生物催化領(lǐng)域，特別涉及一種同時(shí)制備D-和L-型叔亮氨酸的方法?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]L-叔亮氨酸和D-叔亮氨酸是非常重要的非天然氨基酸，是多種藥物的中間體。因其側(cè)鏈?zhǔn)且粋€(gè)叔丁基，有很大的空間位阻，在和其它分子耦聯(lián)后有利于維持空間構(gòu)象，同時(shí)形成的酰胺鍵不容易被體內(nèi)的酶識(shí)別降解。目前合成L-叔亮氨酸和D-叔亮氨酸，除化學(xué)拆分法，生物催化的工業(yè)化方法主要是以叔丁基酮酸為底物，用脫氫酶進(jìn)行生物還原氨法進(jìn)行，如《一種制備L-叔亮氨酸的方法》201110202325和《D-叔亮氨酸的一種生物催化制備方法》CN104513839A。有文獻(xiàn)報(bào)道用固定化親霉素?；福鸱瞩；幕煨辶涟彼幔ㄟ^發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)表明，固定化親霉素?；?，耐受的底物濃度較低，超過200mM幾乎無活性，使用二次后，活性極顯著下降。專利《連續(xù)化酶法生產(chǎn)L-叔亮氨酸》201010622182，是采用苯乙?；揎椈煨辶涟彼?，用固定化的Amano?；冈谑覝剡M(jìn)行拆分，酶依賴進(jìn)口，苯乙?；揎椀氖辶涟彼嵩谑覝貤l件下溶解度較低，工藝對(duì)生產(chǎn)不利?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0003]本發(fā)明的目的是提供一種制備混旋D-，L-叔亮氨酸的方法。另外本發(fā)明提供一種同時(shí)制備D-型叔亮氨酸和L-型叔亮氨酸的方法，上述制備方法其綜合成本顯著低于生物還原轉(zhuǎn)化方法。[0004]本發(fā)明包括以下內(nèi)容:一種制備混旋D-，L-型叔亮氨酸的方法，包括以下步驟:步驟(1):將正丁醇與1，1-二氯乙烯反應(yīng)，得到3，3-二甲基丁酸產(chǎn)物；步驟(2):在3，3-二甲基丁酸產(chǎn)物中加入催化劑，同時(shí)通入空氣和氯氣，進(jìn)行氯代，得到2-氯-3，3-二甲基丁酸；步驟(3):將得到的2-氯-3，3-二甲基丁酸進(jìn)行氨解反應(yīng)，最終得到混旋D-,L-叔殼氨酸。[0005]—種同時(shí)制備D-叔亮氨酸和L-叔亮氨酸的方法，其特征在于:包括以下步驟:步驟(1):將正丁醇與1，1-二氯乙烯反應(yīng)，得到3，3-二甲基丁酸產(chǎn)物；步驟(2):在3，3-二甲基丁酸產(chǎn)物中加入催化劑，同時(shí)通入空氣和氯氣，進(jìn)行氯代，得到2-氯-3，3-二甲基丁酸；步驟(3):將得到的2-氯-3，3-二甲基丁酸進(jìn)行氨解反應(yīng)，得到混旋D-，L-叔亮氨酸；步驟(4):用乙酰氯或氯乙酰氯修飾步驟(3)中所述的混旋D-，L-叔亮氨酸，對(duì)得到的乙酰化D，L-叔亮氨酸或氯乙酰化的D，L-叔亮氨酸利用L-氨基?；高M(jìn)行拆分；步驟(5):將拆分回收得到的乙酰化的D-叔亮氨酸或氯乙?；腄-叔亮氨酸去酰化，結(jié)晶得到D-叔亮氨酸；將拆分回收得到的乙酰化的D-叔亮氨酸或氯乙?；腄-叔亮氨酸進(jìn)行消旋，再用L-氨基?；高M(jìn)行拆分，得到L-叔亮氨酸。本發(fā)明由于采用了低成本的正丁醇與1，1-二氯乙烯作為起始原料，得到的D-和L-叔亮氨酸成本遠(yuǎn)低于生物還原轉(zhuǎn)化方法。[0006]進(jìn)一步地，L-氨基?；笧長(zhǎng)-熱穩(wěn)定氨基酰化酶。關(guān)于L-熱穩(wěn)定氨基酰化酶的制備方法可參見AthermostableL-aminoacylasefromThermococcuslitoralis:cloning,overexpress1n,characterizat1n,andapplicat1nsinb1transformat1ns.Extremophiles.2002Apr;6(2):111-122。[0007]本發(fā)明為克服苯基衍生物?；辶涟彼崛芙舛鹊偷牟蛔?，采用乙酰氯或其衍生物修飾叔亮氨酸，避免苯基導(dǎo)入對(duì)?；辶涟彼崛芙獾牟焕?。同時(shí)采用L-熱穩(wěn)定氨基?；冈谳^高溫度下進(jìn)行拆分，進(jìn)一步提高酰化叔亮氨酸的溶解度，可實(shí)現(xiàn)高效率的生物催化。[0008]由于用氯乙酰氯修飾D-，L-叔亮氨酸，并在較高的溫度下，如70-80°C，用L-熱穩(wěn)定氨基酰化酶進(jìn)行拆分，有效的增加了底物的濃度，實(shí)現(xiàn)了高效率拆分。[0009]作為優(yōu)選，當(dāng)正丁醇與1，1-二氯乙烯反應(yīng)，反應(yīng)體系的溫度在0_2°C，反應(yīng)時(shí)間為3小時(shí)。[0010]作為優(yōu)選，步驟(2)在3，3-二甲基丁酸產(chǎn)物中加入催化劑，所述催化劑為紅磷。[0011]本發(fā)明還提供一種制備L-叔亮氨酸的方法，包括以下步驟:步驟(1):將正丁醇與1，1-二氯乙烯反應(yīng)，得到3，3-二甲基丁酸產(chǎn)物；步驟(2):在3，3-二甲基丁酸產(chǎn)物中加入催化劑，同時(shí)通入空氣和氯氣，進(jìn)行氯代，得到2-氯-3，3-二甲基丁酸；步驟(3):將得到的2-氯-3，3-二甲基丁酸進(jìn)行氨解反應(yīng)，得到混旋D-，L-叔亮氨酸；步驟(4):用乙酰氯或氯乙酰氯修飾步驟(3)中所述的混旋D-，L-叔亮氨酸，對(duì)得到的乙?；疍，L-叔亮氨酸或氯乙酰化的D，L-叔亮氨酸利用L-氨基?；福M(jìn)行拆分；步驟(5):將拆分回收得到的乙?；腄-叔亮氨酸或氯乙?；腄-叔亮氨酸進(jìn)行消旋，再用L-氨基?；高M(jìn)行拆分，得到L-叔亮氨酸。[0012]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明可同時(shí)制備二種構(gòu)型的手性叔亮氨酸，從經(jīng)濟(jì)效益上講，成本顯著低于用生物還原法分別制備D-和L-叔亮氨酸。目前市場(chǎng)上D-叔亮氨酸的價(jià)格是L-叔亮氨酸的3倍。L-叔亮氨酸的市場(chǎng)規(guī)模遠(yuǎn)大于D-叔亮氨酸。本發(fā)明可以將酶催化后回收的氯乙酰氯D-叔亮氨酸進(jìn)行消旋，再循環(huán)拆分，可以只得到L-叔亮氨酸。由于合成的D-和L-叔亮氨酸成本非常低，其綜合成本依然低于生物還原轉(zhuǎn)化方法。【具體實(shí)施方式】[0013]下面以實(shí)施例來具體說明本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。[0014]實(shí)施例1:1升(10.9摩爾)正丁醇溶于2.3升濃硫酸，在0°C左右的條件下，慢慢滴加1，1-二氯乙烯964ml(12摩爾)，反應(yīng)過程中，控制反應(yīng)體系的溫度在0-2°C，滴加完畢，反應(yīng)3小時(shí)。將反應(yīng)液倒于碎冰上，用4升正己烷提取產(chǎn)物三次，回收溶劑，產(chǎn)物用濃鹽酸水解，用苯提取產(chǎn)物，回收溶劑得到3，3-二甲基丁酸(1.14公斤，90%收率)。將產(chǎn)物加入少量紅磷做催化試劑，在130°C，同時(shí)通入空氣和氯氣，反應(yīng)完全，通空氣趕去多余的氯氣，減壓蒸餾(收集102-109。。/1mmHg)，得到2-氯-3，3-二甲基丁酸(1.31公斤，89%收率)，氯代物溶于濃氨水(13M)，在50°C保溫16小時(shí)，液相檢測(cè)氨基接近完全(小于2%)，趕去多余的氨后，濃縮干，用乙酸在100°c溶解氨基酸，過濾除去氯化銨。蒸餾回收乙酸，得到D，L-叔亮氨酸(1.06公斤，93%得率)。[0015]實(shí)例2混旋的叔亮氨酸溶于水，加入氫氧化鈉調(diào)節(jié)到pH=10，控制溫度在0°C，慢慢滴加乙酰氯，同時(shí)氫氧化鈉控制PH，直到反應(yīng)液茚三酮檢測(cè)不顯當(dāng)前第1頁(yè)1 2