emistry Letters) 13 (2003)第 217 頁）中。
[0043] B的制備
[0044]
[0045] 在乙醇（IOOmL)中添加 Α(10· 0g，52. 08mmol)，然后將正丁胺（3. 81g，52. 08mmol) 和三乙胺（5. 27g，52.08mmol)添加至該溶液中。將該混合物加熱至回流持續(xù)8小時。允 許該溶液到達(dá)〇°C，并且將該固體經(jīng)由過濾分離并且用乙醇洗滌然后在真空下干燥以提供 B(IOg)0
[0046] LC-MS m/z = 229 (M+H) ；1. 20min
[0047] 1H NMR(400MHz，d-氯仿）δ ppm 〇· 95(t，3H)，I. 31-1. 42(m，2H)，I. 53-1. 65(m， 2H)，3.40-3.50(m，2H)，5. 11 (br.s.，2H)，9.22 (br.s.，1H)，10.07 (s，lH)
[0048] C的制備
[0050] 在0 °C下，將NaBH4 (4g，105. 73mmol)以小部分添加至在甲醇中的B的混合物 (8. 0g，35mmol)中。在室溫下攪拌該混合物30分鐘。在0°C下，將混合物緩慢地用飽和 NaHCO3(IOOmL)和H2O(IOOmL)進(jìn)行處理，然后在室溫下攪拌10分鐘。通過過濾分離沉淀物 并且用水（50mL)和乙酸乙酯：甲基叔丁基醚（1 : 5)進(jìn)行洗滌。將該濾液用乙酸乙酯（2X 200mL)萃取。將合并的有機(jī)層用鹽水進(jìn)行洗滌，干燥（Na2SO4),將固體通過過濾去除，并且 將濾液的溶劑在減壓下去除。用乙酸乙酯：甲基叔丁基醚（1 : 5)處理該殘余物。將沉淀 物通過過濾分離并且用甲基叔丁基醚進(jìn)行洗滌。合并沉淀物并且干燥（真空，50°C，30分 鐘）以提供C。
[0051] LC-MS m/z = 231 (M+H)，0· 90min
[0052] 1H NMR (400MHz，DMS0-d6) δ ppm 0.90 (t，3H)，1.31 (m，2H)，1.50 (m，2H)，3.28 (m， 2H)，4. 4 (m，2H)，4. 92 (m，1H)，6. 29 (br. s.，2H)，6. 55 (m，1H)
[0053] D的制備
[0055] 在室溫下，將NaOH(l. 6g，40mmol)在H20(5mL)中的溶液添加至C(5. 8g， 21.37mmol，純度85%)在乙醇（150mL)中的溶液里。向其中添加10%Pd/C(0. 6g)。密封燒 瓶并且暴露于氫氣持續(xù)15小時。去除該氫氣并且用氮?dú)馓娲?，通過過濾去除催化劑，并且 在減壓下去除濾液的溶劑。添加乙酸乙酯并且將該混合物用H20、鹽水洗滌，干燥（Na2SO 4)13 將固體經(jīng)由過濾去除，并且將濾液的溶劑在減壓下去除。用甲基叔丁基醚洗滌該殘余物。將 沉淀物通過過濾分離并且用甲基叔丁基醚進(jìn)行洗滌。收集該固體并且干燥（真空，50°C，30 分鐘）以提供D。
[0056] LC-MS m/z = 197(M+H) ；3. 21min
[0057] 4匪1?(4001泡，0150-(16)5??1110.90(扒了 = 7.4泡，3!1)，1.24-1.41(111，2!1)， 1.41-1.59(m，2H)，3.23-3.34(m，2H)，4.21(br. s.，2H)，4.85(br. s.，lH)，5.87(s，2H)， 6. 19 (t, J = 5. 3Hz, 1H), 7. 50 (s, 1H)
[0058] 化合物I的制備
[0060] 在 0°C下，在 N2氣氛下，將 DIAD (I. 3g，6. 429mmol)添加至 D (0· 5g，2. 29mmol，純度 90%)、2-羥基吡啶（0.3268,3.43臟〇1)和三丁基膦（1.348,6.62臟〇1)在無水1'冊（1011^) 中的混合物里。將該混合物在室溫下攪拌過夜并且然回流3h。將該混合物在真空下蒸發(fā)。 用石油醚：甲基叔丁基醚（1 : 1)處理該殘余物。在減壓下蒸發(fā)該混合物。添加甲基叔丁 基醚。將該混合物在〇°C下攪拌20min。通過過濾分離沉淀物并且用甲基叔丁基醚進(jìn)行洗 滌。收集該固體并且干燥（真空，50°C，30分鐘）以提供1。
[0061] 表1.具有化學(xué)式⑴的化合物。
[0062]
[0065] 分析方法。所有化合物使用以下方法通過LC-MS進(jìn)行表征：
[0066] 方法 A.
[0068] 具有化學(xué)式（I)的化合物的牛物活件
[0069] 生物測定說明
[0070] TLR7和TLR8活性的評估
[0071] 在細(xì)胞報告基因測定中，使用瞬時轉(zhuǎn)染了 TLR7或TLR8表達(dá)載體以及NFk B-Iuc 報告基因構(gòu)建體的HEK293細(xì)胞對這些化合物活化人TLR7和/或TLR8的能力進(jìn)行評估。
[0072] 簡而言之，使HEK293細(xì)胞生長在培養(yǎng)基（補(bǔ)充有10% FCS和2mM谷氨酰胺的 DMEM)中。對于在15cm培養(yǎng)皿中的細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，用胰蛋白酶-EDTA將細(xì)胞分散，用CMV-TLR7 或TLR8質(zhì)粒（1700ng)、NF κ B-Iuc質(zhì)粒（850ng)和轉(zhuǎn)染試劑的混合物對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并 且在37°C下在濕潤的5% CO2氣氛下孵育48h。然后將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在PBS中洗滌，用胰蛋 白酶-EDTA分離并且在培養(yǎng)基中重懸至I. 25x IO5個細(xì)胞/mL的密度。然后將四十微升的 細(xì)胞分配至384-孔板中的每一個孔中，在孔中已經(jīng)存在200nL的化合物（在100% DMSO 中）。在37°C、5% CO2下孵育6小時后，通過向每個孔中添加15 yL的Steady Lite Plus 底物（?金埃爾默公司（Perkin Elmer))并且在ViewLux ultraHTS微孔板成像儀（?金 埃爾默公司）上進(jìn)行讀出來確定熒光素酶活性。從按一式四份進(jìn)行的測量值生成劑量反應(yīng) 曲線。對每個化合物的最低有效濃度（LEC)值進(jìn)行確定，該最低有效濃度值被定義為引發(fā) 超出測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差至少兩倍的效應(yīng)的濃度。
[0073] 在384-孔板中，使用化合物的類似稀釋系列和每孔40 μ L的單獨(dú)用CMV-TLR7構(gòu) 建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（1.25x IO5個細(xì)胞/mL)對化合物毒性進(jìn)行平行確定。在37°C、5%C〇2 下孵育6小時后，通過每孔中添加15 μ 1的ATP Iite (珀金埃爾默公司）并且在ViewLux UltraHTS微孔板成像儀（珀金埃爾默公司）上讀數(shù)來測量細(xì)胞活力。數(shù)據(jù)以CC 5。進(jìn)行報 告。
[0074] 平行地，使用一種相似稀釋系列的化合物（在100% DMSO中的200nL的化合物） 和每孔40 μ L的單獨(dú)用NF K B-Iuc報告基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（I. 25x IO5個細(xì)胞/mL)。在 37°C、5%C(Vf孵育后6小時，通過向每個孔中添加15μ1的Steady Lite Plus底物（珀 金埃爾默公司）并且在ViewLux ultraHTS微孔板成像儀（?金埃爾默公司）上進(jìn)行讀出 來確定熒光素酶活性。將計(jì)數(shù)器屏幕數(shù)據(jù)報告為LEC。
[0075] ISRE啟動子元件的活化
[0076] 還通過測量由來自PBMC的條件培養(yǎng)基造成的干擾素刺激應(yīng)答元件（ISRE)的活 化而對這些化合物誘導(dǎo)IFN-I的潛力進(jìn)行了評估。具有序列GAAACTGAAACT的ISRE元件 高度響應(yīng)于STAT1-STAT2-IRF9轉(zhuǎn)錄因子，在IFN-I結(jié)合至它們的受體IFNAR(Clontech， PT3372-5W)時被活化。來自Clontech (參考號631913)的質(zhì)粒pISRE-Luc包含5個這種 ISRE元件拷貝，隨后是螢火蟲熒光素酶0RF。建立一種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pISRE-Luc (HEK-ISREluc) 的HEK293細(xì)胞系來分析PBMC條件細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0077] 簡言之，從至少兩個供體的血沉棕黃層使用標(biāo)準(zhǔn)的聚蔗糖（Ficoll)離心方案來 制備PBMC。將分離的PBMC重懸于補(bǔ)充有10 %人AB血清的RPMI培養(yǎng)基中，并且將2x IO5 個細(xì)胞/孔分配至含有化合物（70 μ L總體積）的384-孔板中。孵育過夜后，將10 μ L的 上清液轉(zhuǎn)移至包含5x 103HEK-ISREluc細(xì)胞/孔（30 μ L)(前一天鋪板）的384-孔板。經(jīng) 24小時孵育后，通過測定熒光素酶活性（使用40 μ L/孔SteadyLitePlus底物（珀金埃爾 默公司），并且用ViewLuxultraHTS微孔板成像儀（珀金埃爾默公司）測量）而對ISRE元 件的活化進(jìn)行測量。每個化合物對HEK-ISREluc細(xì)胞的刺激活性被報告為LEC值，該LEC 值定義為施用至PBMC導(dǎo)致熒光素酶活性至少超出測定標(biāo)準(zhǔn)偏差兩倍的化合物濃度。LEC 進(jìn)而指示在轉(zhuǎn)移定義量的PBMC培養(yǎng)基時ISRE活化的程度。將重組干擾素 a -2a(羅擾 素-A(Roferon-A))用作標(biāo)準(zhǔn)對照化合物。
[0078] 具有化學(xué)式（I)的化合物的生物活性所有的化合物顯示了 > 24uM的CC50。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有化學(xué)式（I)的化合物或其一種藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或多晶型物，其中 Ri是可任選地被一個或多個取代基取代的C1e烷基，運(yùn)些取代基獨(dú)立地選自芳基、面 素、徑基、氨基、簇酸、簇酸醋、簇酸酷胺、酷基橫酷胺、Cl3烷基、Cse環(huán)烷基、諷、亞諷、橫酷 胺、雜環(huán)或臘； 尺2、R3、Rzi和R迦立地選自氨、面素、C1 3烷基、C1 3烷氧基、C3 15環(huán)烷基、芳基、-CF3或雜 環(huán)； 或其中 將Rz與R3稠合W形成一種環(huán)狀結(jié)構(gòu)， 將Rs與R4稠合W形成一種環(huán)狀結(jié)構(gòu)或者 將Ra與R5稠合W形成一種環(huán)狀結(jié)構(gòu)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有化學(xué)式（I)的化合物，其中Ri是正下基并且其中R2、尺3、 Ra和R5是氨。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有化學(xué)式（I)的化合物，其中R1是正下基并且其中將Rz與 Rs稠合W形成一種環(huán)狀結(jié)構(gòu)，將R3與R4稠合W形成一種環(huán)狀結(jié)構(gòu)或者將R4與R^^合W形 成一種環(huán)狀結(jié)構(gòu)。4. 一種藥物組合物，包括根據(jù)權(quán)利要求1-3中的一項(xiàng)所述的具有化學(xué)式（I)的化合物 或其一種藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或多晶型物，連同一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形 劑、稀釋劑或載體。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中的一項(xiàng)所述的具有化學(xué)式（I)的化合物或其一種藥學(xué)上可接受 的鹽、溶劑化物或多晶型物，或根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物，用作一種藥劑。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中的一項(xiàng)所述的具有化學(xué)式（I)的化合物或其一種藥學(xué)上可接 受的鹽、溶劑化物或多晶型物，或根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物，用于在治療其中設(shè)及 化R7和/或化R8的調(diào)節(jié)的失調(diào)中使用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及吡啶酮衍生物、用于制備它們的方法、藥物組合物、以及它們在治療中的用途。
【IPC分類】C07D401/06, A61K31/506
【公開號】CN105377833
【申請?zhí)枴緾N201480029367
【發(fā)明人】D.C.麥高恩, P.J-M.B.拉博伊斯森
【申請人】愛爾蘭詹森科學(xué)公司
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2014年5月23日
【公告號】CA2912338A1, EP3004074A1, US20160108021, WO2014187932A1