三步法快速檢測石斑魚β諾達(dá)病毒的試劑盒及其操作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于病毒分子生物學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及=步法快速檢測石斑魚化若 達(dá)病毒的試劑盒及其操作方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 石斑魚（Grouper)隸屬于驢形目（Perciformes)、鶴科（Serranidae)、石斑魚亞科 化pine曲elinae)，是我國南方沿海各省及東南亞各國最重要的海水養(yǎng)殖魚類之一，其肉質(zhì) 鮮美、營養(yǎng)價值高，經(jīng)濟(jì)價值較大。石斑魚黑身病是限制石斑魚養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的最重要 病害之一，發(fā)病后最高死亡率可達(dá)100%，給該產(chǎn)業(yè)造成了巨大的損失。
[0003] 的若達(dá)病毒(Betanodavirus)是世界范圍內(nèi)的一種魚類流行性傳染病，已在歐洲海 食盧（LateoIabrax japonicus)、大菱魚平（Scophthalmus maximus)、黃帶擬錢（Pseudocaranx dentex)等40多種海水魚類中報(bào)道出現(xiàn)了該病毒疫情，給包括石斑魚（Grouper， 化inephelinae)在內(nèi)的多種海水魚類養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的損失?；暨_(dá)病毒也被稱為神經(jīng) 壞死病毒（Nervous necrosis vi;rus，NNV)，是引起石斑魚病毒性神經(jīng)壞死?。╒iral nervous necrosis，VNN)或病毒性腦及視網(wǎng)膜?。╒iral encephalopathy and retinopathy，VER)的病原，能夠?qū)е率唪~稚、幼苗大規(guī)模急性死亡。
[0004] 加強(qiáng)病毒檢疫、提前阻斷病毒傳播，是防控病毒類疾病的重要方法。隨著生物技術(shù) 的發(fā)展，已經(jīng)發(fā)展出了多種能夠提前檢測病毒的方法，如細(xì)胞培養(yǎng)、巧光抗體、免疫組織化 學(xué)、PCR等技術(shù)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Xoop-mediated isothermal Amplif ication ,LAMP) 是一種新型的PCR技術(shù)，通過設(shè)計(jì)4條特異、高效的引物，能夠在等溫條件下不間斷地快速擴(kuò) 增目的序列，具有快速、靈敏、特異性高的優(yōu)點(diǎn)。
[0005] 但是，現(xiàn)行的LAMP試劑盒及檢測方法具有組份復(fù)雜、操作繁瑣、對檢測人員技術(shù)要 求高等不利因素，極大地限制了 LAMP試劑盒的應(yīng)用。特別是RNA病毒的檢測，需要經(jīng)過RNA提 取、反轉(zhuǎn)錄、LAMP反應(yīng)等多個環(huán)節(jié)?，F(xiàn)行的RNA提取方法就需要經(jīng)歷化izol抽提、氯仿分層、 異丙醇抽提離屯、、100%乙醇、75%乙醇、DEPC水溶解RNA等多個步驟，再加上反轉(zhuǎn)錄、LAMP反 應(yīng)引物、酶、反應(yīng)緩沖液添加等各種步驟，反應(yīng)試管需要多次開蓋添加試劑，導(dǎo)致多數(shù)的基 層技術(shù)人員無法完成，即使完成，LAMP反應(yīng)也極易被污染出現(xiàn)假陽性結(jié)果。
[0006] 因此，開發(fā)出一種操作步驟少、簡單有效、無污染的石斑魚0諾達(dá)病毒快速檢測技 術(shù)具有重要的應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種無需特殊設(shè)備、快速有效、能夠應(yīng)用于養(yǎng)殖現(xiàn)場的= 步法快速檢測石斑魚的若達(dá)病毒(Betanodavirus)的試劑盒及其操作方法。
[000引本發(fā)明的=步法快速檢測石斑魚的若達(dá)病毒的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒 包括:PBS預(yù)處理液、RNA快速提取液和檢測液。
[0009]優(yōu)選，所述的檢測液含有AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase抑制劑、核酸巧光染料、環(huán)介導(dǎo)等溫 擴(kuò)增試劑和的若達(dá)病毒的檢測引物組。
[0010] 優(yōu)選，所述的試劑盒的PBS預(yù)處理液是pH7.2±0.2的PBS溶液;所述的RNA快速提取 液是邱icentre Biotechnolo邑ies公司的QuickExtract?RNA Extraction Solution型號的 試劑;所述的檢測液為環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液，其20iU體系中含有:8-10UAU Bst 2.0聚合 酶化1，1-211/^141￥逆轉(zhuǎn)錄酶化1，15-201]/山1?胞36抑制劑化1，1.〇-2.〇1111(1^?3 3.541， IOXAmplification Buffer 2.5iil，6-8mM MgS〇4 1.扣1，IM甜菜堿化 1，IOX SYT0-9染料 0.5山，0.2測上游外引物的化1，0.2測下游外引物B3 1山，上游內(nèi)引物FIP 1山， 下游內(nèi)引物 BIP 化 1，溶劑為水；其中，IOXAmplification Buffer 含有 200mM Tris-HCl、 100mM(NH4)2S〇4、500mM KCl、20mM MgS〇4和l%Tween 20,溶劑為水，PH 8.8。
[0011] 優(yōu)選，所述的檢巧陳中的若達(dá)病毒的檢測引物組由下列引物組成：
[001^ 上游外引物F3:5'-GGTGCAGTCGTTGCCAAAT-3'（如沈Q ID N0.1 所示），
[0013] 下游外引物B3:5'-CGACATAGCACCGACACG-3'（如SEQ ID ^.2所示），
[0014] 上游內(nèi)引物FIP:5'-TCCTTTCCCGACGAGGTCCAGGTGGGAAAGCAGTACAGTCC-3'（如SEQ ID NO.3所示），
[0015] 下游內(nèi)引物BIP:5'-AGCGTCTCACGTCACCTGGTACCACATCGGTGTTGTTGC-3'（如沈Q ID NO. 4所示）。
[0016] 優(yōu)選，所述的試劑盒，所述的檢測液所包含的組份已提前混合;所述的RNA快速提 取液是直接分裝而成的;所述的PBS預(yù)處理液、RNA快速提取液及檢測液都為可直接使用的 工作液。。
[0017] 本發(fā)明的非疾病的診斷和治療目的的=步法快速檢測石斑魚化若達(dá)病毒的試劑盒 的操作方法，其特征在于，其是利用上述的試劑盒進(jìn)行檢測，具體包括W下步驟:第一步，樣 品預(yù)處理:將樣品于PBS預(yù)處理液中處理，制備成IO 3-IO6個/mL的細(xì)胞懸浮液;第二步，RNA快 速提取:再將細(xì)胞懸浮液加入到RNA快速提取液中進(jìn)行病毒RNA提取得到總RNA溶液；第S 步，病毒檢測:然后將總RNA溶液加入到檢測液中，置于63-68°C的水浴下保溫1-1.化;若檢 測液顏色發(fā)生改變，則說明樣品中含有化若達(dá)病毒;若檢測液顏色未發(fā)生改變，則說明樣品 中不含有的若達(dá)病毒。
[0018] 優(yōu)選，所述的操作方法中的將細(xì)胞懸浮液加入到RNA快速提取液中是取8~15微升 的IO3-IO6個/mL的細(xì)胞懸浮液加入到100-200山的RNA快速提取液中，并充分振蕩l-3min，f|jU 成總RNA溶液;所述的將總RNA溶液加入到檢測液中是吸取2-6微升總RNA溶液加入20山的檢 測液中。
[0019] 所述的樣品為整個石斑魚或石斑魚的部分組織，通過檢測石斑魚或石斑魚的部分 組織可W獲知其是否含有的若達(dá)病毒，也可W檢測石斑魚的巧料或水樣，W獲知巧料或水樣 中是否含有的若達(dá)病毒。
[0020] 本發(fā)明的PBS預(yù)處理液、RNA快速提取液和檢測液需要儲存于-20°c冰箱中，在4°C 完全解凍后方能使用。
[002。 本發(fā)明基于已公開的石斑魚0諾達(dá)病毒基因組RM2序列（GenBank序號： KX027363)，根據(jù)LAMP反應(yīng)原理，設(shè)計(jì)了檢測的若達(dá)病毒的檢測引物組，具有較強(qiáng)的特異性， 并且靈敏度高。本發(fā)明的=步法快速檢測石斑魚化若達(dá)病毒的檢測試劑盒及其檢測方法，是 基于簡化操作、避免試劑污染而設(shè)計(jì)的。采用如ic陸xtract?RNA Extraction Solution作 為RNA快速提取試劑，簡化了提取RNA的步驟;采用的LAMP反應(yīng)體系已提前混合，無需添加試 劑，減少了被污染的概率。本發(fā)明的=步法快速檢測石斑魚的若達(dá)病毒的試劑盒及其操作方 法，是基于本領(lǐng)域人員使用方便，無需添加各種試劑，只需要利用本發(fā)明試劑盒中的配套組 份，按照本發(fā)明的操作方法，分=步進(jìn)行檢測。
[0022] 本發(fā)明的特點(diǎn)為:①利用RNA快速提取和LAMP反應(yīng)靈敏的特點(diǎn)設(shè)計(jì)出了S步操作 快速檢測RNA病毒的方法;②待檢測組織經(jīng)過充分剪碎、擠壓、攬拌后，使預(yù)處理液中出現(xiàn)了 高濃度的組織懸浮細(xì)胞，適用于RNA快速提取;③逆轉(zhuǎn)錄和LAMP反應(yīng)在相同試管中同時進(jìn) 行，的/B3與病毒RNA結(jié)合后，經(jīng)過AMV逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄成CDNA，隨后在Bst 2.0聚合酶的 作用下進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng);④本發(fā)明設(shè)計(jì)的操作方法中未設(shè)置RNA純化濃縮的步驟， 結(jié)合了LAMP反應(yīng)非常靈敏的特點(diǎn)，簡化了操作步驟，節(jié)省了反應(yīng)時間;⑤本發(fā)明所有試劑都 已進(jìn)行預(yù)混合可設(shè)計(jì)成一次性使用，極大地降低了反應(yīng)被污染的機(jī)率、簡化了操作步驟，不 需特殊生物安全設(shè)備即可進(jìn)行檢測反應(yīng)。
[0023] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0024] 本發(fā)明采用了快速提取RNA、預(yù)混反應(yīng)試劑的方法，簡化了 RNA病毒的檢測步驟。本 發(fā)明所用材料和試劑全部為一次性使用，確保不會出現(xiàn)假陽性結(jié)果;本發(fā)明試劑盒組份簡 單，使用方法可操作性強(qiáng)，適用于檢測和防控石斑魚類黑身病的流行，能特異性，高靈敏度 的檢測出的若達(dá)病毒。
【具體實(shí)施方式】
[0025] W下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[00%] 實(shí)施例1
[0027] 1、的若達(dá)病毒的LAMP引物組設(shè)計(jì)
[0028] 的若達(dá)病毒的LAMP檢測引物組是基于已公開的石斑魚化若達(dá)病毒基因組RNA2序列， 根據(jù)LAMP反應(yīng)原理，通過在線軟件PrimerE邱Iorer V4(ht1:p ://p;rimerexplore;r.化/e/)設(shè) 計(jì)的，得到的的若達(dá)病毒的LAMP檢測引物組的序列(5 ' '）為：
[00巧]上游外引物F3:GGTGCAGTCGTTGCCAAAT(如SEQ ID N0.1 所示），
[0030] 下游外引物B3:CGACATAGCACCGACACG(如SEQ ID ^.2所示），
[0031] 上游內(nèi)引物FIP:TCCTTTCCCGACGAGGTCCAGGTGGGAAAGCAGTACAGTCC(如沈Q ID NO. 3 所示）， 示)。
[0033] 2、=步法快速檢測石斑魚的若達(dá)病毒的試劑盒(LAMP檢測試劑盒）