本發(fā)明涉及一種基于離子調(diào)控的酶法定向制備低粘度及超低粘度褐藻膠的方法，具體是指以褐藻為原料，利用離子調(diào)控褐藻膠裂解酶的活性，以降解生產(chǎn)低粘度及超低粘度褐藻膠的方法。

背景技術(shù)：

褐藻膠是從海帶、馬尾藻等褐藻中提取出來的一種多糖類生物高分子，是由甘露糖醛酸和古羅糖醛酸組成的一種線型聚合物。與中、高粘度褐藻膠相比，低粘度及超低粘度褐藻膠具有分子量小、穩(wěn)定性好、滲透性強(qiáng)、水溶性好等特點(diǎn)，而被廣泛的應(yīng)用于印染、醫(yī)療衛(wèi)生與食品行業(yè)。低粘度及超低粘度褐藻膠在世界藻膠中占有重要地位，其需求量約占總需求量得30-40%，且在德國(guó)、美國(guó)、日本、韓國(guó)和國(guó)內(nèi)市場(chǎng)都很大，但由于國(guó)內(nèi)以往無法生產(chǎn)，多年來處于空白地位。

當(dāng)前國(guó)內(nèi)褐藻膠的生產(chǎn)多沿用傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝，傳統(tǒng)工藝耗水量極大，每生產(chǎn)1噸褐藻膠產(chǎn)品約需要1000噸水；其產(chǎn)品規(guī)格也仍以中粘度褐藻膠為主，約占總產(chǎn)量的90%，但低粘度、超低粘度和高粘度褐藻膠產(chǎn)品所占比例極少，嚴(yán)重制約了褐藻膠產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的優(yōu)化與發(fā)展。目前國(guó)內(nèi)外低粘度及超低粘度的生產(chǎn)方法無外乎、高溫消化法、加酸蒸煮海帶法、脫鈣凝膠加溫法及褐藻酸鈉干粉加溫存放法等，缺點(diǎn)如專利cn104448032b一種從褐藻中提取褐藻酸鈉的方法，該工藝為了制備低粘度褐藻膠，采用高溫、強(qiáng)酸等方法以此來降低褐藻膠粘度，該方法具有成本高、能耗大、分子量不均一等缺點(diǎn)。

目前，一些研究者將酶解法應(yīng)用到低粘度及超低粘度生產(chǎn)中，如專利cn105367684a一種低粘度海藻酸鈉的制備方法與專利cn103665183a一種超低粘度褐藻膠的生產(chǎn)方法，其工藝均為在堿消化前使用纖維素酶、蛋白酶、果膠酶進(jìn)行酶解處理后，經(jīng)過堿消化、稀釋、脫色、鈣析、脫鈣、中和、醇沉后得到低粘度及超低粘度的褐藻膠產(chǎn)品，其中專利cn105367684a主要描述了該技術(shù)在低粘度褐藻膠的工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用。該種提取工藝?yán)美w維素酶、蛋白酶、果膠酶分解褐藻細(xì)胞壁，加快褐藻膠的溶出，從而提高出膠率，但纖維素酶、蛋白酶、果膠酶對(duì)褐藻膠無分解作用，很難得到低粘度及超低粘度褐藻膠。再如專利cn200610042119a一種生產(chǎn)低粘度褐藻膠的方法，該專利將稀釋后的可降解和液化褐藻膠的海洋細(xì)菌菌懸液噴灑于海帶表面，處理3-60天后，再以常規(guī)方法對(duì)海帶處理，得到低粘度的褐藻膠。該低粘度褐藻膠生產(chǎn)工藝中菌僅作用于海帶表面，對(duì)藻體內(nèi)部褐藻酸作用有限，具有酶解效率低，工藝歷時(shí)時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)。

論文《褐藻膠裂解酶系的酶化學(xué)_產(chǎn)物分析及應(yīng)用研究》在第五章公開了“褐藻膠裂解酶在低粘度和超低粘度褐藻膠制備中的應(yīng)用”，該方法利用褐藻膠裂解酶的粗酶液對(duì)堿消化后的消化液進(jìn)行酶解處理，經(jīng)固色、消化、酶解、過濾、鈣析、脫鈣、烘干后制得低粘度及超低粘度褐藻膠，但該褐藻膠裂解酶系是由三個(gè)單體酶（酶a、酶b與酶c）組成，因該酶系的三個(gè)單體酶底物特異性不同，所以利用該粗酶液制備的低粘度及超低粘度褐藻膠分子量規(guī)格不均一，易出現(xiàn)小分子寡糖。與當(dāng)前市場(chǎng)上的多數(shù)低粘度褐藻膠產(chǎn)品無異，分子量均一度較差。本專利通過金屬離子對(duì)褐藻膠裂解酶系的調(diào)節(jié)作用實(shí)現(xiàn)單體酶活性中心的開放和關(guān)閉，以控制底物的降解水平，再利用不同截留分子量的膜生物反應(yīng)器生產(chǎn)制備出分子量規(guī)格較為均一的低粘度及超低粘度褐藻膠。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決傳統(tǒng)工藝耗水嚴(yán)重、分子量均一度差等問題，本發(fā)明提供一種利用褐藻膠裂解酶生產(chǎn)低粘度及超低粘度褐藻膠的方法。

本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種基于離子調(diào)控的酶法定向生產(chǎn)低粘度及超低粘度褐藻膠的方法，包括以下具體步驟：

（1）原料預(yù)處理:鮮褐藻或加水泡發(fā)并洗去表面雜質(zhì)后的干褐藻切塊于0.5%-1%甲醛溶液中固色，清水洗去表面甲醛；

（2）消化:加入料液比為1:10-1:40（m/v）的4%-8%碳酸氫鈉溶液、50-70℃、80-400r/min攪拌條件下消化1-4h；

（3）酶活調(diào)控：在褐藻膠裂解酶液中用k⁺、na⁺和ba²⁺的溶液按摩爾比1：2-25:0.001-0.5比例調(diào)控單體酶酶活。具體操作時(shí)以1-200mmol/l的bacl2溶液加至褐藻膠裂解酶液中，30℃恒溫孵育5-30min，以此對(duì)褐藻膠裂解酶三個(gè)單體酶進(jìn)行酶活調(diào)控；

（4）酶解：將經(jīng)過堿處理的消化液加入0.5-1倍體積水進(jìn)行初步稀釋，冷卻至室溫后加入10%的鹽酸調(diào)節(jié)ph至5-7，分別置于截留分子量為12-100kda的膜生物反應(yīng)器中，于30℃預(yù)熱5-15min后加入20-100u/g（酶活單位/原料重量）經(jīng)過上述處理褐藻膠裂解酶，30-150r/min攪拌條件下反應(yīng)20-60min；待反應(yīng)結(jié)束后升溫至60-90℃保持20min滅活，過濾分離后得清膠液；

（5）鈣析：邊緩慢攪拌邊向除去濾渣的清膠液中加入適量5%-10%的氯化鈣溶液；

（6）脫鈣與中和：將褐藻酸鈣凝膠加入一定量鹽酸中酸化20min，水洗至中性；之后加入一定量10%碳酸鈉溶液中和直至完全溶解，注意碳酸鈉加入量不易過多；

（7）醇沉：邊攪拌邊向樣品中加入2-3倍體積的95%乙醇，靜置一段時(shí)間后，離心獲得褐藻膠固體，烘干、粉碎后即得樣品；

（8）檢驗(yàn):取1g褐藻膠樣品加入100ml水中配成1%的褐藻膠溶液，于20℃下測(cè)量其粘度。取5mg褐藻膠樣品加入1ml水中配成5mg/ml的褐藻膠溶液，hpgpc測(cè)其分子量。

本發(fā)明所述低粘度褐藻膠粘度范圍在71-150mpa·s；超低粘度褐藻膠粘度范圍為5-70mpa·s。

本發(fā)明所述褐藻膠裂解酶系由三種褐藻膠裂解酶組成的酶系，其降解活性具有離子調(diào)性特性。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：

1、本發(fā)明通過金屬離子對(duì)褐藻膠裂解酶系的酶活進(jìn)行調(diào)控，達(dá)到了控制底物的降解水平的目的。

2、本發(fā)明利用褐藻為原料直接提取低粘度及超低粘度褐藻膠，避免了通過褐藻膠后續(xù)加工的成本增加。

3、本發(fā)明利用截留分子量12-120kda的膜生物反應(yīng)器，一方面可使小分子褐藻膠及時(shí)分離出去反應(yīng)的進(jìn)行；另一方面可以連續(xù)操作，極大限度的利用酶，因而可以提高產(chǎn)量節(jié)約成本。

4、通過本發(fā)明方案制備的低粘度及超低粘度褐藻膠產(chǎn)品具有良好的分子量均一度，主組分含量在80-100%之間。

5、本發(fā)明通過酶解作用得到的消化液極易過濾，與傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)相比，可節(jié)省60-80%的用水量，極大節(jié)約了水資源的消耗，減少了工業(yè)廢水的排放量，實(shí)現(xiàn)了節(jié)能減排。

6、本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單、連續(xù)性強(qiáng)，酶解過程在30min內(nèi)即可完成，克服了其他工藝酶處理時(shí)間長(zhǎng)等問題。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1產(chǎn)品的hpgpc液相圖譜；

圖2為實(shí)施例2產(chǎn)品的hpgpc液相圖譜;

圖3為hpgpc法標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖4為工藝流程圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體事例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明：

實(shí)施例1：

（1）原料預(yù)處理：取100kg干海帶加入1000l水中浸泡除雜，之后于100l的0.5%甲醛溶液固色2h后，清水洗去表面甲醛；

（2）消化：在60℃、攪拌條件下，將原料于2000l的6%碳酸氫鈉溶液中消化3.5h；

（3）酶活調(diào)控：將kcl、nacl與bacl2溶液加至褐藻膠裂解酶粗酶液中，使其終濃度分別為150mmol/l、500mmol/l與5mmol/l，30℃恒溫孵育20min，以此實(shí)現(xiàn)對(duì)褐藻膠裂解酶三個(gè)單體酶的酶活調(diào)控。

（4）酶解過濾：將經(jīng)過堿處理的消化液加入2000l的水進(jìn)行初步稀釋，冷卻至室溫后加入10%的鹽酸調(diào)節(jié)ph至6，分別置于截留分子量為80kda的膜生物反應(yīng)器中，于30℃預(yù)熱10min后加入30u/g經(jīng)過上述處理褐藻膠裂解酶，100r/min攪拌條件下反應(yīng)30min；待反應(yīng)結(jié)束后升溫至70℃保持20min滅活，過濾分離后得清膠液。

（5）鈣析：邊緩慢攪拌邊向除去濾渣的清膠液中加入200l的10%的氯化鈣溶液；

（6）脫鈣：將褐藻酸鈣凝膠加入500l的3%鹽酸中酸化30min，水洗至中性；之后加入適量10%碳酸鈉溶液中和直至完全溶解；

（7）醇沉：向樣品中加入2倍體積的乙醇進(jìn)行分級(jí)醇沉，烘干、粉碎后得干樣品29.5kg；

（8）檢驗(yàn)：取1g褐藻膠樣品加入100ml水中配成1%的褐藻膠溶液，20℃下測(cè)得其粘度為101mpa·s。取5mg褐藻膠樣品加入1ml水中配成5mg/ml的褐藻膠溶液，hpgpc法僅測(cè)出3個(gè)峰，其中主峰分子量為87.6kda，其百分含量為85%，分子量均一度良好?？傆盟繛?.8噸，換算成生產(chǎn)一噸粘度為101mpa·s的產(chǎn)品的總用水量為264.41噸，與傳統(tǒng)工藝的生產(chǎn)每噸產(chǎn)品均用水量1000噸相比，節(jié)約了73.56%的用水。

實(shí)施例2：

（1）原料預(yù)處理：將30kg干巨藻用300l的水中浸泡3h后除雜，于30l的0.5%甲醛溶液固色4h后，清水洗去表面甲醛；

（2）消化：在65℃、攪拌條件下，將原料于450l的6%碳酸氫鈉溶液中消化2h；

（3）酶活調(diào)控：將kcl、nacl與bacl2溶液加至褐藻膠裂解酶粗酶液中，使其終濃度分別為200mmol/l、450mmol/l與2.5mmol/l，30℃恒溫孵育30min，以此實(shí)現(xiàn)對(duì)褐藻膠裂解酶三個(gè)單體酶進(jìn)行酶活調(diào)控。

（4）酶解：將經(jīng)過堿處理的消化液加入300l的水進(jìn)行初步稀釋，冷卻至室溫后加入10%的鹽酸調(diào)節(jié)ph至7，分別置于截留分子量為40kda的膜生物反應(yīng)器中，于30℃預(yù)熱10min后加入50u/g經(jīng)過上述處理褐藻膠裂解酶，150r/min攪拌條件下反應(yīng)30min；待反應(yīng)結(jié)束后將酶解液于沸水中煮沸5min后滅活，過濾分離后得清膠液。

（5）鈣析：邊緩慢攪拌邊向除去濾渣的清膠液中加入60l的10%的氯化鈣溶液；

（6）脫鈣：將褐藻酸鈣凝膠加入200l的3%鹽酸中酸化30min，水洗至中性；之后加入適量10%碳酸鈉溶液中和；

（7）醇沉：向樣品中加入3倍體積的乙醇進(jìn)行分級(jí)醇沉，烘干、粉碎后得干樣品10.2kg；

（8）檢驗(yàn)：取1g褐藻膠樣品加入100ml水中配成1%的褐藻膠溶液，20℃下測(cè)得其粘度為46mpa·s。取5mg褐藻膠樣品加入1ml水中配成5mg/ml的褐藻膠溶液，hpgpc法僅測(cè)出3個(gè)峰，其中主峰分子量為41.9kda，其百分含量為89%，分子量均一度良好?？傆盟繛?.45噸，換算成生產(chǎn)一噸粘度為46mpa·s的產(chǎn)品的總用水量為240.19噸，與傳統(tǒng)工藝的生產(chǎn)每噸產(chǎn)品均用水量1000噸相比，節(jié)約了75.98%的用水。

表1分子量分布、產(chǎn)量及工藝耗水量

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。