本發(fā)明涉及酶制劑應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于桉木制備低聚木糖的復(fù)合酶及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

低聚木糖亦稱木寡糖，由2-7個(gè)D-木糖以β-1,4-木糖苷鍵結(jié)合而成，以木二糖和木三糖為主，是功能性低聚木糖家族中的一個(gè)重要成員，能夠促進(jìn)腸道內(nèi)雙歧桿菌的繁殖，有益于腸胃健康，還有潤腸通便，提高免疫力、抗腫瘤，降低血壓、血糖、血清膽固醇，防齲齒、清口臭，促進(jìn)鈣的吸收等生物學(xué)作用。它的甜度比蔗糖和葡糖糖均低，與麥芽糖差不多，約為蔗糖的40％。低聚木糖對pH值及熱的穩(wěn)定性較好，即使是在酸性條件(pH2.5-7)加熱也基本不分解，適合用于酸奶、乳酸菌飲料和碳酸飲料等酸性飲料中。

低聚木糖是由木聚糖經(jīng)酶解產(chǎn)生的低聚合度寡糖，在商業(yè)上主要是以含有木質(zhì)纖維素如竹筍、樹木、農(nóng)業(yè)廢棄物(桔桿、棉子、玉米芯、蔗渣等)為原料，用食品級的木聚糖酶水解后,分離精制而得。因此，木寡糖的生產(chǎn)原料來源十分廣泛。

隨著酶化學(xué)的進(jìn)步和發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)了許多來源于微生物的水解酶和轉(zhuǎn)移酶等，進(jìn)一步深入研究，使得各種低聚糖可被廉價(jià)地大量生產(chǎn)。特別是隨著高活性木聚糖酶的開發(fā)，使得在地利用資源如木材、玉米穗軸、棉籽殼、甘蔗渣及稻草等植物體中大量含有的半纖維素-木聚糖可被用來生產(chǎn)具有良好物性及功能性的低聚木糖。

目前制備低聚木糖的方法主要有化學(xué)法、發(fā)酵法和酶法。化學(xué)法原理是通過蒸汽或水中的水合氫離子催化降解木聚糖，具體過程為先將原料經(jīng)溶劑處理得到木聚糖液，再經(jīng)蒸汽、水或酸處理得到低聚木糖溶液，此法已應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中，存在較嚴(yán)重的廢液污染環(huán)境，大量堿腐蝕設(shè)備，副反應(yīng)較多，產(chǎn)品安全性不高的問題。發(fā)酵法是用酶或微生物直接處理或發(fā)酵天然纖維原料生產(chǎn)低聚木糖，存在反應(yīng)困難、酶回收困難、提取率低的問題。而酶法綜合了上述兩種方法，揚(yáng)長避短，具有反應(yīng)專一性強(qiáng)，易于控制其水解速度及程度，且所得產(chǎn)物分離及精制較為容易等優(yōu)點(diǎn)，因此逐漸成為生產(chǎn)高品質(zhì)低聚木糖的主要方法。

酶法制備主要是利用木聚糖酶水解半纖維素原料得到以木二糖、木三糖為主要成分的低聚木糖混合物，但目前這種方法普遍存在低聚木糖收率低的問題。因此，如何提高低聚木糖的收率是目前本領(lǐng)域急需解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)問題，提供了一種用于桉木制備低聚木糖的復(fù)合酶，能有效提高桉木半纖維素轉(zhuǎn)化低聚木糖的效率，提高木二糖、木三糖和木四糖的產(chǎn)量，應(yīng)用前景廣闊。

本發(fā)明一方面提供了一種用于桉木制備低聚木糖的復(fù)合酶，包括木聚糖酶和纖維素酶。

上述的復(fù)合酶還包含有甘露聚糖酶。

上述的復(fù)合酶，其各組分及其含量分別為：木聚糖酶4400～22000IU/g，纖維素酶600～1200IU/g，甘露聚糖酶0～600IU/g。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述用于桉木制備低聚木糖的復(fù)合酶，其各組分及其含量分別為：木聚糖酶22000IU/g，纖維素酶1200IU/g，甘露聚糖酶600IU/g。

本發(fā)明還提供了一種利用桉木生產(chǎn)低聚木糖的方法，按如下步驟得到：

1)將桉木首先經(jīng)過亞硫酸鈉高溫高壓處理，得到纖維素和半纖維素固體；然后將纖維素和半纖維素固體通過高濃度的堿溶液浸提出半纖維素溶液；半纖維素溶液通過陶瓷膜過濾脫堿，得到半纖維素糖液；

2)測定半纖維素糖液中總木聚糖的濃度，調(diào)節(jié)半纖維素糖液的pH至4.8～5.5備用；

3)按0.5～1g/g木聚糖的比例向半纖維素糖液中加入上述復(fù)合酶，50～60℃反應(yīng)4～8h，10000rpm離心5min，取上清液，即得低聚木糖溶液。

本發(fā)明的復(fù)合酶可廣泛應(yīng)用于低聚木糖的生產(chǎn)，能有效提高桉木半纖維素轉(zhuǎn)化低聚木糖的效率，而且復(fù)合酶中的纖維素酶和甘露聚糖酶能明顯促進(jìn)木聚糖酶對半纖維素的降解作用，三種酶協(xié)同作用，能使木二糖、木三糖和木四糖的總轉(zhuǎn)化率提高12.5％，并且木四糖的轉(zhuǎn)化率也提高了50％，取得了意料不到的技術(shù)效果。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1桉木半纖維素糖液的制備

將桉木首先經(jīng)過亞硫酸鈉高溫高壓處理，脫除部分的木質(zhì)素，得到纖維素和半纖維素固體；纖維素和半纖維素固體通過高濃度的堿溶液浸提出半纖維素溶液；半纖維素溶液通過陶瓷膜過濾脫堿，得到半纖維素糖液。

將上述半纖維素糖液和12％的稀硫酸按1:1體積比混勻，然后100℃高溫處理90min，用碳酸鈣調(diào)節(jié)pH至中性，用離子液相色譜測定半纖維素糖液中木聚糖的總含量，為50克/升；調(diào)節(jié)半纖維素糖液的pH至4.8-5.5備用。

實(shí)施例2木聚糖酶對低聚木糖轉(zhuǎn)化率的影響

將實(shí)施例1制得的半纖維素糖液分為5個(gè)處理組，每個(gè)處理組500mL，分別按0IU/g木聚糖，4400IU/g木聚糖，11000IU/g木聚糖，22000IU/g木聚糖，44000IU/g木聚糖的比例添加木聚糖酶；50℃反應(yīng)4h，10000rpm離心5min，分別取上清液；用離子液相色譜分別測定其中木二糖、木三糖和木四糖的含量，計(jì)算木二糖、木三糖和木四糖的總轉(zhuǎn)化率，分別為0.46％，20％，30％，40％，40％。

上述結(jié)果表明，木聚糖酶能有效促進(jìn)桉木半纖維素轉(zhuǎn)化為低聚木糖，尤其是木二糖、木三糖和木四糖，且隨著木聚糖酶添加量的增加，木二糖、木三糖和木四糖這三種低聚木糖的總轉(zhuǎn)化率得到顯著提高，當(dāng)達(dá)到22000IU/g木聚糖的添加量時(shí)，木二糖、木三糖和木四糖的總轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高40％，以后再增加木聚糖酶的添加量，上述三種低聚木糖的總轉(zhuǎn)化率不再提高。

實(shí)施例3木聚糖酶和纖維素酶對低聚木糖轉(zhuǎn)化率的影響

將實(shí)施例1制得的半纖維素糖液分為3個(gè)處理組，每個(gè)處理組500mL；首先按22000IU/g木聚糖的添加量向每個(gè)處理組中加入木聚糖酶；然后再按0IU/g木聚糖，600IU/g木聚糖，1200IU/g木聚糖的添加量向3個(gè)處理組中分別加入纖維素酶；同時(shí)設(shè)置2個(gè)對照組，在不添加木聚糖酶的情況下，僅添加纖維素酶，添加量分別為600IU/g木聚糖，1200IU/g木聚糖。

50℃反應(yīng)4h，10000rpm離心2min，分別取上清液；用離子液相色譜分別測定其中木二糖、木三糖和木四糖的含量，計(jì)算木二糖、木三糖和木四糖的總轉(zhuǎn)化率，具體數(shù)據(jù)見表1。

轉(zhuǎn)化率＝(木二糖+木三糖+木四糖)/總木聚糖含量×100％；

表1木聚糖酶和/或纖維素酶對低聚木糖轉(zhuǎn)化率的影響

從表1的結(jié)果可以看出，單獨(dú)添加纖維素酶的對照組1和2中木二糖、木三糖和木四糖的總轉(zhuǎn)化率為0，說明纖維素酶單獨(dú)作用對于半纖維素轉(zhuǎn)化低聚木糖沒有任何效果；但在木聚糖酶的基礎(chǔ)上再添加纖維素酶，卻能顯著提高上述三種低聚木糖的轉(zhuǎn)化率，與單獨(dú)添加木聚糖酶的處理組1相比，處理組2和3中木二糖、木三糖和木四糖的總轉(zhuǎn)化率分別提高了7.5％和12.5％，從而說明纖維素酶能與木聚糖酶產(chǎn)生協(xié)同促進(jìn)作用，有效提高半纖維素轉(zhuǎn)化低聚木糖的效率，取得了意料不到的技術(shù)效果。

實(shí)施例4木聚糖酶、纖維素酶和甘露聚糖酶對低聚木糖轉(zhuǎn)化率的影響

將實(shí)施例1制得的半纖維素糖液分為2個(gè)處理組，每個(gè)處理組500mL；首先按22000IU/g木聚糖的添加量向每個(gè)處理組中加入木聚糖酶，按1200IU/g木聚糖的添加量向每個(gè)處理組中加入纖維素酶；然后再按0IU/g木聚糖，600IU/g木聚糖的添加量向2個(gè)處理組中分別加入甘露聚糖酶；同時(shí)設(shè)置3個(gè)對照組，分別單獨(dú)添加相同添加量的木聚糖酶，纖維素酶和甘露聚糖酶。

50℃反應(yīng)4h，10000rpm離心2min，分別取上清液；用離子液相色譜分別測定其中木二糖、木三糖和木四糖的含量，分別計(jì)算木四糖的轉(zhuǎn)化率，以及木二糖、木三糖和木四糖的總轉(zhuǎn)化率。具體結(jié)果見表2。

表2木聚糖酶、纖維素酶和/或甘露聚糖酶對低聚木糖轉(zhuǎn)化率的影響

從表2的結(jié)果可以看出，單獨(dú)添加纖維素酶和甘露聚糖酶的對照組2和3中，木二糖、木三糖和木四糖的轉(zhuǎn)化率均為0，說明纖維素酶和甘露聚糖酶本身對半纖維素降解沒有任何作用。但與單獨(dú)添加木聚糖酶的對照組1相比，增加了纖維素酶的處理組1中木二糖、木三糖和木四糖的總轉(zhuǎn)化率提高了12.5％，木四糖的轉(zhuǎn)化率提高了25％；與處理組1相比，增加了甘露聚糖酶的處理組2中木二糖、木三糖和木四糖的總轉(zhuǎn)化率提高了11.1％，木四糖的轉(zhuǎn)化率提高了50％。上述結(jié)果表明，纖維素酶和/或甘露聚糖酶能明顯促進(jìn)木聚糖酶對半纖維素的降解作用，三種酶協(xié)同作用，能有效提高木二糖、木三糖和木四糖的總轉(zhuǎn)化率，并且木四糖的轉(zhuǎn)化率也得到大幅提高，取得了意料不到的技術(shù)效果。

上述的結(jié)果表明，木聚糖酶、纖維素酶和甘露聚糖酶協(xié)同作用能明顯促進(jìn)桉木生產(chǎn)低聚木糖，尤其是木二糖、木三糖和木四糖。

實(shí)施例5桉木制備低聚木糖的專用復(fù)合酶及其應(yīng)用

一種用于桉木制備低聚木糖的復(fù)合酶，其組分及含量分別為木聚糖酶22000IU/g、纖維素酶1200IU/g和甘露聚糖酶600IU/g。

1)將桉木首先經(jīng)過亞硫酸鈉高溫高壓處理，得到纖維素和半纖維素固體；然后將纖維素和半纖維素固體通過高濃度的堿溶液浸提出半纖維素溶液；半纖維素溶液通過陶瓷膜過濾脫堿，得到半纖維素糖液；

2)測定半纖維素糖液中總木聚糖的濃度為50克/升；調(diào)節(jié)半纖維素糖液的pH至4.8～5.5備用；

3)按0.5g/g木聚糖的比例向半纖維素糖液中加入上述復(fù)合酶，50℃反應(yīng)4h，10000rpm離心5min，取上清液，即得低聚木糖溶液。用離子液相色譜分別測定其中木二糖、木三糖和木四糖的含量，計(jì)算木二糖、木三糖和木四糖的總轉(zhuǎn)化率以及木四糖的轉(zhuǎn)化率。

結(jié)果顯示，利用本發(fā)明所述專用復(fù)合酶制備得到的桉木低聚木糖溶液中，木二糖、木三糖和木四糖的總轉(zhuǎn)化率達(dá)到38％，其中木四糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到12.2％。