專利名稱：同源重組方法和克隆方法以及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因的同源重組方法和靶基因的克隆方法以及用于上述方法的試劑盒。
背景技術(shù)：
所謂DNA克隆，是指使目的基因與質(zhì)粒、噬菌體、黏粒等具有自身復(fù)制能力的載體 結(jié)合，之后導(dǎo)入大腸桿菌等宿主中使其增殖，從而大量制作相同基因集團(tuán)的技術(shù)。大腸桿菌 中的克隆和亞克隆按照下述方法進(jìn)行使用DNA連接酶，使利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的方法 等擴(kuò)增的目的基因與具有復(fù)制起點(diǎn)和抗生素選擇標(biāo)記的載體結(jié)合，再將其導(dǎo)入大腸桿菌細(xì) 胞中，之后研究抗生素耐性，從而篩選出被克隆的細(xì)胞。所述常規(guī)克隆技術(shù)成為現(xiàn)代生命科學(xué)的基礎(chǔ)，被廣泛用于在人基因組計(jì)劃完成以 后得到了飛躍發(fā)展的、基于基因信息的大量基因的克隆和高速的蛋白表達(dá)等中。但在現(xiàn)有 基因操作方法中，存在以下局限要求用相同識(shí)別位點(diǎn)的限制酶切斷插入DNA和載體、以及 在選擇限制酶時(shí)還選擇不切斷插入DNA或載體的內(nèi)部的酶等。另外，在處理限制酶和連接 酶的過程中需要高端技術(shù)，而且使用高價(jià)的酶所導(dǎo)致的高成本也不容忽視。1990年代以后，人們對(duì)使用識(shí)別特定的核苷酸序列以促進(jìn)DNA片段間的重 組的序列特異性基因重組酶的基因操作技術(shù)的關(guān)注逐漸提高。特別開發(fā)了使用識(shí)別 attL、attR、attB、attP等的特異性DNA序列的基因整合酶來克隆基因的Gateway體系 (Invitrogen (株)制)，將其廣泛用于大量基因的快速克隆和蛋白表達(dá)。雖然該方法與常 規(guī)限制酶_連接反應(yīng)一樣，通過細(xì)胞外的基因操作來進(jìn)行，但卻是一種使用以持有attL或 attR的線性DNA片段介導(dǎo)的LR Clonase( ” a f —七)和識(shí)別attP與attB之間的BP Clonase的新型克隆方法。在該方法中，首先，利用常規(guī)的基因操作將目的基因克隆到插入 載體中，通過利用存在于該插入載體中的attL、attR、attB、attP等特異性重組序列和識(shí)別 該序列的稱作Clonase的酶的同源重組反應(yīng)，可以將基因移入具有同樣的特異性重組序列 的各種表達(dá)載體中。該方法對(duì)大量基因的快速亞克隆和表達(dá)的檢測(cè)有效，但最初必須首先 將目標(biāo)DNA片段通過常規(guī)的克隆方法克隆到插入載體中，不適于克隆不具有特異性重組序 列的任意的DNA片段。另一方面，在大腸桿菌細(xì)胞中，參與雙鏈切斷的修復(fù)的蛋白R(shí)ecA、RecB⑶催化同 源重組反應(yīng)。在該重組反應(yīng)中，當(dāng)存在數(shù)百個(gè)以上的核苷酸顯示出相同序列的DNA片段時(shí)， 有時(shí)會(huì)發(fā)生同源重組。但是，當(dāng)同源DNA的長度為40-50個(gè)以下時(shí)，極難發(fā)生大腸桿菌自身 的基因重組，只限于導(dǎo)入了來自噬菌體的重組酶RecKReda / 0 )或RecE/T體系的情況下， 才有可能發(fā)生同源基因間的重組。使用這種含有短同源區(qū)的DNA片段的基因重組，被用于控制微生物的遺傳體的技術(shù)或不受限制酶/連接酶影響的細(xì)胞內(nèi)克隆等(非專利文獻(xiàn)1、專 利文獻(xiàn)1)。非專利文獻(xiàn)1 Zhang 等人，1998，Nature Genetics, 20，123-128，Zhang 等人， 2000, Nature Biotechnology 18,1314-1317專利文獻(xiàn)1 日本特表2002-503448號(hào)公報(bào)(對(duì)應(yīng)的W099/29837)上述專利文獻(xiàn)1和非專利文獻(xiàn)1的全部內(nèi)容均以公開的形式特別引用于此。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題利用線性化質(zhì)粒載體與PCR產(chǎn)物間的同源重組反應(yīng)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)克隆時(shí)，采用以下 方法首先，使長度為50個(gè)核苷酸的序列同源區(qū)位于插入DNA的兩端，即使在載體中也利用 限制酶進(jìn)行切斷使序列同源區(qū)位于兩端，之后導(dǎo)入具有同源重組酶的大腸桿菌中。例如，以PCR產(chǎn)物的形式制備插入DNA時(shí)，在PCR時(shí)的引物與模板的結(jié)合特異性低 的情況下、或模板中存在多個(gè)與引物序列類似的序列的情況下等，非特異性擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié) 果，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)下述情形夾在兩端的序列同源區(qū)中的區(qū)并不是作為克隆對(duì)象的靶區(qū)。當(dāng)夾在序列同源區(qū)中的區(qū)不是作為克隆對(duì)象的靶區(qū)時(shí)，也使用存在于引物中的序 列同源區(qū)，與目標(biāo)基因一樣被克隆化。于是，本發(fā)明的目的在于提供采用同源重組的基因克隆方法中使用的同源重組 方法，該方法可以選擇性地同源重組目標(biāo)基因。本發(fā)明的目的還在于提供靶基因的克隆方法，該方法包括擴(kuò)增利用上述可以選 擇性地同源重組目標(biāo)基因的方法得到的重組DNA分子。解決課題的方法常規(guī)的同源重組中，存在于線性化載體兩端的同源重組區(qū)與存在于擴(kuò)增用引物序 列中的同源區(qū)相同。相對(duì)于此，本發(fā)明中的線性化載體所具有的同源重組區(qū)具有以下特征 在載體側(cè)除了添加擴(kuò)增用引物序列，還添加僅存在于靶基因中的擴(kuò)增用引物序列的內(nèi)側(cè)序 列，從而從使用擴(kuò)增用引物得到的擴(kuò)增產(chǎn)物中選擇性地同源重組靶DNA片段。本發(fā)明如下所述。[1]同源重組方法，該方法使用PCR產(chǎn)物和線性化載體，所述PCR產(chǎn)物包含兩末端 具有擴(kuò)增用引物序列P1和P2的靶基因序列；所述線性化載體具有包含與該P(yáng)CR產(chǎn)物的擴(kuò) 增用引物序列P1和P2同源的核苷酸序列的同源重組區(qū)VP1和VP2，并且，在VP1的末端側(cè) 具有包含與P1內(nèi)側(cè)的部分序列T1同源的核苷酸序列的同源重組區(qū)VT1、和/或在VP2的末 端側(cè)具有包含與P2內(nèi)側(cè)的部分序列T2同源的核苷酸序列的同源重組區(qū)VT2(其中，T1和 T2的至少一方具有靶基因所特有的核苷酸序列)，該方法包括使上述PCR產(chǎn)物參與同源重組反應(yīng)，以將其插入上述載體中，從而得 到在載體中特異性地插入有目標(biāo)PCR產(chǎn)物的重組DNA分子。[2] [1]所述的方法，其中T1和T2的兩方具有靶基因所特有的核苷酸序列。[3] [1]或[2]所述的方法，其中擴(kuò)增用引物序列P1和P2的一方或兩方具有靶基 因所特有的核苷酸序列。[4] [1] [3]中任一項(xiàng)所述的方法，其中PCR產(chǎn)物通過2次PCR制備而成，在第1次PCR中，使用包含T1序列的擴(kuò)增用引物和包含P3序列的擴(kuò)增用引物來實(shí)施(其中，P3 序列與上述載體所具有的同源重組區(qū)VT1、VP1、VT2和VP2不具有同源性)；在第2次PCR 中，使用包含P1序列的擴(kuò)增用引物和包含P2序列的擴(kuò)增用引物來實(shí)施。[5] [4]所述的方法，其中包含P1序列的擴(kuò)增用引物的3’端側(cè)區(qū)和包含T1序列的 擴(kuò)增用引物的5’端側(cè)區(qū)具有部分重復(fù)的序列，而包含P2序列的擴(kuò)增用引物和包含P3序列 的擴(kuò)增用引物具有或不具有部分重復(fù)的序列。[6] [1] [5]中任一項(xiàng)所述的方法，其中擴(kuò)增用引物序列P1和P2分別為10個(gè)核 苷酸以上。[7] [1] [6]中任一項(xiàng)所述的方法，其中載體的同源重組區(qū)VP1+VT1和VP2+VT2 分別為11個(gè)核苷酸以上。[8] [1] [7]中任一項(xiàng)所述的方法，其中一方或兩方的擴(kuò)增用引物序列P1和P2 來自核酸酶耐性寡引物(3 ” > 7 —七耐性才丨J :f ，4 一 一)。[9] [1] [8]中任一項(xiàng)所述的方法，其中上述靶基因?yàn)榭贵w基因或T細(xì)胞受體基 因，包含來自上述抗體基因或T細(xì)胞受體基因的恒定區(qū)的序列和來自可變區(qū)的序列，上述 載體的同源重組區(qū)VP1+VT1和VP2+VT2的一方為來自抗體基因或T細(xì)胞受體基因的恒定區(qū) 的序列。[10] [9]所述的方法，其中上述載體的同源重組區(qū)VP1+VT1和VP2+VT2的另一方具 有不是來自抗體基因和T細(xì)胞受體基因的核苷酸序列。[11] [1] [10]中任一項(xiàng)所述的方法，其中上述同源重組反應(yīng)是使用Red (Red a/ 3 )或RecE/T體系在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。[12] [1] [10]中任一項(xiàng)所述的方法，其中上述同源重組反應(yīng)通過In-Fusion法 來進(jìn)行。[13]靶基因的克隆方法，該方法包括利用[1] [12]中任一項(xiàng)所述的同源重組 方法，制備在載體中特異性地插入有目標(biāo)PCR產(chǎn)物的重組DNA分子，之后擴(kuò)增具有所得的重 組DNA分子的重組體。[14]試劑盒，其中含有線性化載體，該線性化載體用于同源重組方法，所述同源重 組方法包括得到在載體中特異性地插入有PCR產(chǎn)物的重組DNA分子，所述PCR產(chǎn)物含有在 兩末端具有擴(kuò)增用引物序列P1和P2的靶基因序列，上述線性化載體具有包含與PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增用引物序列P1和P2同源的核苷酸序 列的同源區(qū)VP1和VP2，并且在VP1的末端側(cè)具有包含與P1內(nèi)側(cè)的部分序列T1同源的核苷 酸序列的同源重組區(qū)VT1、和/或在VP2的末端側(cè)具有包含與P2內(nèi)側(cè)的部分序列T2同源的 核苷酸序列的同源重組區(qū)VT2。[15] [14]所述的試劑盒，其中上述同源重組方法為[1] [12]中任一項(xiàng)所述的方法。[16] [14]或[15]所述的試劑盒，其中上述重組DNA分子用于靶基因的克隆方法， 所述靶基因的克隆方法包括擴(kuò)增具有該重組DNA分子的重組體。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明的方法(利用內(nèi)部序列依賴性同源重組反應(yīng)的方法)，即使在靶DNA片 段與非靶DNA片段混在一起的情況下，無需純化靶DNA片段(除去非靶DNA片段)，也可以高效率地將靶DNA片段導(dǎo)入載體中，通過使用導(dǎo)入了該靶DNA片段的載體，可以高效率地克 隆靶DNA片段。根據(jù)本發(fā)明的方法(利用使用核酸酶耐性寡引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物和內(nèi)部序列依賴 性同源重組反應(yīng)的方法)，即使在靶DNA片段與非靶DNA片段混在一起的情況下，也無需純 化靶DNA片段(除去非靶DNA片段)，與上述利用內(nèi)部序列依賴性同源重組反應(yīng)的方法相 比，可以以更高的概率(選擇性)將靶DNA片段插入載體中，通過使用導(dǎo)入有該靶DNA片段 的載體，可以以更高的效率克隆靶DNA片段。
具體實(shí)施例方式[同源重組方法]本發(fā)明的同源重組方法，使用PCR產(chǎn)物和線性化載體，所述PCR產(chǎn)物包含兩末端具 有擴(kuò)增用引物序列P1和P2的靶基因序列；所述線性化載體具有包含與該P(yáng)CR產(chǎn)物的擴(kuò)增 用引物序列P1和P2同源的核苷酸序列的同源重組區(qū)VP1和VP2，并且在VP1的末端側(cè)具有 包含與P1內(nèi)側(cè)的部分序列T1同源的核苷酸序列的同源重組區(qū)VT1、和/或在VP2的末端側(cè) 具有包含與P2內(nèi)側(cè)的部分序列T2同源的核苷酸序列的同源重組區(qū)VT2(其中，T1和T2的 至少一方具有靶基因所特有的核苷酸序列)，該同源重組方法包括使上述PCR產(chǎn)物參與同源重組反應(yīng)，以將其插入上述載體 中，從而得到在載體中特異性地插入有目標(biāo)PCR產(chǎn)物的重組DNA分子。[常規(guī)的同源重組方法、

圖1]如圖1所示，常規(guī)的同源重組方法(ET重組反應(yīng))是指，使用PCR產(chǎn)物[靶DNA片 段(1)和非靶DNA片段(2)]和載體(II)，通過同源重組將上述PCR產(chǎn)物插入上述載體中， 所述PCR產(chǎn)物的兩末端具有擴(kuò)增用引物序列P1和P2;所述載體(II)位于該P(yáng)CR產(chǎn)物的末 端或末端附近，具有包含一部分或全部擴(kuò)增用引物序列的同源重組區(qū)VP1和VP2。此時(shí)，在DNA片段的引物序列P1和P2與線性化載體的引物同源序列VP 1和VP2 之間發(fā)生重組。因此，當(dāng)靶DNA片段(1)與非靶DNA片段(2)混在一起時(shí)，只要不具備DNA 片段的長度極不相同等特別條件，兩者就以相同的概率插入載體中。如圖1所示，靶DNA片 段(1)與非靶DNA片段(2)以相同的概率插入載體(II)中。因此，在常規(guī)的同源重組方法的情況下，當(dāng)靶DNA片段(1)與非靶DNA片段⑵混 在一起時(shí)，應(yīng)預(yù)先純化靶DNA片段(1)(除去非靶DNA片段(2))，之后再參與同源重組反應(yīng)。[內(nèi)部序列依賴性同源重組反應(yīng)、圖2]相對(duì)于此，在本發(fā)明中，線性化載體的同源重組區(qū)包含擴(kuò)增用引物序列(位于PCR 產(chǎn)物的至少一方的末端或末端附近)P1 (和P2)、以及與存在于靶DNA片段的擴(kuò)增用引物序 列內(nèi)側(cè)的序列T1 (和T2)同源的核苷酸序列VP1+VT1 (和VP2+VT2)。而且，位于PCR產(chǎn)物 的一方末端的擴(kuò)增用引物序列的內(nèi)側(cè)序列T1 (和T2)為來自模板的序列。載體的同源重組 區(qū)中，有一部分來自擴(kuò)增用引物序列P1 (和P2)，剩余部分來自靶基因序列的一部分T1 (和 T2)。由此，雖然兩端具有擴(kuò)增用引物序列但其內(nèi)側(cè)包含靶基因以外的序列的PCR產(chǎn)物，其 擴(kuò)增用引物序列部分是共通的，但靶基因的序列部分不同，所以不能作為同源重組區(qū)識(shí)別， 不發(fā)生同源重組。因此，可以將包含目標(biāo)靶基因序列的PCR產(chǎn)物特異性地同源重組到載體 中。本發(fā)明的方法還可稱作內(nèi)部序列依賴性同源重組反應(yīng)方法。
如圖2所示，靶DNA片段(1)在兩方的末端具有一部分來自擴(kuò)增用引物序列、剩余 部分來自靶基因序列的一部分的同源重組區(qū)P1+T1和P2+T2。線性化載體(I)所具有的同 源重組區(qū)VP1+VT1和VP2+VT2，也是其中一部分相當(dāng)于來自擴(kuò)增用引物序列的序列、剩余部 分相當(dāng)于來自靶基因序列的一部分的序列。這種情況下(利用ET重組反應(yīng)的內(nèi)部序列依 賴性同源重組反應(yīng))，發(fā)生來自DNA片段的引物互補(bǔ)鏈的序列的重組和載體的內(nèi)部序列(來 自靶基因序列的一部分的序列)的重組?；诶脙?nèi)部序列的載體的重組反應(yīng)僅發(fā)生同源 重組區(qū)中具有內(nèi)部序列的、靶DNA片段(1)的特異性重組(途徑B)，不發(fā)生同源重組區(qū)中不 具有內(nèi)部序列T1和T2的、非靶DNA片段(2)的重組(途徑D，與內(nèi)部序列不具有同源性)。 但在發(fā)生基于DNA片段的引物序列P1和P2的互補(bǔ)鏈的重組時(shí)(途徑A和C)，靶DNA片段 (1)和非靶DNA片段(2)被一同插入載體中。其結(jié)果，當(dāng)靶DNA片段(1)和非靶DNA片段 ⑵混在一起時(shí)，靶DNA片段(1)的情形存在途徑A和B;相對(duì)于此，非靶DNA片段⑵的情 形僅存在途徑C，前者被優(yōu)先導(dǎo)入載體中。但是，當(dāng)位于PCR產(chǎn)物末端的擴(kuò)增用引物序列的內(nèi)側(cè)序列(內(nèi)部序列)T1和T2的 至少一方為來自模板的序列、即模板特有(固有)的序列時(shí)，得到提高上述靶DNA片段的同 源重組的選擇性(特異性)的效果，包含靶基因序列的PCR產(chǎn)物同源重組到載體中的特異 性大幅提高。剩余一方的內(nèi)部序列可以不是模板特有(固有)的序列。但是，當(dāng)T1和T2 兩方均為模板特有(固有)的序列時(shí)，提高靶DNA片段的同源重組選擇性的效果好，因此優(yōu) 選。[基于S化-寡引物的內(nèi)部序列依賴性同源重組反應(yīng)、圖3]若將以普通的寡DNA作為引物擴(kuò)增的DNA片段和線性化載體一同導(dǎo)入大腸桿菌中 進(jìn)行ET重組反應(yīng)，則該DNA片段在菌體內(nèi)接受5’ 一3’核酸外切酶的消化。其結(jié)果，形成 DNA片段的3’端突出的結(jié)構(gòu)。該3’突出端來自PCR中使用的引物序列。同樣，線性化載體 也接受5’ 一 3’核酸外切酶的消化，其結(jié)果，形成載體的3’端突出的結(jié)構(gòu)(圖2中左起第 2種狀態(tài))。載體的3’突出端來自內(nèi)部序列。線性化載體的3’突出端與DNA片段的同源區(qū)進(jìn)行重組反應(yīng)時(shí)(途徑B和D)，利 用的是內(nèi)部序列，所以只有靶DNA被插入載體中(圖2的途徑B)。不具有內(nèi)部序列的非靶 DNA在該途徑中未發(fā)生同源重組，沒有被插入載體中(圖2的途徑D)。DNA片段的3’突出 端與載體的同源區(qū)進(jìn)行重組反應(yīng)時(shí)(途徑A和C)，由于利用的是引物序列，所以有時(shí)不僅靶 DNA片段(圖2的途徑A)、就連非靶DNA片段(圖2的途徑C)也被插入載體中，這種情形 如上所述。構(gòu)成DNA的核苷酸分子以經(jīng)由磷酸的磷酸二酯鍵連接，細(xì)胞內(nèi)的DNA分解酶具有 切斷磷酸二酯鍵的活性。但磷酸二酯被S化(硫代磷酸酯化)的DNA或2’ 4’ -BNA化(橋 聯(lián)核酸(Bridged Nucleic Acid)化)的DNA對(duì)DNA分解酶顯示出耐性。在本發(fā)明中，將這 些對(duì)DNA分解酶顯示出耐性的寡引物稱作核酸酶耐性寡引物。核酸酶耐性寡引物的代表 例有S化(硫代磷酸酯化)寡引物，但核酸酶耐性寡引物并不限于S化寡引物。以S化寡 DNA(SP1、SP2)為引物，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增的S化DNA片段在其5’側(cè)具有S化的序列，所以 特別不易接受5’ 一3’核酸外切酶的消化。因此，若將該DNA片段與載體一同導(dǎo)入大腸桿 菌中進(jìn)行ET重組反應(yīng)，則S化DNA片段的5’側(cè)被S化，所以不會(huì)接受5’ 一 3’核酸外切酶 的消化(圖3中左起第2種狀態(tài))。其結(jié)果，無法形成來自引物的互補(bǔ)序列的3’突出端，不會(huì)發(fā)生S化DNA片段與載體的同源重組(途徑A、C，未發(fā)生重組)。另一方面，線性化載 體接受5’ 一3’核酸外切酶的消化，所以形成載體的3’端突出的結(jié)構(gòu)。該3’突出端來自 內(nèi)部序列，所以只有與本區(qū)具有同源性的靶S化DNA片段成為同源重組反應(yīng)的底物(途徑 B)。這樣，由于DNA片段的5，側(cè)來自S化-寡DNA，所以對(duì)5，一 3，核酸外切酶消化具 有耐性。因此，DNA片段與載體側(cè)的同源重組反應(yīng)被抑制。另一方面，線性化載體的5’端 被5’ 一 3’核酸外切酶消化，形成單鏈的3’端的內(nèi)部序列可以只與靶DNA片段進(jìn)行同源重 組反應(yīng)。其結(jié)果，即使靶DNA為非靶DNA的五分之一的量，也可以只將靶DNA片段選擇性地 導(dǎo)入載體中。通過使用以S化-寡DNA(SP1、SP2)為引物得到的PCR產(chǎn)物作為同源重組用的DNA 片段，僅圖3的B成為同源重組反應(yīng)途徑。相對(duì)于此，將使用通常的引物得到的PCR產(chǎn)物用 作同源重組用的DNA片段時(shí)，圖2的A、B、C成為同源重組反應(yīng)途徑。其中，途徑C是插入有 非靶DNA片段的反應(yīng)途徑。本反應(yīng)中使用的寡引物，只要其5’側(cè)為至少一個(gè)核苷酸以上、 且對(duì)DNA分解酶具有耐性即可，對(duì)其種類沒有特別限定。還可以是5’側(cè)被2’ 4’ -BNA化的 寡引物。[同源重組反應(yīng)]本發(fā)明的同源重組反應(yīng)，除采用ET重組法[Red(Reda/0)或RecE/T體系]以外， 還可以采用In-Fusion法。ET重組法是在菌體內(nèi)進(jìn)行的同源重組反應(yīng)，其利用由RecE或Red a的5’一 3’核 酸外切酶消化形成的3’突出端(參照非專利文獻(xiàn)1、專利文獻(xiàn)1)。利用RecE或Reda均 可實(shí)施本發(fā)明。同源重組反應(yīng)本身可以利用常規(guī)方法來實(shí)施。In-Fusion法是在試管內(nèi)進(jìn)行的同源重組反應(yīng)，其利用通過痘苗病毒DNA聚合酶 的3’ 一 5’核酸外切酶消化形成的5’突出端。該反應(yīng)中，在DNA片段端與直鏈狀載體端之 間必需存在約15bp左右的同源區(qū)。痘苗病毒DNA聚合酶的3’ —5’核酸外切酶消化進(jìn)行 到消化內(nèi)部序列的階段時(shí)，靶DNA片段被插入載體中。In-Fusion法的原理在以下論文中加以說明，實(shí)施時(shí)可以直接使用夕力，4才 /Clontech社出售的同源重組試劑。Nucleic Acids Research，2007，第 35 卷，No. 1143-151Michael 等人Duplex strand joining reactions catalyzed by vaccinia virus DNA polymerase使用In-Fusion法的常規(guī)的同源重組反應(yīng)如圖4的B圖所示。痘苗病毒DNA聚合 酶消化DNA片段和載體的3’端。由此，在DNA片段與線性化載體之間出現(xiàn)互補(bǔ)區(qū)。該互補(bǔ) 鏈區(qū)相互退火，從而將DNA片段插入載體中。相對(duì)于此，本發(fā)明的同源重組反應(yīng)如圖4的A圖所示。當(dāng)痘苗病毒DNA聚合酶的 3’ 一5’核酸外切酶消化進(jìn)行到消化內(nèi)部序列的階段時(shí)，在靶DNA片段(1)與線性化載體 ⑴之間出現(xiàn)互補(bǔ)鏈區(qū)。其結(jié)果，發(fā)生重組反應(yīng)。相對(duì)于此，在非靶DNA片段⑵中，經(jīng)由引 物序列與載體形成互補(bǔ)鏈區(qū)，由于存在與非靶DNA片段(2)不具有同源性的載體的內(nèi)部序 列，所以沒有發(fā)生重組反應(yīng)。
[靶基因]對(duì)本發(fā)明的方法中使用的靶基因沒有特別限定。靶基因例如可以是抗體基因，而 位于包含抗體基因的PCR產(chǎn)物的一方末端的擴(kuò)增用引物序列的內(nèi)側(cè)序列可以是來自抗體 基因的恒定區(qū)的序列。靶基因中，除抗體基因以外，T細(xì)胞受體基因、剪接變體等引物區(qū)和 與其相鄰的內(nèi)側(cè)序列是一定的，但也可以是內(nèi)部具有可變部位的DNA。PCR產(chǎn)物通過2次PCR來制備，在第1次PCR中，可以使用包含T1序列的擴(kuò)增用 引物和包含P3序列的擴(kuò)增用引物來實(shí)施(其中，P3序列與上述載體所具有的同源重組區(qū) VT1、VP1、VT2和VP2不具有同源性)；在第2次PCR中，可以使用包含P1序列的擴(kuò)增用引 物和包含P2序列的擴(kuò)增用引物來實(shí)施。各序列的位置關(guān)系如圖5所示。上述P3序列不直 接參與同源重組，其被用作進(jìn)行嵌套式PCR時(shí)的第1次使用的引物。包含P1序列的擴(kuò)增用 引物的3’端側(cè)區(qū)與包含T1序列的擴(kuò)增用引物的5’端側(cè)區(qū)具有部分重復(fù)的序列；包含P2 序列的擴(kuò)增用引物與包含P3序列的擴(kuò)增用引物可以具有、也可以不具有部分重復(fù)的序列。以下，以免疫球蛋白基因恒定區(qū)作為靶基因序列的情形為例，根據(jù)圖6進(jìn)行以下 說明。圖6所示的引物B (的一部分)相當(dāng)于圖2和圖5的引物T1，引物D和C相當(dāng)于圖2 和圖5的序列P1和P2。圖6所示的引物A相當(dāng)于引物P3。(l)PCR 產(chǎn)物參照使用磁珠的cDNA合成法的圖6 (免疫球蛋白可變區(qū)擴(kuò)增法)。模板中使用3’端添加有poly dG的免疫球蛋白cDNA(在磁珠上合成)、引物A(免 疫球蛋白基因恒定區(qū))和B(用于與poly dG結(jié)合)，進(jìn)行第1次PCR。第1次PCR結(jié)束后，將其例如稀釋至100倍左右，以所得稀釋物作為第2次PCR的 模板。使用的引物為D和C。D設(shè)計(jì)成3’側(cè)的序列與第1次PCR中使用的引物B的5’側(cè)重 疊，使D的3’端側(cè)區(qū)與該區(qū)結(jié)合。引物C位子恒定區(qū)，設(shè)計(jì)成位于第1次PCR中使用的引物 A的內(nèi)側(cè)。其中，引物C可以具有一部分與引物A重疊的序列，也可以具有與引物A不重疊的 序列。在第1次PCR中，當(dāng)包含免疫球蛋白的恒定區(qū)的DNA片段被擴(kuò)增時(shí)，通過使用引物C 和D，可以進(jìn)一步擴(kuò)增包含免疫球蛋白的恒定區(qū)的DNA片段。這是被稱作5，RACE-PCR(rapid amplification of cDNAend，cDNAend 的快速擴(kuò)增)的 PCR 法之一。弓丨物D+B序列是通過2次PCR反應(yīng)由引物B和D合成的人工序列，不具有模板的 序列所特有(固有)的序列。該部位成為載體的同源重組用序列之一。通過第2次基因擴(kuò)增反應(yīng)，引物D特異性地與通過第1次PCR擴(kuò)增的DNA片段的 3’端側(cè)區(qū)結(jié)合(由于具有引物B的序列)、引物C與引物A的更內(nèi)側(cè)的免疫球蛋白恒定區(qū) 結(jié)合。其結(jié)果，進(jìn)行特異性擴(kuò)增。這種情況下，在PCR產(chǎn)物的單側(cè)必定存在D+B的序列。但 實(shí)際上，有時(shí)所用的引物與具有與其類似的核苷酸序列的非靶DNA結(jié)合，結(jié)果合成了非特 異性PCR產(chǎn)物。例如，引物D非特異性地與其他DNA片段結(jié)合時(shí)，在所合成的DNA片段中， 引物D的序列存在于其末端，但在其內(nèi)側(cè)不存在引物B的序列。由于具有這樣的序列的DNA 片段不具有引物D+B序列，所以不能成為內(nèi)部序列依賴性同源重組的對(duì)象(圖7、參照使用 免疫球蛋白可變區(qū)的同源重組的載體導(dǎo)入法)。因此，亦如圖5所示，引物B的不與引物D 重疊的序列發(fā)揮內(nèi)部序列的作用，使靶DNA片段的同源重組的選擇性提高。另外，如果引物C與具有與其類似的核苷酸序列的非靶DNA結(jié)合，進(jìn)行DNA擴(kuò)增 時(shí)，該DNA片段中不存在相當(dāng)于圖7所示的+a的恒定區(qū)的序列。相當(dāng)于—a的序列是作為靶DNA的免疫球蛋白鏈特有(固有)的序列。因此，不具有—a作為同源區(qū)的DNA片段 不能成為同源重組的對(duì)象，不能插入載體中(圖7、參照使用免疫球蛋白可變區(qū)的同源重組 的載體導(dǎo)入法)。只有當(dāng)引物C特異性地與作為靶基因的免疫球蛋白基因的恒定區(qū)結(jié)合來 擴(kuò)增DNA時(shí)，引物C+a的序列才出現(xiàn)在DNA片段的末端。該序列成為與載體同源重組的對(duì) 象(圖7)。本發(fā)明的方法為非特異性擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物不能被導(dǎo)入載體中，而只有特異性擴(kuò) 增的PCR產(chǎn)物被自動(dòng)地導(dǎo)入載體中的方法。在現(xiàn)有方法中，為了將目標(biāo)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物導(dǎo) 入載體中，在PCR反應(yīng)后，必需采用凝膠電泳法或離心柱法等進(jìn)行特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的分離 純化操作。而且，還必需進(jìn)行所得質(zhì)粒的基因序列分析，花費(fèi)時(shí)間和成本。如上所述，PCR產(chǎn)物通過2次PCR來制備，在第1次PCR中，可以使用包含T1和P3 序列的擴(kuò)增用引物來實(shí)施；在第2次PCR中，可以使用包含P1和P2序列的擴(kuò)增用引物來實(shí) 施。包含P1序列的擴(kuò)增用引物和包含T1序列的擴(kuò)增用引物在5’ RACE-PCR中具有部分重 復(fù)的序列。另外，包含P2序列的擴(kuò)增用引物和包含P3序列的擴(kuò)增用引物可以具有、也可以 不具有部分重復(fù)的序列。關(guān)于各擴(kuò)增用引物序列，考慮到PCR的引發(fā)性能，例如可以是10個(gè)核苷酸以上，優(yōu) 選為14 35個(gè)核苷酸的范圍。來自引物序列P1和P2的同源重組區(qū)例如可以是10個(gè)核苷酸以上，優(yōu)選為14 35個(gè)核苷酸的范圍。作為與同源重組區(qū)的部分序列同源的核苷酸序列的擴(kuò)增用引物序列的內(nèi)側(cè)的內(nèi) 部序列T1和T2為1個(gè)核苷酸以上的范圍，優(yōu)選為5 1000個(gè)核苷酸的范圍。并且，與擴(kuò)增 用引物序列的總計(jì)P1+T1和P2+T2各自獨(dú)立可以為11個(gè)核苷酸以上的范圍，優(yōu)選為25 1000個(gè)核苷酸的范圍。[克隆方法]本發(fā)明包含靶基因的克隆方法，該方法包括利用上述本發(fā)明的方法，擴(kuò)增在載體 中特異性地插入有目標(biāo)PCR產(chǎn)物的重組DNA分子(重組載體)。重組DNA分子的擴(kuò)增可以 采用常規(guī)方法。插入到表達(dá)載體中并擴(kuò)增的重組DNA分子(重組載體)在細(xì)胞等中表達(dá)， 得到蛋白，可以進(jìn)一步用于所得蛋白的功能分析。當(dāng)目標(biāo)基因?yàn)榭贵w基因時(shí)，可以研究分離 的抗體(蛋白)是否與目標(biāo)抗原結(jié)合。另外，被擴(kuò)增的重組DNA分子(重組載體)中所含的靶基因例如通過限制酶處理 從載體中切出，根據(jù)需要進(jìn)行純化。靶基因的分離和純化可以利用常規(guī)方法來進(jìn)行。作為 靶基因的分離和純化，例如可以采用凝膠提取或柱純化等。分離和純化的靶基因例如可以 用于核苷酸序列的確定、插入表達(dá)載體中、靶基因的功能分析等。[試劑盒]本發(fā)明還涉及含有線性化載體的試劑盒，該線性化載體用于同源重組方法，所述 同源重組方法包括得到在載體中特異性地插入有PCR產(chǎn)物的重組DNA分子，所述PCR產(chǎn)物 包含兩末端具有擴(kuò)增用引物序列P1和P2的靶基因序列。該試劑盒中所含的線性化載體， 具有包含與PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增用引物序列P1和P2同源的核苷酸序列的同源區(qū)VP1和VP2， 并且，在VP1的末端側(cè)具有包含與P1內(nèi)側(cè)的部分序列T1同源的核苷酸序列的同源重組區(qū) VT1、和/或在VP2的末端側(cè)具有包含與P2內(nèi)側(cè)的部分序列T2同源的核苷酸序列的同源重組區(qū)VT2。該線性化載體與上述同源重組方法中說明的線性化載體相同。上述試劑盒中，除了包含線性化載體以外，例如還可以包含試劑盒的使用說明書 和用于同源重組反應(yīng)的試劑等。作為用于同源重組反應(yīng)的試劑等，例如有Red(Reda/3) 或RecE/T體系用的試劑等、In-Fusion法用的試劑等。使用本發(fā)明的試劑盒可以實(shí)施的同源重組方法，例如是上述本發(fā)明的同源重組方 法，但對(duì)用于除此以外的方法則沒有限制。并且，使用本發(fā)明的試劑盒得到的重組DNA分子可以用于靶基因的克隆方法，所 述克隆方法包括擴(kuò)增具有該重組DNA分子的重組體。實(shí)施例以下，利用實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。實(shí)施例1靶DNA片段與非靶DNA片段混在一起時(shí)，內(nèi)部序列依賴性同源重組法的優(yōu)點(diǎn)如以 下實(shí)驗(yàn)1 4所示。[實(shí)驗(yàn)材料概略]使用引物(a)和(b)，利用PCR法擴(kuò)增2種DNA片段⑴和⑵。
權(quán)利要求
1.同源重組方法，該方法使用PCR產(chǎn)物和線性化載體，所述PCR產(chǎn)物包含兩末端具有擴(kuò) 增用引物序列P1和P2的靶基因序列；所述線性化載體具有包含與該P(yáng)CR產(chǎn)物的擴(kuò)增用引 物序列P1和P2同源的核苷酸序列的同源重組區(qū)VP1和VP2，并且，在VP1的末端側(cè)具有包 含與P1內(nèi)側(cè)的部分序列T1同源的核苷酸序列的同源重組區(qū)VT1、和/或在VP2的末端側(cè)具 有包含與P2內(nèi)側(cè)的部分序列T2同源的核苷酸序列的同源重組區(qū)VT2，其中T1和T2的至少 一方具有靶基因所特有的核苷酸序列，該方法包括使上述PCR產(chǎn)物參與同源重組反應(yīng)，以將其插入上述載體中，由此得到在 載體中特異性地插入有目標(biāo)PCR產(chǎn)物的重組DNA分子。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中T1和T2的兩方具有靶基因所特有的核苷酸序列。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中擴(kuò)增用引物序列P1和P2的一方或兩方具有靶基 因所特有的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的方法，其中PCR產(chǎn)物通過2次PCR來制備，在第1次 PCR中，使用包含T1序列的擴(kuò)增用引物和包含P3序列的擴(kuò)增用引物來實(shí)施，其中P3序列與 上述載體所具有的同源重組區(qū)VT1、VP1、VT2和VP2不具有同源性；在第2次PCR中，使用 包含P1序列的擴(kuò)增用弓I物和包含P2序列的擴(kuò)增用弓|物來實(shí)施。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中包含P1序列的擴(kuò)增用引物的3’端側(cè)區(qū)和包含T1序 列的擴(kuò)增用引物的5’端側(cè)區(qū)具有部分重復(fù)的序列，而包含P2序列的擴(kuò)增用引物和包含P3 序列的擴(kuò)增用弓I物具有或不具有部分重復(fù)的序列。
6.權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的方法，其中擴(kuò)增用引物序列P1和P2分別為10個(gè)核 苷酸以上。
7.權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的方法，其中載體的同源重組區(qū)VP1+VT1和VP2+VT2 分別為11個(gè)核苷酸以上。
8.權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)所述的方法，其中擴(kuò)增用引物序列P1和P2的一方或兩方 來自核酸酶耐性寡引物。
9.權(quán)利要求1 8中任一項(xiàng)所述的方法，其中上述靶基因?yàn)榭贵w基因或T細(xì)胞受體基 因，該靶基因包含來自上述抗體基因或T細(xì)胞受體基因的恒定區(qū)的序列和來自可變區(qū)的序 列，上述載體的同源重組區(qū)VP1+VT1和VP2+VT2的一方為來自抗體基因或T細(xì)胞受體基因 的恒定區(qū)的序列。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中上述載體的同源重組區(qū)VP1+VT1和VP2+VT2的另一方 不具有來自抗體基因和T細(xì)胞受體基因的核苷酸序列。
11.權(quán)利要求1 10中任一項(xiàng)所述的方法，其中上述同源重組反應(yīng)是使用Red即 Red a / ^或RecE/T體系在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。
12.權(quán)利要求1 10中任一項(xiàng)所述的方法，其中上述同源重組反應(yīng)通過In-Fusion法 來進(jìn)行。
13.靶基因的克隆方法，該方法包括利用權(quán)利要求1 12中任一項(xiàng)所述的同源重組 方法，制備在載體中特異性地插入有目標(biāo)PCR產(chǎn)物的重組DNA分子，之后擴(kuò)增具有所得重組 DNA分子的重組體。
14.試劑盒，其中含有線性化載體，該線性化載體用于同源重組方法，所述同源重組方 法包括得到在載體中特異性地插入有PCR產(chǎn)物的重組DNA分子，所述PCR產(chǎn)物含有在兩末端具有擴(kuò)增用引物序列P1和P2的靶基因序列，上述線性化載體具有包含與PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增用引物序列P1和P2同源的核苷酸序列的 同源區(qū)VP1和VP2，并且，在VP1的末端側(cè)具有包含與P1內(nèi)側(cè)的部分序列T1同源的核苷酸 序列的同源重組區(qū)VT1、和/或在VP2的末端側(cè)具有包含與P2內(nèi)側(cè)的部分序列T2同源的核 苷酸序列的同源重組區(qū)VT2。
15.權(quán)利要求14所述的試劑盒，其中上述同源重組方法為權(quán)利要求1 12中任一項(xiàng)所 述的方法。
16.權(quán)利要求14或15所述的試劑盒，其中上述重組DNA分子用于靶基因的克隆方法， 所述靶基因的克隆方法包括擴(kuò)增具有該重組DNA分子的重組體。
全文摘要
本發(fā)明提供可以選擇性地同源重組目標(biāo)基因的方法、以及利用該方法得到的重組DNA分子。同源重組方法，該方法使用PCR產(chǎn)物和線性化載體，所述PCR產(chǎn)物包含兩末端具有擴(kuò)增用引物序列P1和P2的靶基因序列；所述線性化載體具有包含與該P(yáng)CR產(chǎn)物的擴(kuò)增用引物序列P1和P2同源的核苷酸序列的同源重組區(qū)VP1和VP2，在VP1的末端側(cè)具有包含與P1內(nèi)側(cè)的部分序列T1同源的核苷酸序列的同源重組區(qū)VT1、和/或在VP2的末端側(cè)具有包含與P2內(nèi)側(cè)的部分序列T2同源的核苷酸序列的同源重組區(qū)VT2(T1和T2的至少一方具有靶基因所特有的核苷酸序列)，該方法包括使上述PCR產(chǎn)物參與同源重組反應(yīng)，以將其插入上述載體中，由此得到在載體中特異性地插入有目標(biāo)PCR產(chǎn)物的重組DNA分子?？寺》椒?，該方法利用上述同源重組方法，制備在載體中特異性地插入有目標(biāo)PCR產(chǎn)物的重組DNA分子，之后擴(kuò)增所得的重組DNA分子。
文檔編號(hào)C12N15/09GK102007212SQ20098010882
公開日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2009年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月7日
發(fā)明者磯部正治, 黑澤信幸 申請(qǐng)人:國立大學(xué)法人富山大學(xué)