一種l-亮氨酸的分離純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及L-亮氨酸的分離純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] L-亮氨酸（L-leucine)為人體和動(dòng)物的必需氨基酸之一，同時(shí)也是三大支鏈氨基 酸之一，是一種極其重要的生物化工產(chǎn)品，在醫(yī)藥、營(yíng)養(yǎng)、化工、農(nóng)藥、化妝品等方面有著廣 泛的應(yīng)用。L-亮氨酸的工業(yè)生產(chǎn)主要采用發(fā)酵法，這決定了分離純化技術(shù)在其工業(yè)生產(chǎn)中 的重要地位。L-亮氨酸現(xiàn)有的主要分離純化技術(shù)包括：沉淀法、離子交換法和乳狀液膜法。 沉淀法沉淀劑回收困難，廢液排放污染嚴(yán)重，殘留沉淀劑可能存在毒性等等。離子交換法則 會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的再生廢液，操作周期較長(zhǎng)，耗鹽量大。此外，有機(jī)物的存在會(huì)污染離子交換樹(shù) 月旨，大量含鹽廢水的排出易引起管道腐蝕等等。液膜分離技術(shù)的研究開(kāi)發(fā)尚處于試驗(yàn)階段， 要實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，還必須解決諸如液膜溶脹、液膜穩(wěn)定性和破乳工藝等關(guān)鍵問(wèn)題。
[0003] 反向微膠團(tuán)萃取是從膠體或叫膠團(tuán)萃取發(fā)展而來(lái)的。早期的關(guān)于反向微膠團(tuán)的研 究是針對(duì)水在反向微膠團(tuán)的溶解，主要用于二次采油。進(jìn)入80年代以后，研究的重點(diǎn)轉(zhuǎn) 向應(yīng)用于蛋白質(zhì)和其他生物大分子的分離。反向微膠團(tuán)是溶在有機(jī)溶劑中的表面活性劑自 發(fā)形成的納米級(jí)的一種聚體，表面活性劑的極性尾在外與非極性的有機(jī)溶劑接觸，而極性 頭則排列在內(nèi)形成極性核，極性核溶于水后就形成了"水池"。當(dāng)含有氨基酸的水溶液與含 反向微膠團(tuán)的有機(jī)溶劑相混合時(shí)，氨基酸以帶電離子狀態(tài)進(jìn)入反向微膠團(tuán)的"水池"內(nèi)或 微膠團(tuán)球粒的界面分子膜層內(nèi)而被分離。如丁玉等在《反膠團(tuán)法萃取分離L-亮氨酸的研 究》（日用化學(xué)工業(yè)，2010年第40卷第5期）中使用Α0Τ/異辛烷/H20反膠團(tuán)體系萃取分 離L-亮氨酸，優(yōu)化了反應(yīng)條件，但其萃取方法還有待改進(jìn)，萃取效果還有待提高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問(wèn)題，提出了分離效率高，產(chǎn)品純度高 的L-亮氨酸的分離純化方法。
[0005] 本發(fā)明的目的可通過(guò)下列技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：一種L-亮氨酸的分離純化方法，所述 分離純化方法包括如下步驟：
[0006] 將L-亮氨酸發(fā)酵液進(jìn)行離心、超濾得超濾液，調(diào)整超濾液的PH值和離子強(qiáng)度；
[0007] 將表面活性劑加入到有機(jī)溶劑中形成反膠團(tuán)體系溶液，其中，表面活性劑在有機(jī) 溶劑中的濃度為〇. 03-0. 06mol/L，所述表面活性劑為Α0Τ和DTDPA的混合液；
[0008] 將調(diào)整后的超濾液加入到反膠團(tuán)體系溶液中進(jìn)行錯(cuò)流萃取，萃取后取有機(jī)相加入 到反萃取水相溶液中進(jìn)行逆流反萃取，反萃取后取水相進(jìn)行納濾、結(jié)晶、冷凍干燥，制得純 化L-亮氨酸。
[0009] 本發(fā)明在進(jìn)行分離純化時(shí)先進(jìn)行離心和超濾去除發(fā)酵液中的細(xì)胞碎片和蛋白質(zhì)、 核酸聚合物等大分子物質(zhì)，這些物質(zhì)不進(jìn)入反膠團(tuán)，使得反膠團(tuán)能夠循環(huán)利用，可以回收有 機(jī)溶劑和表面活性劑
[0010] 采用表面活性劑Α0Τ和DTDPA與有機(jī)溶劑形成A0T/DTDPA混合反膠團(tuán)體系對(duì)L-亮 氨酸進(jìn)行萃取，萃取能力優(yōu)于傳統(tǒng)單純使用Α0Τ反膠團(tuán)體系進(jìn)行提取，具有更高的分離效 率，并且反萃時(shí)也更加容易。
[0011] 決定L-亮氨酸萃取率的一個(gè)關(guān)鍵因素是表面活性劑的結(jié)構(gòu)。陰離子表面活性劑 Α0Τ容易獲得，具有雙鏈，形成反膠團(tuán)時(shí)可不用添加輔助表面活性劑且具有較好的強(qiáng)度； Α0Τ的極性基團(tuán)較小，所形成的反膠團(tuán)空間較大，有利于L-亮氨酸分子的進(jìn)入。但是Α0Τ 在使用時(shí)往往會(huì)在兩相界面上形成不溶性凝膠物質(zhì)，影響萃取效果。DTDPA為雙子表面活 性劑，具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和優(yōu)異的表面活性，其CMC值比傳統(tǒng)的表面活性劑低1-3個(gè)數(shù)量級(jí)， 形成反膠團(tuán)的能力強(qiáng)，其疏水尾能緊密堆積在L-亮氨酸表面，與Α0Τ配合使用可顯著提高 L-亮氨酸萃取率。并且DTDPA增加了萃取體系的抗無(wú)機(jī)鹽能力，使L-亮氨酸在較高的離子 強(qiáng)度下也能被萃取。適當(dāng)?shù)臒o(wú)機(jī)鹽濃度有利于DTDPA的CMC值的降低，這可能是因?yàn)闊o(wú)機(jī) 鹽電解出的正電離子在溶液中不斷趨近DTDPA帶負(fù)電的親水頭基，使其負(fù)電作用范圍和強(qiáng) 度大衛(wèi)縮小和減弱，導(dǎo)致DTDPA分子間的靜電斥力大大減小，在分子熱運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下更易締 合成膠團(tuán)。A0T/DTDPA混合反膠團(tuán)體系溶液的濃度控制在上述范圍內(nèi)，是因?yàn)榈陀谠摑舛确?圍則不能形成反膠團(tuán)，隨著A0T/DTDPA混合反膠團(tuán)體系溶液濃度的增加，反膠團(tuán)數(shù)目增加， 能夠增溶更多的L-亮氨酸，當(dāng)濃度增加的上述范圍的上限時(shí)，有機(jī)相達(dá)到飽和不能容解更 多的A0T/DTDPA。萃取時(shí)采用錯(cuò)流萃取的方式進(jìn)行，每級(jí)增加新鮮溶劑，萃取比較完全。反 萃取時(shí)米用二級(jí)逆流萃取，有機(jī)相和水相的走向相反，只在最后一級(jí)加入水相，無(wú)需大量的 水，所得L-亮氨酸的萃取液濃度較高，收率較高。所得L-亮氨酸萃取液通過(guò)納濾、結(jié)晶、冷 凍干燥的方式，制成純化L-亮氨酸，整個(gè)過(guò)程安全、高效、節(jié)能，對(duì)L-亮氨酸的截留率搞，冷 凍干燥方式所得產(chǎn)品的活性和純度高，品相好，水溶性好。
[0012] 作為優(yōu)選，所述超濾液采用鹽酸調(diào)節(jié)PH值至4. 5-5. 8,加入KC1或NaCl調(diào)節(jié)離子 強(qiáng)度至 〇· 35-0. 75mol/L。
[0013] 在表面活性劑Α0Τ和DTDPA和有機(jī)溶劑異辛烷形成的混合反膠團(tuán)體系中，表面活 性劑Α0Τ和DTDPA的極性頭朝向反膠團(tuán)的內(nèi)部，反膠團(tuán)的內(nèi)壁帶負(fù)電荷。L-亮氨酸是一種 兩性電解質(zhì)，水相的PH值決定了 L-亮氨酸的離子化程度。在PH值小于L-亮氨酸的等電 點(diǎn)時(shí)，L-亮氨酸帶正電荷，與A0T/DTDPA反膠團(tuán)內(nèi)所帶負(fù)電荷的性質(zhì)相反，由于靜電引力， 可使超濾液中的L-亮氨酸轉(zhuǎn)移到反膠團(tuán)中。另一方面，在酸性條件下，L-亮氨酸在水中的 溶解度會(huì)增加，從而在A0T/DTDPA反膠團(tuán)內(nèi)部水環(huán)境里的溶解度也會(huì)增加。因此，PH值的 降低有利于L-亮氨酸的反膠團(tuán)萃取，但同時(shí)隨著PH值的降低，H+濃度增大，必然導(dǎo)致Η +與 L-亮氨酸陽(yáng)離子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合A0T/DTDPA陰離子，從而不利于L-亮氨酸的萃取。另外，也為了 提高萃取的L-亮氨酸的純度，避免與L-亮氨酸等電點(diǎn)接近的其它氨基酸被同時(shí)萃取，將超 濾液的ΡΗ值控制在上述范圍內(nèi)。
[0014] 如前所述，DTDPA增加了萃取體系的抗無(wú)機(jī)鹽能力，使L-亮氨酸在較高的離子強(qiáng) 度下也能被萃取，但是離子強(qiáng)度不能無(wú)限增加。其原因在于，較高的離子強(qiáng)度會(huì)影響反膠團(tuán) 內(nèi)壁的靜電屏蔽的程度，降低L-亮氨酸分子與反膠團(tuán)內(nèi)壁的靜電作用力。減小表面活性劑 極性頭之間的相互斥力，減小反膠團(tuán)的W0值和反膠團(tuán)尺寸，使立體性相互（排除）作用增 大，從而降低L-亮氨酸在反膠團(tuán)中的溶解性，甚至使已溶解的L-亮氨酸從反膠團(tuán)中反萃取 出來(lái)。另一方面，較多的K+、Na+與L-亮氨酸存在競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)，不利于L-亮氨酸進(jìn)入到反膠團(tuán) 內(nèi)部與AOT/DTDPA陰離子結(jié)合。
[0015] 作為優(yōu)選，所述反膠團(tuán)體系溶液中表面活性劑Α0Τ和DTDPA的摩爾比為（3-7) :2， 所述有機(jī)溶劑為異辛烷。Α0Τ和DTDPA的摩爾比在該比例范圍內(nèi)時(shí)，Α0Τ和DTDPA的配合性 好，分離效果好，萃取效率高。相比其他有機(jī)溶劑，Α0Τ和DTDPA在異辛烷中能形成質(zhì)量較 好的反膠團(tuán)。
[0016] 作為優(yōu)選，所述反膠團(tuán)體系溶液中還含有占體系溶液8-13% v/v的助劑，所述助 劑為乙醇、丙醇、異丙醇或異丁醇的一種或幾種。
[0017] 在A0T/DTDPA混合反膠團(tuán)體系溶液中添加上述助劑可以改變反膠團(tuán)的大小，增加 L-亮氨酸的溶解度，并且使反萃更加完全。
[0018] 作為優(yōu)選，所述反膠團(tuán)體系溶液中還含有占體系溶液0. 01-0. 03% w/v的辛 基-β-D-吡喃葡糖苷。
[0019] 在反膠團(tuán)體系溶液中引入了與L-亮氨酸具有親和性的助劑辛基-β -D-吡喃葡糖 苷，辛基-β -D-吡喃葡糖苷的極性頭與L-亮氨酸具有較好的結(jié)合性，可大大提高L-亮氨 酸的萃取率和選擇性，而且擴(kuò)寬了萃取時(shí)的ΡΗ值范圍和離子強(qiáng)度范圍。
[0020] 作為優(yōu)選，所述反膠團(tuán)體系溶液中還含有占體系溶液0. 08-0. 22% v/v的THF。
[0021] 在A0T/DTDPA混合反膠團(tuán)體系中由于反膠團(tuán)的數(shù)量和濃度都很大，相互之間容易 發(fā)生聚積，影響L-亮氨酸進(jìn)入反膠團(tuán)內(nèi)部，從而降低了 L-亮氨酸的萃取率。因此，本發(fā)明 在A0T/DTDPA混合反膠團(tuán)體系溶液內(nèi)添加了適量的THF用以分散反膠團(tuán)，并促進(jìn)L-亮氨酸 進(jìn)入反膠團(tuán)內(nèi)部，加快L-亮氨酸的萃取，提高L-亮氨酸的萃取率。
[0022] 作為優(yōu)選，所述反萃取水相溶液為ΡΗ值為9. 0-10. 5,離子強(qiáng)度為1. 5-2. 3mol/L的 KC1或NaCl的緩沖溶液。
[0023] 當(dāng)水相PH值大于等電點(diǎn)時(shí)，L-亮氨酸帶負(fù)電荷，與A0T/DTDPA混合反膠團(tuán)內(nèi)部陰 離子所帶的負(fù)電荷產(chǎn)生靜電斥力，溶入反膠團(tuán)的L-亮氨酸反向萃取出來(lái)，實(shí)現(xiàn)L-亮氨酸的 反萃取。較高的離子強(qiáng)度有助于降低L-亮氨酸分子與反膠團(tuán)內(nèi)壁的靜電作用力，并且可替 代L-亮氨酸與反膠團(tuán)內(nèi)部陰離子結(jié)合，從而促進(jìn)反萃取的進(jìn)行。
[0024] 作為優(yōu)選，KC1或NaCl的緩沖溶液中的緩沖劑選自磷酸氫二鈉-檸檬酸、檸檬 酸-檸檬酸鈉或乙酸-乙酸鈉之一。
[0025] 作為優(yōu)選，反萃取水相溶液還含有0. 01-0. 03% w/v的葡萄糖、果糖或甲基葡糖 苷中的一種，
[0026] 在反萃取水相溶液在水相中引入葡萄糖、果糖或甲基葡糖苷等親和性糖類作為自 由配基，自由配基能與L-亮氨酸結(jié)合，減少L-亮氨酸與親和助劑辛基-β -D-吡喃葡糖苷 的復(fù)合物，使L-亮氨酸在有機(jī)相中的含量下降，增加 L-亮氨酸在反萃取水相溶液中的配 比，從而加快反萃取的速度和提高反萃取效率。
[0027] 作為優(yōu)選，所述錯(cuò)流萃取為三級(jí)錯(cuò)流萃取，錯(cuò)流萃取時(shí)超濾液和反膠團(tuán)體系溶液 的體積比為（4-11) :3。
[0028] 萃取時(shí)采用三級(jí)錯(cuò)流萃取的方式進(jìn)行，每級(jí)增加新鮮溶劑，萃取比較完全。
[0029] 作為優(yōu)選，所述逆流反萃取為三級(jí)逆流反萃取，逆流反萃取時(shí)有機(jī)相和反萃取水 相溶液的體積比為7 : (2-5)。
[0030] 反萃取時(shí)米用二級(jí)逆流反萃取，有機(jī)相和反萃取水相溶液的走向相反，只在最后 一級(jí)加入水相，無(wú)需大量的水，所得L-亮氨酸的萃取液濃度較高，收率較高。
[0031] 作為優(yōu)選，所述超濾的截留分子量為1000-2000,所述納濾的截留分子量為 200-300。
[0032] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0033] 采用A0T/DTDPA混合反膠團(tuán)體系對(duì)發(fā)酵液中的L-亮氨酸進(jìn)行萃取，有較高的萃取 能力和分離效率，并且反萃取時(shí)也更加容易，所得L-亮氨酸的活性和純度高。
[0034] 在萃取和反萃取時(shí)添加相應(yīng)的親和助劑，提高萃取效率。在反膠團(tuán)體系溶液中添 加了 THF能促進(jìn)L-亮氨酸進(jìn)入反膠團(tuán)內(nèi)部，加快L-亮氨酸的萃取，提高L-亮氨酸的萃取 率。
[0035] 采用錯(cuò)流萃取和逆流萃取相結(jié)合的方式，萃取較完全，采用納濾的方式對(duì)萃取液 進(jìn)行濃縮，高效、節(jié)能，對(duì)L-亮氨酸的截留率高，所得產(chǎn)品的活性和純度高，采用冷凍干燥 方式進(jìn)行干燥，所得產(chǎn)品含水量低，活性高，水溶性好，品相好，易保存。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 以下是本發(fā)明的具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的描述，