專(zhuān)利名稱(chēng)：乳腺癌的免疫組化診斷試劑盒和測(cè)試片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及一種腫瘤診斷檢測(cè)用品，進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及檢測(cè)乳腺組織中Her2表達(dá)的測(cè)試片以及含該測(cè)試片的試劑盒。
背景技術(shù)：
乳腺癌是婦女常見(jiàn)的惡性腫瘤，在歐美國(guó)家的發(fā)病率占女性惡性腫瘤的首位。我國(guó)雖然屬乳腺癌相對(duì)低發(fā)地區(qū)，但發(fā)病率正逐年上升。多數(shù)乳腺癌患者早期手術(shù)的預(yù)后較好，但約25-30％的患者的癌組織中有Her2受體的過(guò)度表達(dá)，這些患者的預(yù)后明顯差于Her2低表達(dá)的患者，體現(xiàn)為手術(shù)后復(fù)發(fā)率高、病情發(fā)展迅速、化療緩解期短，以及對(duì)化療藥物易產(chǎn)生耐藥，無(wú)瘤生存率和總生存率均低于Her2陰性的乳腺癌。Her2在體內(nèi)廣泛分布，編碼該蛋白的基因erbB-2，又稱(chēng)為neu基因，是人類(lèi)腫瘤中發(fā)生改變頻率最高的基因之一。美國(guó)腫瘤學(xué)會(huì)2000年曾推薦“Her2/neu”作為乳腺癌標(biāo)記物，無(wú)論對(duì)診斷還是復(fù)發(fā)的檢測(cè)都具有重要價(jià)值。
Her2是腫瘤靶向治療的理想靶點(diǎn)之一，國(guó)內(nèi)外制備了多種抗Her2單克隆抗體，發(fā)現(xiàn)它們可以顯著抑制Her2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的體外、體內(nèi)生長(zhǎng)。由于鼠源抗體注射至人體后會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的異種抗原反應(yīng)，人們又對(duì)鼠源抗體進(jìn)行了人源化改造，如1998年美國(guó)FDA批準(zhǔn)了新型抗Her2人源化抗體用于治療Her2陽(yáng)性的轉(zhuǎn)移性乳腺癌，該抗體即Herceptin，在臨床試驗(yàn)和后續(xù)的應(yīng)用中取得了十分確切的療效。國(guó)內(nèi)專(zhuān)利01132225.X也公開(kāi)了一種抗Her2抗體，前期的臨床前研究已經(jīng)證實(shí)其可在體外與Her2受體陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞特異、可逆、高親和力地結(jié)合，可抑制Her2陽(yáng)性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的體外增殖，還可抑制Her2陽(yáng)性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞裸鼠異種移植模型的腫瘤生長(zhǎng)。荷瘤小鼠注射該抗體后24～60小時(shí)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，抗體集中分布于腫瘤組織中。
由于抗Her2單克隆抗體藥物的適應(yīng)癥為Her2陽(yáng)性的乳腺癌患者，因此在進(jìn)行臨床研究乃至今后臨床應(yīng)用時(shí)，需要確定備選患者腫瘤組織Her2抗原的表達(dá)情況。但是，目前已有的乳腺癌診斷試劑普遍存在操作程序煩瑣，非特異性高的問(wèn)題，不能簡(jiǎn)便、迅速、準(zhǔn)確地判斷患者腫瘤組織Her2抗原的表達(dá)情況。因此，目前醫(yī)學(xué)上迫切需要開(kāi)發(fā)一種能夠快速、便捷且準(zhǔn)確地進(jìn)行乳腺癌體外診斷的用品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種在進(jìn)行臨床研究和診斷時(shí)，能夠準(zhǔn)確測(cè)定受試者乳腺組織的Her2抗原的表達(dá)情況的測(cè)試片。
本發(fā)明的另一目的是提供一種乳腺癌的免疫組織化學(xué)診斷試劑盒。
本發(fā)明的另一目的是提供一種檢測(cè)受試者腫瘤組織中Her2抗原表達(dá)水平的方法。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種檢測(cè)乳腺組織中Her2表達(dá)的測(cè)試片，所述的測(cè)試片的一個(gè)主表面上具有以下區(qū)域(a)Her2高表達(dá)對(duì)照區(qū)，所述的高表達(dá)對(duì)照區(qū)設(shè)有Her2高表達(dá)的腫瘤組織切片；(b)Her2中表達(dá)對(duì)照區(qū)，所述的中表達(dá)對(duì)照區(qū)設(shè)有Her2中表達(dá)的腫瘤組織切片；(c)Her2無(wú)表達(dá)對(duì)照區(qū)，所述的無(wú)表達(dá)對(duì)照區(qū)設(shè)有Her2無(wú)表達(dá)的組織切片；(d)Her2檢測(cè)區(qū)，所述的檢測(cè)區(qū)用于放置待檢測(cè)的乳腺組織。
作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例，在所述的檢測(cè)乳腺組織中Her2表達(dá)的測(cè)試片中，所述Her2高表達(dá)的腫瘤組織切片選自D2F2/E2、HTB-20或SK-BR-3腫瘤組織切片。
作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例，在所述的檢測(cè)乳腺組織中Her2表達(dá)的測(cè)試片中，所述Her2中表達(dá)的腫瘤組織切片選自KYC或LYX腫瘤組織切片。
作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例，在所述的檢測(cè)乳腺組織中Her2表達(dá)的測(cè)試片中，所述Her2無(wú)表達(dá)的組織切片選自A431、QYC、MCF-7、RENCA腫瘤組織切片或Her2無(wú)表達(dá)的正常組織切片。
作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例，在所述的檢測(cè)乳腺組織中Her2表達(dá)的測(cè)試片中，所述的組織切片為石蠟包埋的切片。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種乳腺癌的Her2免疫組化診斷試劑盒，其包含所述的檢測(cè)乳腺組織中Her2表達(dá)的測(cè)試片。
作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例，在所述的乳腺癌的Her2免疫組化診斷試劑盒中，所述試劑盒中還包含免疫組化染色試劑，所述免疫組化染色試劑包含非特異性結(jié)合位點(diǎn)的阻斷劑，與組織抗原連接的初始抗體，與初始抗體連接的第二抗體，酶，底物，顯色劑。
作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例，在所述的乳腺癌的Her2免疫組化診斷試劑盒中，所述的初始抗體為抗Her2人源化單克隆抗體或鼠源抗Her2單克隆抗體，所述的第二抗體為生物素標(biāo)記的抗人IgG或抗鼠IgG。
作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例，在所述的乳腺癌的Her2免疫組化診斷試劑盒中，所述的非特異性結(jié)合位點(diǎn)的阻斷劑選自動(dòng)物血清，白蛋白；所述的酶為辣根過(guò)氧化物酶；所述的底物為H2O2；所述的顯色劑選自DAB-H2O2，AEC-H2O2，CN-H2O2。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種體外檢測(cè)樣品中Her2抗原表達(dá)水平的檢測(cè)方法，所述的樣品是腫瘤組織，該方法包括步驟將腫瘤組織制成切片；將所述切片置于所述測(cè)試片中的Her2檢測(cè)區(qū)，進(jìn)行免疫組化染色檢測(cè)，將樣品的染色情況與測(cè)試片上Her2高表達(dá)、中表達(dá)、無(wú)表達(dá)的組織切片的染色情況進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果判定如下染色情況≤Her2低表達(dá)區(qū)，判為陰性(-)；染色情況介于Her2低表達(dá)區(qū)和Her2中表達(dá)區(qū)之間，判為弱陽(yáng)性(+)；染色情況介于Her2中表達(dá)區(qū)和Her2高表達(dá)區(qū)之間，判為中強(qiáng)陽(yáng)性(++)；染色情況≥Her2高表達(dá)區(qū)，判為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。
更特別的，在所述的檢測(cè)方法中，所述Her2高表達(dá)的腫瘤組織切片選自D2F2/E2、HTB-20或SK-BR-3腫瘤組織切片；所述Her2中表達(dá)的腫瘤組織切片選自KYC或LYX腫瘤組織切片；所述Her2無(wú)表達(dá)的組織切片選自A431、QYC、MCF-7、RENCA或其它Her2無(wú)表達(dá)的組織切片。


圖1顯示了本發(fā)明的試劑盒中，組織切片在玻片上的分布示意圖，其中，1、2和3分別表示Her2高表達(dá)、中表達(dá)、低表達(dá)對(duì)照區(qū)，4表示檢測(cè)區(qū)。
圖2顯示了幾種細(xì)胞呈現(xiàn)不同表達(dá)強(qiáng)度熒光的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果，其中，A表示LYX細(xì)胞的結(jié)果，其Her2無(wú)表達(dá)；B表示QYC細(xì)胞的結(jié)果，其Her2無(wú)表達(dá)；C表示MCF-7細(xì)胞的結(jié)果，其Her2無(wú)表達(dá)；D表示RENCA細(xì)胞的結(jié)果，其Her2無(wú)表達(dá)；E表示KYC的結(jié)果，其Her2中度表達(dá)；F表示LYX細(xì)胞的結(jié)果，其Her2中度表達(dá)；G表示SK-BR-3細(xì)胞的結(jié)果，其Her2高度表達(dá)；H表示HTB-20細(xì)胞的結(jié)果，其Her2高度表達(dá)；I表示D2F2/E2細(xì)胞的結(jié)果，其Her2高度表達(dá)。
圖3顯示了強(qiáng)陽(yáng)、弱陽(yáng)和陰性的切片組織的一些照片，其中，A為MCF-7(Her2無(wú)表達(dá))；B為L(zhǎng)YX(Her2中度表達(dá))；C為D2F2/E2(Her2高度表達(dá))；D為樣品3(+)；E為樣品5(++)；F為樣品7(+++)。
具體實(shí)施例方式
由于目前已有的乳腺癌診斷試劑操作程序煩瑣，非特異性高，不能迅速、準(zhǔn)確的判斷患者腫瘤組織Her2抗原的表達(dá)情況。因此，本發(fā)明提供了一種可簡(jiǎn)便地測(cè)試患者Her2抗原表達(dá)情況，進(jìn)而可準(zhǔn)確診斷病情。本發(fā)明人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的研究，選取出Her2抗原表達(dá)水平呈高度、中度及無(wú)表達(dá)的多種不同的細(xì)胞，制備成具有良好均質(zhì)性的組織，做成組織切片后置于一定的載體上。在檢測(cè)時(shí)，將受試者的組織切片與對(duì)照切片同時(shí)進(jìn)行染色，然后進(jìn)行對(duì)比，即可判斷出受試者的Her2表達(dá)情況。
本發(fā)明人選取Her2抗原表達(dá)水平呈高度、中度及無(wú)表達(dá)的多種不同的細(xì)胞，建立Balb/c裸鼠的異種移植模型，并使成瘤率大大提高。因?yàn)椴捎眉?xì)胞系體外擴(kuò)增及特異性免疫功能缺陷的裸鼠體內(nèi)接種獲得的腫瘤組織，實(shí)為單克隆的腫瘤細(xì)胞增殖的結(jié)果，因此，腫瘤組織具有良好的均質(zhì)性，即腫瘤的不同部位，抗原表達(dá)水平一致。用這樣的組織作為判定標(biāo)準(zhǔn)更為可靠，也使判定依據(jù)具有更好的穩(wěn)定性。
應(yīng)理解，現(xiàn)有技術(shù)中存在許多種Her2無(wú)表達(dá)的正常組織，這些Her2無(wú)表達(dá)的正常組織也可用于本發(fā)明。
本發(fā)明選取固定、石蠟包埋的切片，而非冰凍切片，在保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠的前提下，降低了對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備及方法難度的要求，易于普及。
在本發(fā)明中，手術(shù)切除的組織及活檢獲得的組織都可用于檢測(cè)，降低了對(duì)受檢組織的要求，擴(kuò)大了可接受檢測(cè)患者的范圍。并且，受試者的腫瘤組織與Her2抗原呈不同表達(dá)水平的對(duì)照組織貼附于同一測(cè)試片，同時(shí)進(jìn)行IHC染色，最大程度消除了操作過(guò)程微小變化對(duì)染色結(jié)果帶來(lái)的誤差。
本發(fā)明采用Her2表達(dá)水平呈高度、中度及無(wú)表達(dá)的明確腫瘤組織作為對(duì)照，可對(duì)IHC染色過(guò)程進(jìn)行有效的監(jiān)控，對(duì)IHC染色結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)，提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，使假陽(yáng)性和假陰性的結(jié)果都得到有效的控制。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，未詳細(xì)說(shuō)明的技術(shù)為常規(guī)技術(shù)。
實(shí)施例1 Her2抗原呈不同表達(dá)水平的腫瘤細(xì)胞的選擇采用以下步驟進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的選擇1)備選腫瘤細(xì)胞包括人肝癌細(xì)胞QYC，人肝癌細(xì)胞KYC，人肝癌細(xì)胞LYX，小鼠腎腺癌細(xì)胞RENCA，D2F2/E2(前述五種細(xì)胞獲自第二軍醫(yī)大學(xué)國(guó)際合作腫瘤研究所)，人表皮癌細(xì)胞A431(購(gòu)自上海午立生物技術(shù)有限公司)及MCF-7(獲自美國(guó)國(guó)立癌癥研究所)，SK-BR-3(購(gòu)自上海午立生物技術(shù)有限公司)，HTB-20(購(gòu)自廣州維爾曼公司)。體外培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分別取各種細(xì)胞進(jìn)行熒光染色；2)細(xì)胞計(jì)數(shù)，將待測(cè)腫瘤細(xì)胞加入流式細(xì)胞儀專(zhuān)用檢測(cè)管中，2×105/管，200g×5分鐘離心，棄上清；3)用含1％小牛血清的PBS將rhHer2-mAb(獲自第二軍醫(yī)大學(xué)國(guó)際合作腫瘤研究所)稀釋至10μg/mL，加入上述流式管中，100μL/管，冰浴，避光孵育45分鐘；4)含1％小牛血清的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次均200g×5分鐘離心，棄上清；5)用含1％小牛血清的PBS將FITC-羊抗人IgG(購(gòu)自上海生物制品研究所)稀釋至1μg/mL，加入上述流式管中，100μL/管，冰浴，避光孵育45分鐘；6)含1％小牛血清的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次均200g×5分鐘離心，棄上清；7)將細(xì)胞沉淀用300μL含1％小牛血清的PBS重懸，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，Her2表達(dá)越強(qiáng)的細(xì)胞結(jié)合的熒光標(biāo)記抗體越多。
通過(guò)對(duì)照熒光強(qiáng)度，獲得Her2抗原呈高度表達(dá)的D2F2/E2、SK-BR-3、HTB-20；Her2呈中度表達(dá)的LYX、KYC，Her2無(wú)表達(dá)的MCF-7、QYC、A431、RENCA細(xì)胞。上述幾種細(xì)胞呈現(xiàn)不同表達(dá)強(qiáng)度的流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示在圖2中。
實(shí)施例2表達(dá)Her2抗原均一性腫瘤組織的制備制備方法1)選取實(shí)施例1中獲得的Her2分別呈現(xiàn)高度、中度、無(wú)表達(dá)的D2F2/E2、LYX及MCF-7三種腫瘤細(xì)胞，于含有10％胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中傳代擴(kuò)增，培養(yǎng)條件為5％ CO2，37℃及飽和濕度；2)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的三種細(xì)胞，PBS洗滌，200g×5分鐘離心，棄上清，細(xì)胞沉淀重懸于PBS中，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至1×107/mL；3)將腫瘤細(xì)胞懸液分別接種于Balb/c裸鼠頸部皮下，定期觀察接種局部腫瘤生長(zhǎng)情況及受試動(dòng)物的一般情況；4)待腫瘤長(zhǎng)至0.5cm3左右大小(腫瘤體積計(jì)算公式為x2y/2，其中x為腫瘤長(zhǎng)徑，y為腫瘤短徑)，頸椎脫臼法處死受試動(dòng)物，無(wú)菌摘取腫瘤組織；5)將腫瘤組織箭碎，研磨通過(guò)200目鋼網(wǎng)；6)過(guò)鋼網(wǎng)的細(xì)胞懸液用PBS洗滌，200g×5分鐘離心，棄上清，細(xì)胞沉淀重懸于含有10％胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，進(jìn)行原代腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5％CO2，37℃及飽和濕度；7)腫瘤細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，如上法，再次接種Balb/c裸鼠，定期觀察接種局部腫瘤生長(zhǎng)情況及受試動(dòng)物的一般情況；8)待腫瘤長(zhǎng)至0.5cm3左右大小(腫瘤體積計(jì)算公式為x2y/2，其中x為腫瘤長(zhǎng)徑，y為腫瘤短徑)，頸椎脫臼法處死受試動(dòng)物，無(wú)菌摘取腫瘤組織，再次進(jìn)行原代培養(yǎng)，結(jié)果獲得的三種腫瘤細(xì)胞D2F2/E2、LYX及MCF-7在Balb/c裸鼠體內(nèi)的成瘤率已達(dá)100％；9)將前述獲得的腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后接種于Balb/c裸鼠，定期觀察接種局部腫瘤生長(zhǎng)情況及受試動(dòng)物的一般情況；10)待腫瘤長(zhǎng)至0.5cm3左右大小(腫瘤體積計(jì)算方法與前述相同)，頸椎脫臼法處死受試動(dòng)物，摘取腫瘤組織，固定于多聚甲醛。
實(shí)施例3腫瘤組織病理切片的制備及表面Her2抗原表達(dá)的檢測(cè)1.制片1)多聚甲醛磷酸緩沖液的配制多聚甲醛40g，0.1mol/L pH7.4的PBS500mL，兩者混合加熱至60℃，攪拌并滴加1N NaOH至溶液清晰為止，冷卻后加PBS至總體積為1000mL。
2)摘取腫瘤組織后，盡快處理取材的組織，力求保持組織新鮮，不干燥，組織塊不可過(guò)大或過(guò)厚，尤其厚度不要超過(guò)1cm。
3)取材的組織固定于多聚甲醛磷酸緩沖液，固定液量要充足，至少20倍于組織的量，否則會(huì)造成固定液濃度降低，固定時(shí)間以完全浸透組織為宜(48小時(shí))，固定時(shí)間過(guò)久可能會(huì)影響染色效果。
4)組織的脫水、透明、浸蠟整個(gè)操作過(guò)程中要掌握的原則是脫水透明要夠而不過(guò)，浸蠟的溫度不宜超過(guò)64℃，否則可能使抗原活性下降，降低檢出率，或是造成組織焦脆，切片困難，具體程序如下表1。
5)從蠟缸拿出后用石蠟進(jìn)行包埋。
6)載玻片的預(yù)處理載玻片的處理是做好免疫組化染色的重要步驟，本發(fā)明采用多聚左旋賴(lài)氨酸處理載玻片。
切片用石蠟切片機(jī)將包埋有組織的蠟塊切成薄片，切片厚度4μm，45℃水溫展片，要盡量展平，否則皺褶處易出現(xiàn)非特異染色。55℃溫箱烤片2小時(shí)，防水密封，低溫保存?zhèn)溆谩?br> 表1組織脫水、透明、浸蠟程序

7)石蠟切片的脫蠟至水石蠟切片脫蠟至水是組織脫水、透明、浸蠟和包埋的逆向過(guò)程，具體操作流程如下a)4μm石蠟切片，55℃溫箱烤片18小時(shí)后開(kāi)始脫蠟；b)二甲苯I、II和III級(jí)各10分鐘；c)無(wú)水乙醇、90％乙醇、80％乙醇及70％乙醇各2分鐘；d)自來(lái)水洗2-3分鐘，進(jìn)入IHC染色。
2.免疫組化(IHC)染色(1)熱誘導(dǎo)的抗原修復(fù)1)熱修復(fù)方法100℃水浴，10分鐘×2；2)熱修復(fù)的介質(zhì)0.01mol/L pH6.0檸檬酸緩沖液。
通過(guò)抗原修復(fù)處理，可以提高抗原抗體陽(yáng)性檢測(cè)率。
(2)ABC法染色ABC法的特點(diǎn)是利用親和素分別連接生物素標(biāo)記的第二抗體和生物素標(biāo)記的酶。染色步驟如下1)切片常規(guī)脫蠟至水，PBS洗3×3分鐘；2)3％過(guò)氧化氫(H2O2)孵育5分鐘，用以清除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶反應(yīng)；3)蒸餾水洗，PBS浸泡5分鐘；4)稀釋的正常小牛血清(阻斷劑)，室溫孵育20分鐘；5)吸去多余的小牛血清；6)抗Her2人源化單克隆抗體或鼠源抗Her2單克隆抗體(獲自第二軍醫(yī)大學(xué)國(guó)際合作腫瘤研究所)稀釋至10μg/mL，37℃孵育60分鐘或4℃過(guò)夜；7)PBS洗3×3分鐘；8)生物素標(biāo)記的抗人IgG或抗鼠IgG(購(gòu)自晶美公司)，37℃孵育30-60分鐘；9)PBS洗3×3分鐘；10)ABC復(fù)合物(購(gòu)自晶美公司)，37℃孵育30-60分鐘；11)PBS洗3×3分鐘；12)DAB-H2O2顯色5-10分鐘，水洗；13)蘇木素復(fù)染、脫水、封固。
將制備的病理組織切片抽樣檢測(cè)，染色結(jié)果證實(shí)D2F2/E2、LYX及MCF-7腫瘤組織經(jīng)如上所述的ICH染色法檢測(cè)，其Her2抗原的表達(dá)水平分別呈高、中及無(wú)不同的水平，即顯色呈強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性及陰性。不同切片位置的組織染色結(jié)果均勻，表明腫瘤細(xì)胞在接種動(dòng)物體內(nèi)形成的腫瘤組織具有良好的均質(zhì)性。因此，該組切片可用于檢測(cè)腫瘤患者腫瘤組織Her2抗原的表達(dá)水平。
實(shí)施例4腫瘤患者腫瘤組織Her2抗原表達(dá)水平的檢測(cè)獲取10位腫瘤患者手術(shù)切除的腫瘤組織或活檢獲得的腫瘤組織，經(jīng)與前述相同的方法固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片后，將切片貼附于已制備好的檢測(cè)用對(duì)照切片載片的另一端，而后利用相同的方法進(jìn)行ICH的染色檢測(cè)。
結(jié)果判斷
D2F2/E2、LYX及MCF-7腫瘤組織染色情況須為強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性及陰性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效，按下述步驟進(jìn)行判斷，否則實(shí)驗(yàn)無(wú)效；患者腫瘤組織染色情況與D2F2/E2、LYX及MCF-7腫瘤組織染色情況進(jìn)行比對(duì)，染色情況≤MCF-7，判為陰性(-)；染色情況介于MCF-7、LYX之間，判為弱陽(yáng)性(+)；染色情況介于LYX、D2F2/E2之間，判為中強(qiáng)陽(yáng)性(++)；染色情況≥D2F2/E2，判為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)，結(jié)果見(jiàn)表2。
表2

部分受試樣品的切片的染色情況見(jiàn)圖3，圖3中可見(jiàn)，A為MCF-7，Her2無(wú)表達(dá)；B為L(zhǎng)YX，Her2中度表達(dá)；C為D2F2/E2，Her2高度表達(dá)；D為樣品3(+)；E為樣品5(++)；F為樣品7(+++)。
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權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)乳腺組織中Her2表達(dá)的測(cè)試片，其特征在于，所述的測(cè)試片的一個(gè)主表面上具有以下區(qū)域(a)Her2高表達(dá)對(duì)照區(qū)，所述的高表達(dá)對(duì)照區(qū)設(shè)有Her2高表達(dá)的腫瘤組織切片；(b)Her2中表達(dá)對(duì)照區(qū)，所述的中表達(dá)對(duì)照區(qū)設(shè)有Her2中表達(dá)的腫瘤組織切片；(c)Her2無(wú)表達(dá)對(duì)照區(qū)，所述的無(wú)表達(dá)對(duì)照區(qū)設(shè)有Her2無(wú)表達(dá)的組織切片；(d)Her2檢測(cè)區(qū)，所述的檢測(cè)區(qū)用于放置待檢測(cè)的乳腺組織。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)乳腺組織中Her2表達(dá)的測(cè)試片，其特征在于，所述Her2高表達(dá)的腫瘤組織切片選自D2F2/E2、HTB-20或SK-BR-3腫瘤組織切片。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)乳腺組織中Her2表達(dá)的測(cè)試片，其特征在于，所述Her2中表達(dá)的腫瘤組織切片選自KYC或LYX腫瘤組織切片。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)乳腺組織中Her2表達(dá)的測(cè)試片，其特征在于，所述Her2無(wú)表達(dá)的組織切片選自A431、QYC、MCF-7、RENCA腫瘤組織切片或Her2無(wú)表達(dá)的正常組織切片。
5根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的檢測(cè)乳腺組織中Her2表達(dá)的測(cè)試片，其特征在于，所述的組織切片為石蠟包埋的切片。
6.一種乳腺癌的Her2免疫組化診斷試劑盒，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的檢測(cè)乳腺組織中Her2表達(dá)的測(cè)試片。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的乳腺癌的Her2免疫組化診斷試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包含免疫組化染色試劑，所述免疫組化染色試劑包含非特異性結(jié)合位點(diǎn)的阻斷劑，與組織抗原連接的初始抗體，與初始抗體連接的第二抗體，酶，底物，顯色劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的乳腺癌的Her2免疫組化診斷試劑盒，其特征在于，所述的初始抗體為抗Her2人源化單克隆抗體或鼠源抗Her2單克隆抗體，所述的第二抗體為生物素標(biāo)記的抗人IgG或抗鼠IgG。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的乳腺癌的Her2免疫組化診斷試劑盒，其特征在于，非特異性結(jié)合位點(diǎn)的阻斷劑選自動(dòng)物血清，白蛋白；所述的酶為辣根過(guò)氧化物酶；所述的底物為H2O2；或者所述的顯色劑選自DAB-H2O2，AEC-H2O2，CN-H2O2。
10.一種體外檢測(cè)樣品中Her2抗原表達(dá)水平的檢測(cè)方法，所述的樣品是腫瘤組織，其特征在于，該方法包括步驟將腫瘤組織制成切片；將所述切片置于權(quán)利要求1所述的檢測(cè)乳腺組織中Her2表達(dá)的測(cè)試片中的Her2檢測(cè)區(qū)，進(jìn)行免疫組化染色檢測(cè)，將樣品的染色情況與測(cè)試片上Her2高表達(dá)、中表達(dá)、無(wú)表達(dá)的組織切片的染色情況進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果判定如下染色情況≤Her2低表達(dá)區(qū)，判為陰性(-)；染色情況介于Her2低表達(dá)區(qū)和Her2中表達(dá)區(qū)之間，判為弱陽(yáng)性(+)；染色情況介于Her2中表達(dá)區(qū)和Her2高表達(dá)區(qū)之間，判為中強(qiáng)陽(yáng)性(++)；染色情況≥Her2高表達(dá)區(qū)，判為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)乳腺組織中Her2表達(dá)的測(cè)試片，所述的測(cè)試片的一個(gè)主表面上具有Her2高表達(dá)對(duì)照區(qū)、Her2中表達(dá)對(duì)照區(qū)、Her2無(wú)表達(dá)對(duì)照區(qū)以及用于放置待檢測(cè)的乳腺組織的Her2檢測(cè)區(qū)。本發(fā)明還公開(kāi)了乳腺癌的Her2免疫組化診斷試劑盒和檢測(cè)方法。本發(fā)明能夠準(zhǔn)確測(cè)定受試者乳腺組織的Her2抗原的表達(dá)情況，為乳腺癌的臨床診斷提供了準(zhǔn)確的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。
文檔編號(hào)G01N33/574GK1928563SQ20051002953
公開(kāi)日2007年3月14日 申請(qǐng)日期2005年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月9日
發(fā)明者郭亞軍, 王皓, 侯盛, 錢(qián)衛(wèi)珠 申請(qǐng)人:上海張江生物技術(shù)有限公司