本發(fā)明屬于微生物篩選技術領域，具體涉及一種食源性致病菌沙門氏菌的檢測方法。

背景技術：

沙門氏菌屬(Salmonella)分類屬細菌界(Bacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、腸桿菌目(Bacillales)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，是一種重要的腸道致病菌，已發(fā)現(xiàn)有近一千種(或菌株)。感染沙門氏菌，可引起人類的傷寒、腸熱癥、感染性腹瀉、敗血癥和胃腸炎等疾病，并引起動物發(fā)生沙門氏菌病，是常見的人畜共患型致病菌。蛋、家禽、肉類、水產品是沙門氏菌病的主要傳播媒介。據(jù)相關數(shù)據(jù)表明，我國每年因沙門氏菌而導致的食物中毒事件占所有食物中毒事件的70％～80％，居細菌性食物中毒的首位，世界衛(wèi)生組織(WHO)已將沙門氏菌列入具有嚴重危害和中等危害的食物傳播性病原菌。

傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測是以培養(yǎng)法為基礎的微生物學方法，普遍用于食品和藥品中沙門氏菌的檢驗，也是沙門氏菌檢驗的法定仲裁方法。由于沙門氏菌的血清型過于繁多，食品安全國家標準方法需要經過前增菌、選擇性增菌、分離培養(yǎng)、生化鑒定及血清學分型鑒定等5個步驟，工作量大，檢測周期長，且受到檢測人員的專業(yè)、經驗等多種因素限制，容易出現(xiàn)誤判。因此，如何提供一種便捷快速的檢測沙門氏菌的方法一直是研究的熱點之一。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種食源性致病菌沙門氏菌的檢測方法，以實現(xiàn)對沙門氏菌進行安全、特異、快速、靈敏、簡單的現(xiàn)場快速檢測，從而彌補現(xiàn)有技術的不足。

本發(fā)明首先提供一種用于檢測食源性致病菌沙門氏菌的重組酶聚合酶擴增引物對和探針，其中引物對的序列信息如下：

正向引物F-RPA:5′-

GGCGATAGCCTGGCGGTGGGTTTTGTTGTCTT-3′(SEQ ID NO:1)

反向引物R-RPA:ACTTCATCGCACCGTCAAAGGAACCGTAAA-3′(SEQ ID NO:2)；

其中反向引物的5′端進行生物素Biotin標記；

探針的序列信息如下：

RPA-P2:5′-

TTGTTGTCTTCTCTATTGTCACCGTGGTCCGTTTATCGTT-3′(SEQ ID NO:2)；

其中探針的5′端進行羧基熒光素FAM標記，3′端進行C3-Spacer標記；且第30位的C用四氫呋喃替代；

上述的引物組和探針用于非疾病診斷或治療領域的食源性致病菌沙門氏菌的檢測；

上述的非疾病診斷或治療領域的食源性致病菌沙門氏菌的檢測，是指對水產品中食源性致病菌沙門氏菌的檢測；

本發(fā)明再一個方面提供檢測水產品中食源性致病菌沙門氏菌的方法，包括如下的步驟：

1)配制RPA反應體系：

各引物的終濃度為：引物F-RPA和引物R-RPA各420nmol/μL；探針P 120nmol/μL；緩沖液組成及濃度為：Tris-HCl 50mmol/μL、KAc 100mmol/μL,DTT 2mmol/μL，5％PEG 20mol/μL，dNTPs200μmol/μL,ATP 3mmol/μL，磷酸肌酸激酶)50mmol/μL，肌酸激酶)100ng/μL，DNA聚合酶Bsu 30ng/μL、單鏈綁定蛋白Gp32300ng/μL、重組酶UvsX 240ng/μL、輔助酶UvsY 60ng/μL、核酸內切酶Nfo 200ng/μL；待檢測的樣品DNA模板10ng，加雙蒸水使未反應的混合體系體積為18μL；280mmol/μL MgAc 1.0μL，使反應體系總體積為20μL；

2)RPA反應體系擴增：

無菌離心管中依次加入除醋酸鎂和模板DNA以外的所有反應組分，振蕩后離心；加入10ng模板DNA，振蕩后離心；向混合體系中加入280mmol/μL MgAc 1.0μL于無菌離心管的蓋子上，蓋上蓋子，離心；搖晃10次，離心；37℃，孵育4min；取出反應管，搖晃10次，離心；40℃，繼續(xù)孵育16min；

3)LFD檢測：取2.0μL核酸擴增產物將產物加入到98μL Buffer中混勻，然后將LFD試紙條垂直浸入混合溶液中顯色檢測，通過試紙條顯色情況判斷擴增結果。試紙條的檢測線和控制線都呈紅色，說明結果陽性；只有控制線呈現(xiàn)紅色，檢測線位置無顏色，說明結果陰性；控制線未顯色，結果無效。

本發(fā)明提供一種基于分子生物學的快速檢測食源性致病菌沙門氏菌的方法，以實現(xiàn)對沙門氏菌進行安全、特異、快速、靈敏、簡單的現(xiàn)場快速檢測，從而彌補現(xiàn)有傳統(tǒng)檢測技術的不足。并且此方法非常適用于現(xiàn)場檢測，能夠及時、有效的抑制沙門氏菌病疫情的發(fā)生，完善食品安全保障體系。

附圖說明

圖1：沙門氏菌的RPA-LFD優(yōu)化的引物和探針設計示意圖，其中引物由方框圈出，探針由斜體并加下劃線表示；

圖2：本發(fā)明方法的反應溫度的優(yōu)化結果圖；

圖3：本發(fā)明方法的反應時間的優(yōu)化結果圖；

圖4：本發(fā)明引物和探針的靈敏度的檢測結果圖；

圖5：本發(fā)明引物和探針的特異性檢測結果圖。

具體實施方式

重組酶聚合酶擴增技術(recombinase polymerase amplification，RPA)是一項由多種酶和蛋白參與、在恒定溫度條件下實現(xiàn)核酸指數(shù)擴增的新技術。通過模擬DNA體內擴增，在37～42℃的等溫條件下10min內產生目的片段，在40～60min完成數(shù)十億的DNA拷貝。橫向流動試紙條(LFD)，融合了免疫層析技術和分子生物學手段，能在紙條上形成有顏色的檢測線從而可以特異性地檢測出該目標產物。重組酶聚合酶擴增技術(RPA)與橫向流動試紙條(LFD)相互結合的技術，使RPA擴增產物現(xiàn)場檢測可視化，檢測結果明顯直觀，通過肉眼即可辨認，RPA-LFD方法安全、快捷、高效、高靈敏度且無設備及技術限制，非常適合野外現(xiàn)場檢測，能對突發(fā)狀況作出迅速、及時而準確的判斷。但是在實際應用中發(fā)現(xiàn)如果沒有有效的引物和探針組合，常會導致檢測過程中出現(xiàn)假陽性或檢測靈敏度低下的問題。

下面結合實施例對本發(fā)明進行詳細的描述。

實施例1：引物及探針設計與篩選：

根據(jù)沙門氏菌侵襲蛋白(invasion protein A,invA)編碼基因invA基因進行引物設計，通過NCBI查找到公開的invA基因序列

(U43272.1)，根據(jù)保守區(qū)域，經同源性分析后，以位于101-672的基因為目的片段進行RPA引物設計。

設計3組引物對進行最佳引物篩選，引物組及序列如下：

第1組:

正向引物F1-RPA:5′-

TTGTTGTCTTCTCTATTGTCACCGTGGTCC-3′(30bp)

反向引物R1-RPA:5′-

ACTTCATCGCACCGTCAAAGGAACCGTAAA-3′(30bp)

產物長度：231bp

第2組:

正向引物F2-RPA:5′-

TGTCTTCTCTATTGTCACCGTGGTCCAGTT-3′(30bp)

反向引物R1-RPA:5′-

ACTTCATCGCACCGTCAAAGGAACCGTAAA-3′(30bp)

產物長度：227bp

第3組:

正向引物F3-PRA:5′-

GGCGATAGCCTGGCGGTGGGTTTTGTTGTCTT-3′(32bp)

反向引物R1-RPA:5′-

ACTTCATCGCACCGTCAAAGGAACCGTAAA-3′(30bp)

產物長度：253bp

引物篩選：包括如下的步驟

1)配制RPA反應體系：

各引物的終濃度為：引物F-RPA和引物R-RPA各420nmol/μL；探針P 120nmol/μL；緩沖液組成及濃度為：Tris-HCl(pH7.9)50mmol/μL、KAc(醋酸鉀)100mmol/μL,DTT(二硫蘇糖醇)2mmol/μL，5％PEG 20mol/μL，dNTPs 200μmol/μL,ATP 3mmol/μL，pcr(磷酸肌酸激酶)50mmol/μL，CK(肌酸激酶)100ng/μL，DNA聚合酶Bsu 30ng/μL、單鏈綁定蛋白Gp32 300ng/μL、重組酶UvsX 240ng/μL、輔助酶UvsY 60ng/μL、核酸內切酶Nfo200ng/μL；樣品DNA模板10ng，加雙蒸水使未反應的混合體系(reaction mix)體積為18μL；280mmol/μL MgAc(醋酸鎂)1.0μL，使反應體系總體積為20μL。醋酸鎂能使反應迅速開始，因此需要最后加入。

2)RPA反應體系擴增：

無菌離心管中依次加入除醋酸鎂和模板DNA以外的所有反應組分，振蕩后離心；加入10ng模板DNA，振蕩后離心；向reaction mix中加入280mmol/μL MgAc(醋酸鎂)1.0μL于無菌離心管的蓋子上，蓋上蓋子，離心；搖晃10次，離心；37℃，孵育4min；取出反應管，搖晃10次，離心；40℃，繼續(xù)孵育16min。

3)LFD檢測：取2.0μL核酸擴增產物將產物加入到98μL Buffer中混勻，然后將LFD試紙條垂直浸入混合溶液中顯色檢測，通過試紙條顯色情況判斷擴增結果。試紙條的檢測線和控制線都呈紅色，說明結果陽性；只有控制線呈現(xiàn)紅色，檢測線位置無顏色，說明結果陰性；控制線未顯色，結果無效。

預實驗結果表明，相同反應條件，第3組引物的擴增效率、產物純度優(yōu)于其他2組引物，因此將第3組引物作為優(yōu)選，并對反向引物R1-RPA的5′端進行生物素Biotin標記。RPA引物的序列如下：

正向引物F-RPA:5′-

GGCGATAGCCTGGCGGTGGGTTTTGTTGTCTT-3′(30bp)

反向引物R-RPA:5′-biotin-

ACTTCATCGCACCGTCAAAGGAACCGTAAA-3′(30bp)

探針設計及篩選：

探針設計：以優(yōu)選引物組對應目的條帶區(qū)間為模板設計2條探針，在探針的合適位置插入四氫呋喃(tetrahydrofuran,THF)作為脫堿基位點類似物替代原序列中的堿基，并對探針的5′端進行羧基熒光素FAM標記，3′端進行C3-Spacer標記。修飾后探針序列如下：

RPA-P1:5′-FAM-

CCAAAGGTTCAGAACGTGTCGCGGAAGTCG[THF]GGCCCGATTTTCTCT-C3-Spacer-3′

RPA-P2:5′-FAM-

TTGTTGTCTTCTCTATTGTCACCGTGGTCC[THF]GTTTATCGTT-C3-Spacer-3′

預實驗結果表明，相同反應條件，探針RPA-P2效果優(yōu)于探針RPA-P1，因此將探針RPA-P2作為優(yōu)選。

反應溫度優(yōu)化

設置25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，進行RPA-LFD實驗，反應時間為20min，20μL反應體系，根據(jù)前述反應體系添加各組分。模板量為試劑盒提取的1.0μL沙門氏菌基因組DNA。

結果顯示，在25℃時，體系中未檢出產物擴增，而在30-45℃都檢出了產物擴增。40℃時擴增效率最高。RPA反應體系涉及比較多的酶，因此溫度過高和過低都會抑制酶活性。選擇40℃為最優(yōu)反應溫度，進行后續(xù)實驗(圖2)。

反應時間優(yōu)化

在最適合的反應溫度下，探究最佳反應時間。設置4min，8min，12min，16min，20min。反應溫度為40℃，20μL反應體系，根據(jù)前述反應體系添加各組分。模板量為試劑盒提取的1.0μL沙門氏菌基因組DNA。

結果顯示，在加入鎂離子(反應促進劑)反應開始后4min時，體系中未檢出產物擴增，此時的擴增子含量可能比較少，還未達到可檢測濃度，也可能體系中的各組分之間還在相互作用，沒有產物產生，這可能與酶反應動力學有關。反應開始后8min，LFD檢測線呈現(xiàn)微紅色，說明檢出了產物擴增，只是含量較少。當反應時間達到12min以上，擴增子的含量增加。LFD檢測線顏色表明，模板量足夠的情況下，反應時間12min已經能夠檢測到明顯的陽性擴增。說明RPA反應體系反應迅速，這點優(yōu)勢非常適用于快速檢測?？紤]到模板量低的情況，后續(xù)反應時間選擇為16min(圖3)。

實施例2引物探針的檢測靈敏度和特異性

設置5組不同濃度的沙門氏菌DNA模板(DNA濃度梯度為100、10-1、10-2、10-3、10-4、0)，進行RPA最適條件下的核酸擴增。

參照DNA提取試劑盒說明書提取的沙門氏菌DNA，將所提取的DNA模板原始濃度(511.7ng/μL)按10倍梯度稀釋成100ng/μL，10ng/μL，1ng/μL，100pg/μL，10pg/μL，1pg/μL，100fg/μL，10fg/μL，1fg/μL，分別取1μL作為反應模板。按照前述加樣方法進行核酸擴增，擴增產物LFD進行檢測：

結果顯示，本發(fā)明設計的引物和探針組合能夠保證檢測時的靈敏性，檢測靈敏度為DNA終濃度5fg/μL，相當于5CFU/mL。當模板濃度低于提取DNA濃度的10-8時，不能檢出產物的擴增(圖4)。

檢測特異性

反應時間溫度為40℃，反應時間為16min，20μL反應體系，根據(jù)前述反應體系添加各組分。Sal模板量為100ng，非特異性菌株(副溶血性弧菌VP，單增李斯特菌LM，溶藻弧菌VA，霍亂弧菌Vc，哈維氏弧菌VH，鰻弧菌Van，金黃色葡萄球菌SA)的DNA分別為各100ng。核酸擴增產物用LFD進行檢測。結果顯示，除了Sal對應實驗組的檢測線和控制線都出現(xiàn)了紅色，其他非特異性菌株的實驗組都只有控制線出現(xiàn)了顯色。結果表明，此方法可以實現(xiàn)對沙門氏菌的特異性檢測，不與其他相關致病菌發(fā)生交叉反應(圖5)。

實施例3對實際樣品的檢測應用

1.樣品采購：

水產品來自于水產品流通市場，包括海瓜子(Moerella iridescens)、蟶子(Sinonovacula constricta)、淡菜(Mytilidae)、蛤蜊(Clam)、血蚶(Sanguinolaria)(10g凈含量/份)。

2.樣品制備

2.1非冷凍樣品采集后應立即置7℃～10℃冰箱保存，盡可能及早檢驗。

2.2貝類取全部內容物，包括貝肉和體液。帶殼貝類則應先在自來水中洗刷外殼并甩干表面水分，然后以無菌操作打開外殼，按上述要求取相應部分。

2.3以無菌操作取樣品10g，加入Buffered Peptone Water培養(yǎng)基(BPW)90mL，用旋轉刀片式均質器以8 000r/min均質1min，或拍擊式均質器拍擊2min，為增菌前樣品液。

3.前增菌

用1mol/mL無菌NaOH或HCl調pH至6.8±0.2。將增菌前樣品液于36℃±1℃培養(yǎng)8h～18h。

4.選擇性增菌

取前增菌液劃線培養(yǎng)于亞硫酸鉍瓊脂(Bismuth Sulfite Agar，BS)平板上，培養(yǎng)37℃24h±2h。挑取可疑菌落，于1mL BPW，混勻，于36℃±1℃培養(yǎng)18h。

5.鑒定

5.1煮沸法提取DNA作為粗模板：菌液1mL，8000rpm，5min，棄上清，加50μL無菌水重懸，煮沸5min，12000rpm，5min，提取上清液。保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

5.2對比方法：參考行業(yè)標準《SNT 1870-2007食品中致病菌檢測方法實時PCR法》中的方法，作為對比方法。

引物序列：

F-PCR:5’-GCGGCGTTGGAGAGTGATA-3’

R-PCR:5’-AGCAATGGAAAAAGCAGGATG-3’

P-PCR:5’-CATTTCTTAAACGGCGGTGTCTTTCCCT-3’，5’標記FAM，3’標記TAMRA

此方法對沙門氏菌的檢測限為5000CFU/mL。Real-time PCR采用兩步法擴增核酸，反應程序如下：94℃，預變性10min；94℃變性3s，60℃退火/延伸40s，經40個循環(huán)。Real-time PCR通過特定的熒光信號采集進行結果鑒定。

5.3樣品檢測

a.增菌前樣品中Sal鑒定：取1mL增菌前樣品液，用煮沸法提取DNA，2μL DNA粗模板分別進行RPA-LFD鑒定和對比方法的鑒定。

b.增菌后樣品中Sal鑒定：取1mL選擇性增菌液，用煮沸法提取DNA，2μL DNA粗模板進行對比方法的進一步確認。

5.4檢測結果

5.4.1以2μL增菌前樣品的DNA粗模板分別進行RPA-LFD鑒定和real-time PCR方法的鑒定，結果顯示，采用RPA-LFD鑒定結果為四個樣品呈Sal陽性，分別是B-1，C-2，G-2，X-2，其他樣品鑒定結果為陰性。而real-time PCR鑒定結果為所有樣品都為陰性，陽性對照組(反應體系中Sal DNA含量為500ng)出現(xiàn)熒光信號。

5.4.2以2μL選擇性增菌后樣品的DNA粗模板進行real-time PCR方法的進一步鑒定，結果顯示real-time PCR鑒定Sal陽性樣品為B-1，C-2，D-1，D-2，G-2，G-3，X-1，X-2，陰性樣品為B-2，C-1，G-1。且陽性結果中，樣品B-1，C-2，G-2，X-2的Cq值都小于35，說明起始模板中的目的基因含量較高，能在短時間內完成一定量的帶標記信號的擴增子，使熒光信號強度較快達到檢測閾值。而樣品D-1，D-2，G-2，G-3，X-1的Cq值都大于35，說明起始模板中目的基因含量很低，擴增子熒光信號積累達到閾值需要的時間更長。與擴增前樣品檢測結果比較發(fā)現(xiàn)，RPA-LFD在未經微生物培養(yǎng)擴增之前就靈敏檢測出部分污染微量沙門氏菌的樣品，擴增后real-time PCR鑒定得出的陽性樣品結果證明了RPA-LFD檢測結果的可靠性。

SEQUENCE LISTING

<110> 寧波大學 寧波海洋研究院

<120> 一種食源性致病菌沙門氏菌的檢測方法

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 1

<400> 1

ggcgatagcc tggcggtggg ttttgttgtc tt 32

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 2

<400> 2

acttcatcgc accgtcaaag gaaccgtaaa 30

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 3

<400> 3

ttgttgtctt ctctattgtc accgtggtcc gtttatcgtt 40