本發(fā)明涉及生物學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種引物組及其制備的試劑盒和應(yīng)用，用于檢測大腸桿菌o103、o111、o145血清型。

背景技術(shù)：

大腸桿菌又稱大腸埃希氏菌(escherichiacoli)，1885年首次被發(fā)現(xiàn)，在相當(dāng)長的一段時間內(nèi)，一直被當(dāng)作正常腸道菌群的組成部分，認為是非致病菌。直到20世紀中葉，才認識到一些特殊血清型的大腸桿菌對人和動物有致病性。致病性大腸桿菌(pathogenicescherichiacoli)主要引起急性腹瀉，所以又稱致腹瀉性大腸桿菌。根據(jù)o抗原分型，致病性大腸桿菌約有60個血清型，按發(fā)病機制可將其分為5類：①腸毒素性大腸桿菌(enterotoxigenice.coli，etec)；②腸致病性大腸桿菌(enteropathogenice.coli，epec)；③腸侵襲性大腸桿菌(enteroinvasivee.coli，eiec)；④腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagice.coli，ehec)；⑤腸黏附性大腸桿菌(enteroadherente.coli，eaec)。致病性大腸桿菌感染主要經(jīng)糞口途徑傳播。在世界各地廣泛存在，可呈散發(fā)或暴發(fā)流行，也曾引起院內(nèi)感染的暴發(fā)流行。

大腸桿菌o157:h7是大腸桿菌的其中一個類型，該種病菌常見于牛只等溫血動物的腸內(nèi)。這一型的大腸桿菌會釋放一種強烈的毒素，并可能導(dǎo)致腸管出現(xiàn)嚴重癥狀。o157:h7引起的出血性結(jié)腸炎是1982年在美國俄勒崗州和密執(zhí)安州，因食用漢堡包引起的食物中毒的病人糞便中被分離并命名的。據(jù)美國疾病控制中心(cdc)報告，每年全國約發(fā)現(xiàn)2萬多例病人。死亡人數(shù)200-500人，以后陸續(xù)在全球五大州20多個國家被發(fā)現(xiàn)或引起暴發(fā)和流行。我國1988年首次分離到e.colio157:h7。從已有的流行病學(xué)調(diào)查資料看，我國也存在散發(fā)病例，還沒有爆發(fā)流行的報道。近幾年也通過監(jiān)測，先后從牛、豬、羊、糞便，肉類等食品中查到e.colio157:h7。近年來，產(chǎn)毒素而非o157的大腸桿菌，嚴重威脅人類的健康，越來越受到世界各國的關(guān)注。據(jù)統(tǒng)計，在美國由non-o157stec引起的患病病例中，有71％是由o26、o45、o103、o111、o121、o145血清型引起的。為了保障人類的健康和牛肉市場的正常供應(yīng)，2011年9月，美國農(nóng)業(yè)部頒布了一項禁止出售帶有大腸桿菌“thebigsix”(o26、o45、o103、o111、o121、o145)牛肉制品的法令。

大腸桿菌表面抗原o-抗原是刺激機體產(chǎn)生先天性免疫和獲得性免疫的重要毒力因子，在大腸桿菌的致病性過程中起著重要的作用。針對于o抗原的傳統(tǒng)血凝試驗是檢測血清型的主要方法，該方法費時、費力，pcr檢測技術(shù)在大腸桿菌血清型檢測過程得到發(fā)展和應(yīng)用，目前，針對o103、o111、o145血清型多重pcr檢測方法還未見報道，因此，研究一種適用于不同檢測平臺的多重pcr檢測方法應(yīng)用于o103、o111、o145血清型的檢測方法并組裝成試劑盒，同時具備特異、敏感、省時、省力的優(yōu)點，是本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明就是針對上述存在的缺陷而提供一種引物組及其制備的試劑盒和應(yīng)用。本發(fā)明的試劑盒對引物組能在同一反應(yīng)體系能進行有效擴增。實驗表明，本發(fā)明所述含該引物組的檢測試劑盒具有特異、敏感、快速和操作簡單的特點，能較好的豐富當(dāng)前大腸桿菌o103、o111、o145血清分型檢測技術(shù)，可以滿足當(dāng)前大腸桿菌o103、o111、o145血清型分型的快速檢測需求，易于推廣應(yīng)用，適用于食品和生物領(lǐng)域中3種血清型大腸桿菌的初篩選，具有廣闊的市場應(yīng)用前景。

本發(fā)明的一種引物組及其制備的試劑盒和應(yīng)用技術(shù)方案為：一種引物組，包括以下引物序列，其核苷酸序列分別為：

o103上游:5'-tgattggagcgttaactggacct-3',

o103下游:5'-aaagctcccgagcacgtataaag-3'；

o111上游:5'-atttgtttcttcgatgttgcgag-3',

o111下游:5'-aaggcaagggacataagaagcca-3'；

o145上游:5'-attttcattgttttgcttgctcg-3',

o145下游:5'-caaggcaagctttggaaatgaaa-3'。

大腸桿菌o103血清型特異性引物擴增的目的片段大小為：327bp；

大腸桿菌o111血清型特異性引物擴增的目的片段大小為：444bp；

大腸桿菌o145血清型特異性引物擴增的目的片段大小為：756bp。

一種試劑盒，包含權(quán)利要求1所述的引物組合物。

該試劑盒還含有商品化的2×pcr反應(yīng)液。

上述的引物組，或者上述的試劑盒，在大腸桿菌o103、o111、o145血清型檢測中的用途。

一種大腸桿菌o103、o111、o145血清型檢測方法，使用如權(quán)利要求2所述的試劑盒，包括以下步驟：將待測大腸桿菌菌液或待測大腸桿菌的dna提取物作為模板，用所述引物組進行pcr擴增，對擴增產(chǎn)物進行檢測，大腸桿菌o103血清型電泳結(jié)果出現(xiàn)327bp條帶；大腸桿菌o111血清型出現(xiàn)444bp條帶；大腸桿菌o145血清型出現(xiàn)756bp條帶。

pcr反應(yīng)體系為50μl時含有：2×pcrbuffer25μl、各引物濃度為5μm引物的混合液5μl、模板3μl、超純水17μl。

pcr參數(shù)：95℃預(yù)變性10min；95℃45s，57℃1min，72℃1min，32個循環(huán)；72℃6min。

所述的一種大腸桿菌o103、o111、o145血清型檢測方法，包括以下步驟：

(1)大腸桿菌模板的制備

將待測大腸桿菌菌株菌液接種至lb液體培養(yǎng)基，37℃過夜搖菌，取1ml菌液，分別用煮沸法和商品化細菌基因組提取試劑盒，進行模板制備；

(2)特異性引物的制備o抗原特異性引物o103上游、o103下游、o111上游、o111下游、o145上游和o145下游的使用濃度為5μm；引物稀釋液置于-20℃保存?zhèn)溆?，避免反?fù)凍融；

(3)pcr反應(yīng)體系的建立和擴增

取滅菌處理pcr反應(yīng)管，分別加2×pcr反應(yīng)混合液25μl、引物o103上游、o103下游、o111上游、o111下游、o145上游和o145下游引物組混合液5μl、模板3.0μl、超純水17.0μl，混勻；pcr反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性10min；95℃45s，57℃1min，72℃1min，32個循環(huán)；72℃6min；

(4)pcr檢測結(jié)果判定

取8μlpcr產(chǎn)物，點樣于1.2％瓊脂糖凝膠電泳板孔中，120v電壓，電泳20min，于凝膠成像系統(tǒng)下拍照判定，判定前提條件為陰性對照無任何條帶出現(xiàn)，具體判定方法：電泳結(jié)果出現(xiàn)327bp條帶為大腸桿菌o103血清型；出現(xiàn)444bp條帶為大腸桿菌o111血清型；出現(xiàn)756bp條帶為大腸桿菌o145血清型。

本發(fā)明的有益效果為：血清凝集試驗是傳統(tǒng)的大腸桿菌檢測技術(shù)，缺點是費時費力、交叉反應(yīng)嚴重，敏感性低。本發(fā)明基于大腸桿菌o抗原基因血清型特異性基因區(qū)段，設(shè)計可以在同一檢測體系進行以o103、o111、o145血清型大腸桿菌o抗原基因的特異性引物，采用聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)判定該菌大腸桿菌的血清型。所述檢測試劑盒及其檢測方法具有特異、敏感、快速、成本低和操作簡單的特點，能較好的彌補當(dāng)前大腸桿菌血清型檢測方法上的不足，易于大范圍推廣應(yīng)用，具有廣闊的市場應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1所示為實施例2大腸桿菌o103、o111、o145血清型pcr檢測電泳圖；

圖2所示為實施例3大腸桿菌o103、o111、o145血清型pcr檢測試劑盒特異性檢測電泳圖；

圖3所示為實施例3以大腸桿菌培養(yǎng)物為模板的pcr檢測試劑盒靈敏度檢測電泳圖；

圖4所示為實施例3以大腸桿菌基因組dna為模板的pcr檢測試劑盒靈敏度檢測電泳圖。

具體實施方式：

為了更好地理解本發(fā)明，下面用具體實例來詳細說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但是本發(fā)明并不局限于此。

實施例1

大腸桿菌o103、o111、o145血清型檢測引物組的設(shè)計

一種引物組，其核苷酸序列分別為：

o103上游:5'-tgattggagcgttaactggacct-3',

o103下游:5'-aaagctcccgagcacgtataaag-3'；

o111上游:5'-atttgtttcttcgatgttgcgag-3',

o111下游:5'-aaggcaagggacataagaagcca-3'；

o145上游:5'-attttcattgttttgcttgctcg-3',

o145下游:5'-caaggcaagctttggaaatgaaa-3'；

設(shè)計的3對血清型特異性引物。根據(jù)設(shè)計的引物組分別擴增327bp、444bp和756bp的o103、o111、o145血清型特異性目的片段。

實施例2

大腸桿菌o103、o111、o145血清型檢測試劑盒的制備

(1)大腸桿菌模板的制備

調(diào)取大腸桿菌菌單菌落接種至lb液體培養(yǎng)基，37℃增菌過夜。各取1ml菌液，制成模板備用。

(2)特異性引物的制備

本試劑盒檢測的大腸桿菌o103、o111、o145血清型特異性引物擴增的目的片段大小分別為：327bp(o103)、444bp(o111)和756bp(o145)。各條引物使用濃度為5μm，引物稀釋液置于-20℃保存?zhèn)溆?，避免反?fù)凍融；可根據(jù)如下引物序列人工合成。

o103上游:5'-tgattggagcgttaactggacct-3',

o103下游:5'-aaagctcccgagcacgtataaag-3'；

o111上游:5'-atttgtttcttcgatgttgcgag-3',

o111下游:5'-aaggcaagggacataagaagcca-3'；

o145上游:5'-attttcattgttttgcttgctcg-3',

o145下游:5'-caaggcaagctttggaaatgaaa-3'；

(3)pcr反應(yīng)體系的建立和擴增

取滅菌處理pcr反應(yīng)管，分別加2×pcr反應(yīng)混合液25μl、引物o103-上游、o103-下游、o111-上游、o111-下游、o145-上游和o145-下游引物組混合液5μl、模板3.0μl、超純水17.0μl，混勻；pcr反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性10min；95℃45s，57℃1min，72℃1min，32個循環(huán)；72℃6min

(4)pcr檢測結(jié)果判定

取8μlpcr擴增產(chǎn)物，點樣于1.2％瓊脂糖凝膠電泳板孔中，120v電壓，電泳20min，于凝膠成像系統(tǒng)下拍照判定，判定前提條件為陰性對照無任何條帶出現(xiàn)。

具體判定方法：電泳結(jié)果出現(xiàn)327bp條帶為大腸桿菌o103血清型(說明書附圖圖1第1泳道)；出現(xiàn)444bp條帶為大腸桿菌o111血清型(說明書附圖圖1第2泳道)；出現(xiàn)756bp條帶為大腸桿菌o145血清型(說明書附圖圖1第3泳道)。

實施例3

大腸桿菌o103、o111、o145血清型檢測試劑盒的特異性和敏感性評價

本實施例中對實施例2中制備的大腸桿菌o103、o111、o145血清型檢測試劑盒特異性、敏感性和重復(fù)性等主要特征分別進行了測評。

(1)試劑盒特異性試驗

選取大腸桿菌o26、o45、o121、o103、o145、o113、o111、o157、o78、o101、鼠傷寒沙門氏菌(cvcc3384)、腸炎沙門氏菌(cvcc1805)、雞白痢沙門氏菌(cvcc519)、鴨沙門氏菌(cau0118)、禽巴氏桿菌(cvcc493)、雞毒支原體(cvcc1651)、禽支原體(cvcc274)、金黃色葡萄球菌(cvcc543)、禽波氏菌(atcc菌株ipdh591-77)、豬2型鏈球菌。按照試劑盒使用說明操作進行pcr，產(chǎn)物于1.2％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。大腸桿菌o103、o111、o145可擴增到特異性條帶，其它菌株的pcr結(jié)果均為陰性(如說明書附圖圖2)，泳道1-20分別為：o103、o111、o145、o26、o121、o113、o45、o157、o78、o101、鼠傷寒沙門氏菌(cvcc3384)、腸炎沙門氏菌(cvcc1805)、雞白痢沙門氏菌(cvcc519)、鴨沙門氏菌(cau0118)、禽巴氏桿菌(cvcc493)、雞毒支原體(cvcc1651)、禽支原體(cvcc274)、金黃色葡萄球菌(cvcc543)、禽波氏菌(atcc菌株ipdh591-77)、豬2型鏈球菌。

(2)以細菌培養(yǎng)物為模板的試劑盒靈敏度試驗

分別接種大腸桿菌o103、o111、o145單菌落至lb液體培養(yǎng)基中，37℃增菌過夜，各取1ml菌液，分別制備菌液，濃度為10⁶cfu/ml、10⁵cfu/ml、10⁴cfu/ml、10³cfu/ml、10²cfu/ml、10cfu/ml、1cfu/ml。各吸取3μl加入pcr反應(yīng)體系，按照試劑盒操作說明進行pcr，根據(jù)試驗結(jié)果測定試劑盒的靈敏度。結(jié)果表明，本發(fā)明建立的大腸桿菌o103、o111、o145血清型檢測方法可以檢測出100cfu的o103和o145血清型大腸桿菌，能檢測出10cfu的o111血清型大腸桿菌(如說明書附圖圖3)。

(3)以細菌基因組dna為模板的試劑盒靈敏度試驗

分別接種大腸桿菌o103、o111、o145單菌落至lb液體培養(yǎng)基中，37℃增菌過夜，各取1ml菌液提取細菌基因組dna，分別稀釋濃度為100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、500pg/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl。各吸取3μl加入pcr反應(yīng)體系，按照試劑盒操作說明進行pcr，根據(jù)試驗結(jié)果確定試劑盒的靈敏度。結(jié)果表明，本發(fā)明建立的大腸桿菌o103、o111、o145血清型檢測方法可以檢測出10pg的o103、o111、o145血清型大腸桿菌(如說明書附圖圖4)

通過條件優(yōu)化，確定了最佳的pcr反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)，組裝了大腸桿菌o103、o111、o145血清型檢測試劑盒。對大腸桿菌o103、o111、o145的陽性菌株進行擴增，均可進行特異性檢測，而其他細菌標(biāo)準(zhǔn)菌株等對照樣品均未有擴增，說明該試劑盒具有很好的特異性。靈敏性檢測表明，試劑盒具有較高的靈敏的性，其最低檢測靈敏度可達到10cfu細菌菌液及10pg細菌基因組dna。研究結(jié)果表明，本發(fā)明的大腸桿菌o103、o111、o145血清型檢測試劑盒具有靈敏、特異、快速的優(yōu)點，為大腸桿菌o103、o111、o145血清型快速檢測及流行病學(xué)調(diào)查提供了新的技術(shù)和物質(zhì)保障。

以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實施例，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明所述原理的前提下，還可以作出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。

sequencelisting

<110>山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院

<120>一種引物組及其制備的試劑盒和應(yīng)用

<130>

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>合成

<400>1

tgattggagcgttaactggacct23

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>合成

<400>2

aaagctcccgagcacgtataaag23

<210>3

<211>23

<212>dna

<213>合成

<400>3

atttgtttcttcgatgttgcgag23

<210>4

<211>23

<212>dna

<213>合成

<400>4

aaggcaagggacataagaagcca23

<210>5

<211>23

<212>dna

<213>合成

<400>5

attttcattgttttgcttgctcg23

<210>6

<211>23

<212>dna

<213>合成

<400>6

caaggcaagctttggaaatgaaa23