本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種用于定量檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞中K-ras基因表達(dá)量的引物、標(biāo)準(zhǔn)品及制備方法。
背景技術(shù)：
：K-ras基因名為Kirsten鼠肉瘤基因，是Ras基因家族中一員，人們發(fā)現(xiàn)ras基因家族主要是由K-ras、H-ras和N-ras三種類型構(gòu)成，均含有1個(gè)5’非編碼外顯子和4個(gè)編碼外顯子，編碼產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量為2.1萬(wàn)，故稱為p21蛋白(ras蛋白)，都分布在細(xì)胞膜上和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化增殖。Ras基因最初是由Ellis等通過(guò)轉(zhuǎn)化性逆轉(zhuǎn)錄病毒實(shí)驗(yàn)從兩株不同的大鼠病毒中克隆得來(lái)的。之后通過(guò)研究，Ras基因中的K-ras、H-ras、N-ras逐漸從各種不同的腫瘤中被發(fā)現(xiàn)。而在大量研究中我們發(fā)現(xiàn)K-ras基因與多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著密切的聯(lián)系，包括K-ras基因激活后，可導(dǎo)致細(xì)胞的增殖異?；蚴橇夹阅[瘤向惡性轉(zhuǎn)化，其蛋白在惡性腫瘤中表達(dá)高于該部位正常組織及良性腫瘤等，這些都與K-ras基因表達(dá)水平的變化息息相關(guān)。近年來(lái)，不論是對(duì)腫瘤患病基質(zhì)的研究、腫瘤標(biāo)志性基因的研究，還是再生醫(yī)學(xué)中干細(xì)胞的致瘤性研究以及干細(xì)胞的應(yīng)用安全性的研究中，都涉及到致癌基因表達(dá)水平的研究，所以對(duì)K-ras基因表達(dá)水平的監(jiān)測(cè)就變得尤為重要了。隨著科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，對(duì)于基因表達(dá)水平檢測(cè)的要求和標(biāo)準(zhǔn)也越來(lái)越高，常規(guī)技術(shù)很難滿足研究的要求，Elisa檢測(cè)需要1-2天且存在重復(fù)性問(wèn)題，而傳統(tǒng)PCR需要耗時(shí)7-8個(gè)小時(shí)，其結(jié)果由于酶體系的影響而產(chǎn)生的波動(dòng)在呈指數(shù)增長(zhǎng)的PCR中會(huì)被轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物量間很大的差異，而Northern印跡法由于耗時(shí)較長(zhǎng)，檢測(cè)效率低，無(wú)法檢出微小的基因表達(dá)變化。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，本發(fā)明提供一種用于定量檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞中K-ras基因表達(dá)量的引物、標(biāo)準(zhǔn)品及制備方法，可有效解決現(xiàn)有技術(shù)中的檢測(cè)效率不高、靈敏度較低、準(zhǔn)確性不好的問(wèn)題。一種用于定量檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞中K-ras基因表達(dá)量的引物，包括以下序列：上游引物：5'-TTGATTTGTCAGCAGGACCA-3'；下游引物：5'-GAGAGTTTCACAGCATGGACTG-3'；一種用于定量檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞中K-ras基因表達(dá)量的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法，包括以下步驟：(1)處理提取間充質(zhì)干細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；(2)以步驟(1)所得cDNA為模板，采用權(quán)利要求1所述的引物擴(kuò)增K-ras基因特異片段；(3)回收純化擴(kuò)增片段，克隆培養(yǎng)，得到質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。進(jìn)一步地，步驟(1)中反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為T(mén)otalRNA0.1ng～5μg、Oilgo(dT)1μl、5×ReactionBuffer4μl、RiboLockRNaseinhibitor(20U/μl)1μl、10mMdNTPMIX2μl、RevertAidM-MilVRT(200U/μl)1μl、nuclease-freeWater補(bǔ)足20μl。進(jìn)一步地，步驟(1)中反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為42℃，60min，70℃，5min。進(jìn)一步地，步驟(2)中擴(kuò)增體系為PrimeSTARMaxPremix25μl、PrimerF3μl、PrimerR3μl、cDNA100～150ng、nuclease-freeWater補(bǔ)足20μl。進(jìn)一步地，步驟(2)中擴(kuò)增反應(yīng)條件為階段1：95℃，2min:；階段2：95℃，30s；階段3：60℃，15s；階段4：72℃，15s；階段5：返回到階段2，循環(huán)29次；階段6：72℃，5min。上述制備方法制備得到的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。上述質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品在定量檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞中K-ras基因表達(dá)量的應(yīng)用。進(jìn)一步地，采用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品定量檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞中K-ras基因表達(dá)量的方法為：(1)測(cè)量質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度，并根據(jù)拷貝數(shù)計(jì)算公式計(jì)算其拷貝數(shù)；(2)以10倍濃度為梯度稀釋質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，采用權(quán)利要求1所述的引物對(duì)不同濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行PCR檢測(cè)，得到不同濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值，并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；(3)處理提取間充質(zhì)干細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板，采用權(quán)利要求1所述的引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，得到待測(cè)樣品的Ct值，再根據(jù)步驟(2)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得出待測(cè)樣品中K-ras基因的表達(dá)量。進(jìn)一步地，步驟(2)和步驟(3)中PCR反應(yīng)體系為20μl，包括FASTUniversal2XqPCRMasterMix10μl、PrimerF0.8μl、PrimerR0.8μl、template1μl、ROX-low0.4μl、nuclease-freeWater補(bǔ)足20μl。進(jìn)一步地，步驟(2)和步驟(3)中PCR檢測(cè)反應(yīng)條件為階段1：95℃，3min；階段2：95℃，3s；階段3：60℃，30s；階段4：返回階段2，39個(gè)循環(huán)。本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明所提供的引物及標(biāo)準(zhǔn)品，具有特異性好、準(zhǔn)確度高、靈敏度高、重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，能夠在短時(shí)間內(nèi)對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞中K-ras基因表達(dá)拷貝進(jìn)行絕對(duì)定量，不僅節(jié)約了時(shí)間，還能夠精確的監(jiān)控間充質(zhì)干細(xì)胞中K-ras基因的表達(dá)情況，為間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)志基因研究、腫瘤標(biāo)志基因的研究及再生醫(yī)學(xué)中間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用提供幫助。附圖說(shuō)明圖1為熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖2為熒光定量溶解曲線。圖3為擴(kuò)增片段電泳圖；圖4為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)序圖譜；圖5為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)序結(jié)果與K-ras基因序列比對(duì)結(jié)果；圖6為梯度稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線圖；具體實(shí)施方式下面對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行描述，以便于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員理解本發(fā)明，但應(yīng)該清楚，本發(fā)明不限于具體實(shí)施方式的范圍，對(duì)本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)講，只要各種變化在所附的權(quán)利要求限定和確定的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，這些變化是顯而易見(jiàn)的，一切利用本發(fā)明構(gòu)思的發(fā)明創(chuàng)造均在保護(hù)之列。實(shí)施例1一種用于定量檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞中K-ras基因表達(dá)量的引物，包括以下序列：根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中K-ras基因的序列信息表，設(shè)計(jì)引物；上游引物：5'-TTGATTTGTCAGCAGGACCA-3'(SEQIDNo:1)；下游引物：5'-GAGAGTTTCACAGCATGGACTG-3'(SEQIDNo:2)。一種用于定量檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞中K-ras基因表達(dá)量的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法，包括以下步驟：(1)處理提取間充質(zhì)干細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA將間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)至匯合度為70％～80％，向其中加入胰蛋白酶，再用PBS沖洗2～3次后，采用TRIzol試劑提取細(xì)胞RNA；取0.1μg～5μg總RNA，采用RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit試劑盒(購(gòu)自ThermoScientific公司，貨號(hào)K1622)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成樣品cDNA；其中，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如表1所示，反應(yīng)程序?yàn)?2℃，60min，70℃，5min。(2)標(biāo)準(zhǔn)品制備以步驟(1)中反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，對(duì)K-ras目的基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)引物特異性，其結(jié)果見(jiàn)圖3；其中，擴(kuò)增體系見(jiàn)表2，擴(kuò)增程序?yàn)殡A段1：95℃，2min:；階段2：95℃，30s；階段3：60℃，15s；階段4：72℃，15s；階段5：返回到階段2，循環(huán)29次；階段6：72℃，5min?；厥占兓鲜鰯U(kuò)增片段，并將其克隆至pGM-T載體上，冰上放置30min后，將其加入50μl的DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，于冰中放置30min，取出，42℃水浴90s，再于冰中放置2～3min，靜置，向其中加入950μl不含Amp的LB液體培養(yǎng)基，于37℃、200r/min的條件下振蕩培養(yǎng)1h，得到培養(yǎng)液。取上述培養(yǎng)液100μl涂布于含有Amp(100μg/mL)、X-Gal(20mg/mL)和IPTG(100mmol/L)的LB瓊脂固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)14～16h，再用滅菌后的接種針挑取LB瓊脂固體培養(yǎng)基中的白色單菌落，接種于3mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min搖床培養(yǎng)16～20h，得到菌種，再根據(jù)天根質(zhì)粒提取試劑盒操作說(shuō)明提取質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，同時(shí)對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行鑒定，并送華大進(jìn)行基因測(cè)序，其結(jié)果見(jiàn)圖4，比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖5；再通過(guò)BioDrop超微量核酸蛋白濃度分析儀測(cè)定其濃度。采用上述標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行K-ras基因定量檢測(cè)的方法：(一)以10倍濃度為梯度稀釋質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，得到不同濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，再通過(guò)KAPAFASTUniversal2XqPCRMasterMix試劑盒(購(gòu)自kapa公司，貨號(hào)KK4602)和上述引物在ABIViiATM7中對(duì)不同濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖6；反應(yīng)體系見(jiàn)表3，反應(yīng)程序?yàn)殡A段1：95℃，3min；階段2：95℃，3s；階段3：60℃，30s；階段4：返回階段2，39個(gè)循環(huán)，每梯度濃度設(shè)置3次重復(fù)，得到各濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值，再對(duì)利用軟件ViiATM7對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，得到如圖1所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線。(二)K-ras基因表達(dá)量檢測(cè)以步驟(1)中所得樣品cDNA為模板，采用上述引物對(duì)K-ras基因片段進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系見(jiàn)表3，反應(yīng)過(guò)程為階段1：95℃，3min；階段2：95℃，3s；階段3：60℃，30s；階段4：返回階段2，39個(gè)循環(huán)；得到樣品Ct值，再利用Ct值和步驟(一)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，即可得到待測(cè)樣品拷貝數(shù)，即K-ras基因表達(dá)量。表1反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系試劑用量TotalRNA0.1ng-5μgOilgo(dT)1μlWater，nuclease-freeUpto20μl5×ReactionBuffer4μlRiboLockRNaseinhibitor(20U/μl)1μl10mMdNTPMIX2μlRevertAidM-MulVRT(200U/μl)1μlTotalvolume20μl表2PCR擴(kuò)增體系試劑用量PrimeSTARMaxPremix25μlPrimerF3μlPrimerR3μlcDNAnμl(100-150ng)Water，nuclease-freeUpto20μlTotalvolume20μl表3PCR反應(yīng)體系實(shí)驗(yàn)例絕對(duì)定量K-ras基因表達(dá)量的重復(fù)性和準(zhǔn)確度驗(yàn)證。(1)設(shè)置陰性對(duì)照，同時(shí)按照上述步驟(2)的方法制備完全相同的質(zhì)粒，經(jīng)BioDrop超微量核酸蛋白濃度分析儀測(cè)定其濃度為70.06ng/μl，然后再以10倍濃度為梯度進(jìn)行稀釋，根據(jù)拷貝數(shù)公式：拷貝數(shù)(cospies/uL)＝6.02×1023(cospies/mol)×質(zhì)粒濃度(g/uL)/質(zhì)粒分子質(zhì)量(g/mol)，得到5份質(zhì)粒樣品的理想拷貝數(shù)，分別為：2.20063×108、2.20063×107、2.20063×106、2.20063×105。(2)在根據(jù)上述步驟(二)中得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)陰性對(duì)照、5份質(zhì)粒樣品中K-ras基因拷貝數(shù)進(jìn)行計(jì)算，其結(jié)果見(jiàn)表4。表4對(duì)比結(jié)果由表4可以看出，樣本在五個(gè)稀釋倍數(shù)下檢測(cè)得到的目的基因拷貝數(shù)與理想拷貝數(shù)結(jié)果相符，無(wú)顯著差異，證明本發(fā)明能夠準(zhǔn)確定量目的基因拷貝數(shù)，且重復(fù)性很好。表5標(biāo)準(zhǔn)曲線具體參數(shù)Slop-3.385Y-znter39.612R20.999Eff％97.445Error0.038圖1為本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，其具體參數(shù)見(jiàn)表5，根據(jù)表5可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)性為99.9％，擴(kuò)增效率接近1，斜率在-3.3，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線直線性非常好，定量也非常準(zhǔn)確。而在對(duì)樣本進(jìn)行獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也可以看出定量結(jié)果差異非常小，證明本方法的準(zhǔn)確性和靈敏度都很好。圖2為本方法的熒光定量溶解曲線圖，表明引物及方法均具有良好的特異性，也具有很好的重復(fù)性。如圖3所示，PCR產(chǎn)物為143bp單一條帶，表明設(shè)計(jì)的引物具有良好的特異性。SEQUENCELISTING<110>成都中創(chuàng)清科醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司<120>用于定量檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞中K-ras基因表達(dá)量的引物、標(biāo)準(zhǔn)品及制備方法<130>2017<160>2<170>PatentInversion3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1ttgatttgtcagcaggacca20<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2gagagtttcacagcatggactg22當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3