一種peg-長鏈脂肪烷定點修飾的人生長激素及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種將PEG-長鏈脂肪烷定點修飾在人生長激素的N-末端，以及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]人生長激素(human growth hormone, hGH)是由腦垂體前葉嗜酸性細(xì)胞分泌的一種單一肽鏈的蛋白質(zhì)激素，有191個氨基酸殘基，分子量為22kDa，分子中無糖基，且具有4個α-螺旋和兩個鏈內(nèi)二硫鍵。hGH通過與分布于組織細(xì)胞表面的生長激素受體結(jié)合而發(fā)揮其生理功能。hGH的主要生理功能包括間接的促細(xì)胞生長作用、直接的代謝調(diào)理作用和免疫調(diào)節(jié)作用。hGH可用于治療生長激素缺乏兒童矮小癥、Turner氏綜合癥、艾滋病消瘦、大面積創(chuàng)傷等疾病。由于hGH的分子量小、在體內(nèi)易被腎小球過濾和酶降解，采取靜脈和皮下注射給藥會導(dǎo)致其在體內(nèi)的血漿半衰期短。在臨床使用時需要頻繁給藥才能保持有效的血藥濃度和治療效果，這不僅在生理、心理和經(jīng)濟上對患者造成了極大的負(fù)擔(dān)，且易產(chǎn)生耐受性及免疫排斥等不良反應(yīng)。因此，開發(fā)耐受性好、省錢、且易為患者接受的hGH長效劑型已成為人們關(guān)注的焦點之一。
[0003]目前，用于延長蛋白質(zhì)藥物血漿半衰期的方法主要基于化學(xué)修飾或者基因工程融合表達(dá)。其中，聚乙二醇(PEG)修飾和結(jié)合人血清白蛋白(HSA)是兩種常用的方法，可有效延長hGH的血漿半衰期，達(dá)到長效治療的目的。PEG是中性、無毒，且具有良好生物相容性的高分子聚合物。PEG修飾可有效降低蛋白質(zhì)的免疫原性和腎小球的過濾作用，從而延長蛋白質(zhì)在體內(nèi)的血漿半衰期。然而，PEG對蛋白質(zhì)藥物的空間屏蔽作用會減弱蛋白質(zhì)藥物與其受體的相互作用，從而導(dǎo)致其生物活性的降低，甚至完全喪失。人血清白蛋白(HSA)是人血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，分子量約為66.5kDa，在人體內(nèi)的血漿半衰期約為19天，具有安全無毒、生物相容性好、無免疫原性等特點。通過HSA與蛋白質(zhì)藥物化學(xué)偶聯(lián)或者基因融合表達(dá)，可以顯著延長蛋白質(zhì)藥物的血漿半衰期，同時降低其免疫原性和抗原性。然而，HSA的空間屏蔽作用極大地降低了蛋白質(zhì)的生物活性。因此，臨床試驗結(jié)果開始質(zhì)疑傳統(tǒng)蛋白質(zhì)藥物長效劑型的研發(fā)策略，即通過增加血漿半衰期來提高藥效。
[0004]HSA由三個柔性的球形結(jié)構(gòu)域(1、II和III)組成，并擁有5個長鏈脂肪酸(Myrl-5)結(jié)合位點，且解離常數(shù)在10_8_10_7M的范圍內(nèi)。最近，人們研發(fā)了長鏈脂肪酸?；揎椀亩嚯乃幬铩Ｆ溲邪l(fā)策略是通過長鏈脂肪酸與HSA的結(jié)合，延長多肽藥物的血漿半衰期；通過長鏈脂肪酸與HSA的緩慢釋放，逐步恢復(fù)多肽藥物的生物活性。例如，丹麥NovoNordisk公司通過十四烷酸(肉豆蔻酸)結(jié)合胰島素，開發(fā)了一種新型的長效胰島素(商品名:Levemir)，用于治療I型和2型糖尿病，并于2004年被美國FDA批準(zhǔn)上市。隨后，該公司通過十六烷酸(棕櫚酸)結(jié)合胰高血糖素樣肽l(GLP-l)，開發(fā)了一種新型的長效GLP-1(商品名:Liraglutide)，其中GLP-1的血楽半衰期從2分鐘延長到13小時。Liraglutide主要用于治療2型糖尿病，已于2010年被美國FDA批準(zhǔn)上市。
[0005]在PEG修飾和長鏈脂肪酸?；揎椀幕A(chǔ)上，Kim等使用分子量為20kDa的分支型PEG，在其4個臂上分別連接了 2個Exendin-4 (Ex4)多肽分子和2個16碳的長鏈脂肪烷，用于治療2型糖尿病。其研宄策略是通過修飾的PEG鏈和結(jié)合的HSA來延長Ex4的血漿半衰期。與未修飾的Ex4相比，修飾產(chǎn)物(Ex4-PEG-C16)的血漿半衰期和曲線下面積(AUC)增加了 6倍。然而，該研宄策略存在以下缺陷:(I)PEG的琥珀酰亞胺(NHS)基團(tuán)會隨機修飾到Ex4賴氨酸殘基的ε -氨基和N-末端氨基酸殘基的α -氨基，而有些氨基酸殘基靠近Εχ4的活性中心，修飾這些位點會顯著降低Εχ4的生物活性；(2)高分子量的PEG(20kDa)由于能高效地結(jié)合水分子，會極大地降低HSA與十六烷的結(jié)合能力，不利于增加Ex4的血漿半衰期；(3)不能用于蛋白質(zhì)藥物的化學(xué)修飾。將蛋白質(zhì)直接加入混有有機溶劑的PEG化十六烷，有機溶劑會引起蛋白質(zhì)沉淀，導(dǎo)致其生物活性的喪失；PEG鏈上的NHS基團(tuán)在有機溶劑中穩(wěn)定，而在水溶液中極易水解，在去除有機溶劑的過程中因NHS基團(tuán)的水解而無法修飾蛋白質(zhì)。因此，我們迫切需要研發(fā)針對蛋白質(zhì)藥物的PEG-長鏈脂肪烷修飾技術(shù)，優(yōu)化PEG連接橋的分子量，并將PEG-長鏈脂肪烷定點修飾到遠(yuǎn)離蛋白質(zhì)藥物活性中心的位點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對上述問題，本發(fā)明提出了一種將PEG-十六烷定點修飾到hGH的N-末端的方法。最終修飾產(chǎn)物的成分單一，易于修飾產(chǎn)物的分離純化和質(zhì)量控制，并能減少hGH生物活性的損失。
[0007]本發(fā)明以PEG-十六烷定點單修飾人生長激素的N末端，包括以下步驟:
[0008](I)制備PEG-十六烷修飾的人生長激素。分別采用分子量為3.5kDa和1kDa的馬來酰亞胺-PEG-琥珀酰亞胺酯(mal-PEG-NHS)與十六胺反應(yīng)，引入十六烷；修飾產(chǎn)物(mal-PEG-HD)的馬來酰亞胺基團(tuán)與1_硫代甘油反應(yīng)，引入鄰位羥基，采用高碘酸鈉(Na14)氧化鄰位羥基生成醛基。而后根據(jù)醛化學(xué)反應(yīng)原理將帶醛基的PEG-十六烷定點修飾在hGH的N-末端的α -氨基，即每個hGH分子的N-末端結(jié)合I個PEG-十六烷分子。其中，分子量為3.5kDa的PEG-十六烷(mal_P3.5-HD)修飾產(chǎn)物由hGH_P3.5-HD代表；分子量為1kDa的PEG-十六烷(mal-P10_HD)修飾產(chǎn)物由hGH-P10_HD代表。
[0009](2)制備PEG修飾的人生長激素。按照一定的反應(yīng)條件，將分子量為1kDa的PEG-醛定點修飾在hGH的N-末端的α -氨基，即每個hGH分子的I個PEG分子。PEG修飾產(chǎn)物由hGH-ΡΙΟ代表，作為hGH-P10-HD的對照。
[0010](3)修飾產(chǎn)物的分離純化與鑒定。hGH-P3.5-HD和hGH-P10-HD由mono Q陰離子交換柱(0.5cmX5cm,美國 GE Healthcare 公司)進(jìn)純化。hGH-ΡΙΟ 由 Q SepharoseHighPerformance陰離子交換柱(1.6cmX2.5cm,美國GE Healthcare公司)進(jìn)行純化。洗脫物均采用280nm的紫外波長進(jìn)行檢測，進(jìn)行收集。濃縮后純化產(chǎn)物采用SDS-PAGE和凝膠過濾色譜鑒定。
[0011](4)hGH-P3.5-HD 和 hGH-P10-HD 修飾位點的鑒定。將 hGH、hGH_P3.5-HD 和hGH-P10-HD置換到含2.0M脲的0.05M的NH4HCO3 (pH 8.2)的緩沖液中，將蛋白濃度調(diào)整為1.0毫克/毫升。將胰蛋白酶和蛋白以質(zhì)量比為1:50的比例，于37°C下孵育14小時，酶解產(chǎn)物由C4反相色譜柱進(jìn)行分離和鑒定。
[0012](5)修飾產(chǎn)物的免疫原性分析:將24只6-8周的BALB/c雌鼠隨機分為4組，每組6只，A組為hGH組，B組為hGH-P3.5-HD組，C組為hGH-P10-HD組，D組為hGH-P1組。于0、7、14天行皮下注射，21天處死后，收集血清。血清中hGH特異的IgG抗體采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)進(jìn)行測定。
[0013](6)修飾產(chǎn)物的體外活性分析:采用表面等離子共振技術(shù)測定hGH及其修飾產(chǎn)物與生長激素結(jié)合蛋白(GHBP)的體外結(jié)合活性。將GHBP固定在CM5芯片上，結(jié)合過程采用不用的樣品濃度進(jìn)行測定，使用1:1朗繆爾結(jié)合模型進(jìn)行分析。測定樣品的結(jié)合速率CO、解離速率(kd)以及解離常數(shù)(Kd)。
[0014](7)修飾產(chǎn)物的藥代動力學(xué)分析:選取250?300克雄性SD大鼠24只，隨機分為4組。其中，A組為hGH、B組為hGH-P3.5_HD、C組為hGH-P10_HD、D組為hGH-P1組，經(jīng)皮下注射，注射劑量為I毫克hGH/公斤大鼠，體積為500微升。經(jīng)皮下注射后，在不同的時間范圍內(nèi)進(jìn)行眼眶采血，離心收集血漿。用ELISA試劑盒測定血漿中hGH及其修飾樣品的含量。
[0015](8)修飾產(chǎn)物的藥效動力學(xué)分析:選取250?300克雄性SD大鼠30只，隨機分為5組。其中，A組為對照組，皮下注射500微升0.15mol/L的磷酸緩沖液組為hGH、C組為hGH-P3.5-HD、D組為hGH-P10k_HD、E組為hGH-P1組，經(jīng)皮下注射，注射劑量為I毫克hGH/公斤大鼠，體積為500微升。經(jīng)皮下注射后，在不同的時間范圍內(nèi)進(jìn)行眼眶采血，離心收集血漿。用ELISA試劑盒測定血漿中IGF-1的含量。
[0016]與傳統(tǒng)的修飾策略相比，本發(fā)明的優(yōu)勢在于提供了一種以低分子量的雙功能PEG為連接橋，PEG的一端