本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于智能恒溫擴增技術(shù)檢測人egfr基因t790m點突變的引物組、試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，位居我國城市人口惡性腫瘤死亡原因之首。非小細(xì)胞肺癌(non-smallcelllungcancer，nsclc)占所有肺癌類型的85％，逾70％患者在確診時已處于中晚期。臨床對晚期nsclc患者的治療已由廣譜化療轉(zhuǎn)向分子靶向治療，表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor，egfr)基因是東亞裔肺腺癌的主要驅(qū)動基因，針對該分子靶點進行表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermalgrowthfactorreceptortyrosinekinaseinhibitor,egfr-tki)靶向治療，可有效改善egfr基因敏感突變攜帶者的預(yù)后。然而，幾乎所有靶向治療的患者終將發(fā)生耐藥，其中50％-60％耐藥機制為egfr基因t790m突變，而三代egfr-tki已證實能有效地抑制該突變。因此egfr基因t790m突變檢測已成為nsclc患者明確耐藥機制和調(diào)整治療方案必須參考的重要指標(biāo)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，出現(xiàn)了眾多以分子生物學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)的egfr突變檢測方法，如熒光定量pcr、dna探針、dna芯片、dna直接測序等，以其高效、特異等優(yōu)點而受到青睞；但這些檢測技術(shù)對檢測人員技術(shù)水平要求高，并且這些技術(shù)需要的檢測儀器昂貴、檢測周期長，難以實現(xiàn)快速檢測和臨床推廣的目的。所以，在臨床檢測和科學(xué)研究實踐中均需要一種降低操作技術(shù)和費用、快速簡便、容易普及、安全可靠的檢測方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明所解決的技術(shù)問題在于提供一種檢測人egfr基因t790m點突變的智能恒溫擴增引物組。

本發(fā)明所解決的技術(shù)問題還在于提供一種檢測人egfr基因t790m點突變智能恒溫擴增檢測試劑盒。

本發(fā)明所解決的技術(shù)問題還在于提供一種檢測人egfr基因t790m點突變的智能恒溫擴增檢測方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：

一方面，本發(fā)明公開了一種檢測人egfr基因t790m點突變的智能恒溫擴增檢測引物組，包括tp引物、fp引物、bp引物、op1引物和op2引物，其核苷酸序列分別如下所示：

fp引物：cctatcggcataggggtcctccaagtagtttg

tp引物：gttcccggactccaccgtgcagctcatcat

bp引物：gcagccgaagggcatgagc

op1引物：gctgggcatctgcctcac

op2引物：ccaggtcgcggtgcacc。

優(yōu)選地，擴增反應(yīng)時，tp引物、fp引物、bp引物、op1引物和op2引物的摩爾比為：8：8：4：1：1。

另一方面，本發(fā)明還公開了一種檢測人egfr基因t790m點突變的智能恒溫擴增檢測試劑盒，該檢測試劑盒中含有上述方案中所列的智能恒溫擴增引物組。

優(yōu)選地，該智能恒溫擴增檢測試劑盒還包括以下成分的部分或者全部：(1)dna聚合酶；(2)錯配結(jié)合蛋白；(3)智能恒溫擴增反應(yīng)液；(4)熒光顯色劑；(5)陽性對照和陰性對照。

優(yōu)選地，該智能恒溫擴增檢測試劑盒中，其引物中tp引物、fp引物、bp引物、op1引物和op2引物的摩爾比為：8：8：4：1：1。

優(yōu)選地，所述dna聚合酶為bstdna聚合酶；所述錯配結(jié)合蛋白為tapmuts錯配結(jié)合蛋白。

優(yōu)選地，所述智能恒溫擴增反應(yīng)液含有：28mmdntps、10％dmso、40mmtris-hcl(ph8.8)、20mmkcl、20mm(nh4)2so4、16mmmgso4，0.2％

優(yōu)選地，陽性對照為含有檢測人egfr基因t790m突變點基因片段的t載體克隆，陰性對照為不含人egfr基因t790m突變點基因片段的水或其他溶劑。更優(yōu)地，陰性對照為去離子水。

優(yōu)選地，所述顯色劑為1/50000原液稀釋的greeni。

再有，本發(fā)明還公開了一種檢測人egfr基因t790m點突變的智能恒溫擴增檢測方法，包括如下步驟：

(1)待檢樣品dna的提?。?/p>

(2)智能恒溫擴增反應(yīng)：將步驟(1)中提取的待檢樣品dna加入智能恒溫擴增反應(yīng)體系中，混勻后離心，并于63℃反應(yīng)40min；該智能恒溫擴增反應(yīng)體系中含有上述方案中所述的智能恒溫擴增引物組；

(3)結(jié)果判斷：通過觀察ese-tubescanner擴增儀的擴增曲線判斷擴增結(jié)果。

優(yōu)選地，所用智能恒溫擴增反應(yīng)的體系為：25μl反應(yīng)體系中含有tp和ep引物各1.6μmol/l、bp引物0.8μmol/l、op1和op2引物各0.5μmol/l、dntp0.5mmol/l、甜菜堿0.6mol/l、(nh4)2so4mmol/l、mgcl22.5mmol/l、kcl10mmol/l、mgso42mmol/l、greeni0.5μl、ph為8.8的tris-hcl20mmol/l、0.2％6ubstdna聚合酶、1μgtapmuts、1μldna步驟(1)中提取的待檢樣品dna，用去離子水補齊到25μl。

本發(fā)明的檢測人egfr基因t790m點突變的智能恒溫擴增檢測方法可以通過本發(fā)明方案中的所公開的智能恒溫擴增檢測試劑盒得以實施，也可以采用基于本發(fā)明的原理和設(shè)計思路采用其他類似智能恒溫擴增檢測試劑盒得以實現(xiàn)。

從原理上講，本發(fā)明以智能恒溫擴增技術(shù)為依托，開發(fā)一種可快速檢測出人egfr基因t790m點突變的引物組、試劑盒和方法，智能恒溫擴增法(smartamplificationprocess)是一種基于鏈置換酶和dna錯配修復(fù)蛋白的基因突變檢測體系。智能恒溫擴增技術(shù)的基本原理，即獲取目標(biāo)序列后在等溫條件下對其反復(fù)進行擴增，并通過熒光實時監(jiān)測，以檢測目標(biāo)序列的存在。

因此，結(jié)合上述原理及本發(fā)明實施例中的技術(shù)效果可知，本發(fā)明至少包含如下有益效果：

本發(fā)明所設(shè)計的5條引物中，tp由退火序列和一段能夠與目標(biāo)序列互補的核苷酸序列構(gòu)成，fp帶有一個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，他們的退火位點分別位于目標(biāo)序列的兩端，可分別從兩端與互補的2條dna單鏈退火，向?qū)?cè)延伸。op1和op2的退火位點分別位于tp和fp外側(cè)，向中間退火延伸的同時將tp和fp延伸得到的雙鏈剝離。帶有tp或fp的單鏈被置換下來后又可作為模板，繼續(xù)上述過程，如此可形成2種關(guān)鍵的單鏈中間產(chǎn)物，這2種中間產(chǎn)物繼而分別以tp和fp的特殊結(jié)構(gòu)為起點，進行自身引導(dǎo)的dna合成。這樣循環(huán)往復(fù)，在dna聚合酶的作用下引起自循環(huán)鏈置換反應(yīng)，實現(xiàn)目標(biāo)序列的大量擴增。在此過程中，其中一條引物上結(jié)合一種雜交敏感的熒光引物，一旦與互補序列退火雜交，即可發(fā)出一定強度的熒光，然后由成本低廉的恒溫擴增儀(如ese-tubescanner)進行檢測。隨著擴增反應(yīng)的進行，熒光強度增大，當(dāng)超過檢測最低i值時即可確定擴增反應(yīng)的實現(xiàn)，也即目標(biāo)序列的存在。整個過程在恒溫條件下30-40min即可完成。智能恒溫擴增技術(shù)具有獨特的錯配抑制技術(shù)，能夠識別單個核苷酸的差異，成為單核苷酸多態(tài)性檢測的有力方法。這也是與其他等溫擴增技術(shù)，如環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增、鏈置換擴增、核酸序列擴增、轉(zhuǎn)錄酶擴增、滾環(huán)擴增、解鏈酶擴增等相比，智能恒溫擴增最為明顯的優(yōu)點，這些傳統(tǒng)的恒溫擴增無法識別dna片段中的突變點而難以實現(xiàn)基因多態(tài)性的檢測，而阻礙了恒溫擴增技術(shù)在基因多態(tài)性檢測領(lǐng)域的推廣。另外，智能恒溫擴增技術(shù)與傳統(tǒng)的檢測基因多態(tài)性的方法，如dna芯片、限制性片段長度多態(tài)性pcr、等位基因特異性多pcr，dna測序，taqman探針、invader等相比，其主要優(yōu)勢在于恒溫反應(yīng)這一特性決定了智能恒溫擴增法無需昂貴操作儀器，具有簡單、快速、成本低、靈敏度高等明顯優(yōu)勢。相比于其他檢測技術(shù)，本發(fā)明技術(shù)具有快速、精確、靈敏、特異、背景低、成本低等優(yōu)點，并擺脫常見核酸檢測技術(shù)對溫控的精準(zhǔn)要求束縛，具有檢測儀器價格低廉，檢測時間短，試劑費用低，技術(shù)要求低等優(yōu)點，具體而言：

(1)檢測時間短：在20-40min內(nèi)可實現(xiàn)將對基因多態(tài)性位點的檢測；

(2)恒溫檢測，常見的突變檢測技術(shù)需要變溫擴增過程，因此需要較為昂貴的含有變溫模塊的檢測儀；本技術(shù)只需在恒溫條件下借助特殊的酶即可實現(xiàn)恒溫檢測，無需昂貴儀器，成本低廉；

(3)特異性強：智能恒溫擴增技術(shù)具有獨特的錯配抑制技術(shù)，能夠識別單個核苷酸的差異。首先，反應(yīng)使用了5條不對稱引物，當(dāng)dna鏈與任何一條引物不匹配時，就會阻止后續(xù)的擴增反應(yīng)，外反應(yīng)體系中還加入了錯配結(jié)合蛋白taqmuts，如果引物出現(xiàn)單個堿基的錯配，taqmuts即結(jié)合到錯配區(qū)域，使擴增反應(yīng)停止。因此，此技術(shù)可克服傳統(tǒng)恒溫擴增法無法進行基因多態(tài)性檢測的局限，可準(zhǔn)確地檢測基因多態(tài)性，特異性強。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例3中采用本發(fā)明的試劑盒及方法進行的靈敏度實驗結(jié)果圖。

圖2是本發(fā)明實施例3中采用熒光定量pcr進行的靈敏度實驗結(jié)果圖。

圖3是本發(fā)明實施例4樣本測試實驗的結(jié)果圖一。

圖4是本發(fā)明實施例4樣本測試實驗的結(jié)果圖二。

具體實施方式

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。

實施例1智能恒溫擴增檢測試劑盒的建立

人egfr基因t790m點突變的智能恒溫擴增檢測試劑盒，包括智能恒溫擴增引物組、智能恒溫擴增反應(yīng)液、bstdna聚合酶、錯配結(jié)合蛋白tapmuts、陽性對照和陰性對照、熒光顯色劑。

(1)智能恒溫擴增引物設(shè)計：以人egfr基因t790m突變點為靶基因進行引物的設(shè)計。引物序列見表1。

表1引物序列表

(2)智能恒溫擴增反應(yīng)液含有：28mmdntps、10％dmso、40mmtris-hcl(ph8.8)、20mmkcl、20mm(nh4)2so4、16mmmgso4，0.2％

(3)陽性對照為含有人egfr基因t790m突變點基因片段的t載體克隆，其制備方法為：突變dna模板來源于攜帶egfr外顯子21上l858r點突變的細(xì)胞系h1975，利用表1中的op1和op2引物(seqidno：4和seqidno：5)對模版dna進行pcr擴增反應(yīng)，得到含靶基因序列的dna，回收該擴增片段，利用常規(guī)方法連接到t載體中，即為陽性對照。

(4)陰性對照為去離子水。

實施例2使用ese-quanttubescanner儀建立人egfr基因t790m點突變的檢測方法：

利用實施例1的試劑盒檢測人egfr基因t790m點突變的方法，包括如下步驟：

(1)待檢樣品dna的提??；

(2)恒溫基因擴增反應(yīng)：25μl反應(yīng)體系中含有tp和fp引物各1.6μmol/l、bp引物0.8μmol/l、op1和op2引物各0.5μmol/l、dntp0.5mmol/l、甜菜堿0.6mol/l、(nh4)2so4mmol/l、mgcl22.5mmol/l、kcl10mmol/l、mgso42mmol/l、greeni0.5μl、ph為8.8的tris-hcl20mmol/l、0.2％6ubstdna聚合酶、1μgtapmuts、1μldna模板，用去離子水補齊到25μl；設(shè)置陽性對照和陰性對照；將配制好的pcr管混勻后離心，并于63℃反應(yīng)40min。

(3)結(jié)果判斷：將反應(yīng)管放置在ese-tubescanner中進行反應(yīng)，觀察ese-tubescanner軟件判斷擴增結(jié)果，如果出現(xiàn)“s”型曲線則為陽性，無“s”型曲線則為陰性。

實施例3本發(fā)明檢測方法與熒光定量pcr法(taqman-mgb探針法)靈敏度的比較

(1)利用實施例1的試劑盒和實施例2的方法進行檢測

準(zhǔn)備樣品：

含野生型egfr基因的dna，dna來源可以是血清、血漿、外周血、口腔勁膜、胸腔積液、體液或者組織等。

egfr基因t790m突變陽性dna，突變dna模板來源于攜帶egfr外顯子21上l858r點突變的細(xì)胞系h1975細(xì)胞。

野生型dna與突變dna混合樣本，其中突變體與野生型的含量比分別為50％、10％、、5％、1％、0.5％、0.25％。

利用實施例1的試劑盒和實施例2的方法進行檢測，檢測結(jié)果見圖1。實驗結(jié)果表面，本發(fā)明方法檢出的靈敏度可達0.5％。

(2)熒光定量pcr法(taqman-mgb探針法)

taqman探針的序列為：

5’-vic-ctcatcacgcagctcatg-mgb-3’

5’-fam-ctcatcatgcagctcatg-mgb-3’

5’-aggcagccgaagggca-3’

5’-cctcacctccaccgtgca-3’

使用abi熒光定量pcr試劑盒進行熒光定量pcr反應(yīng)。

反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性10秒；65℃退火10秒；56℃延伸45秒；共進行35個循環(huán)；10℃終止反應(yīng)。

檢測結(jié)果見圖2，實驗結(jié)果表明，在突變樣本含量為1％時有檢出結(jié)果，突變樣本含量為0.5％時不能檢出。

由兩種方法比較可以看出，本發(fā)明的試劑盒的靈敏度的結(jié)果可以達到0.5％的濃度，而熒光定量pcr法(taqman-mgb探針法)方法的靈敏度為1％，而1％或以下顯示為陰性結(jié)果；經(jīng)比對，本發(fā)明的試劑盒及方法靈敏度明顯高于熒光定量pcr法(taqman-mgb探針法)方法的敏感度，能檢測出更低含量的樣品。

實施例4本發(fā)明檢測方對實際血液樣本的檢測

(1)樣本說明：取來自廣州三個三家醫(yī)院腫瘤科109例樣本，均為非小細(xì)胞肺癌、且egfr-tki靶向治療耐藥的患者，其中血液樣本51例，胸腔積液樣本28例，組織樣本30例。

(2)利用實施例1的試劑盒和實施例2的方法進行檢測，具體步驟及所用試劑詳見實施例1和實施例2。

(3)檢測結(jié)果：

表2、樣本檢測實驗結(jié)果

實驗結(jié)果顯示，109樣品中55例為egfr基因t790m發(fā)生突變的陽性樣本，其余為陰性樣本。圖3和圖4是任意選取的兩個陽性標(biāo)的測試實驗結(jié)果圖。經(jīng)過測序驗證發(fā)現(xiàn)，109樣品中是實際有56例為陽性樣板，53例為陰性樣本。除了一例組織樣本為檢測出陽性外，其他樣本通過本發(fā)明的方案檢出的結(jié)果與測序驗證的結(jié)果均一一對應(yīng)，因此，從檢出的準(zhǔn)確率來看，本發(fā)明的引物、試劑盒及方法準(zhǔn)確性高于98％。另外，樣本雖然來自血液、組織或者胸腔積液等不同樣本獲取部位，但是采用本發(fā)明的試劑盒及方法所檢出的陽性樣品在該類型樣本中所占比例也是非常近似的，也能充分說明本發(fā)明的引物組、試劑盒及方法能夠準(zhǔn)確地應(yīng)用于各種樣本來源的樣品的檢測。

最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。

序列表

<110>暨南大學(xué)

<120>檢測人egfr基因t790m點突變的智能恒溫擴增引物組、檢測試劑盒及方法

<160>5

<210>1

<211>32

<212>人工序列

<400>1

cctatcggcataggggtcctccaagtagtttg

<210>2

<211>30

<212>人工序列

<400>2

gttcccggactccaccgtgcagctcatcat

<210>3

<211>19

<212>人工序列

<400>3

gcagccgaagggcatgagc

<210>4

<211>18

<212>人工序列

<400>4

gctgggcatctgcctcac

<210>5

<211>17

<212>人工序列

<400>5

ccaggtcgcggtgcacc