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一種食源性致病菌沙門氏菌的檢測(cè)方法與流程

文檔序號(hào):12697817閱讀:來(lái)源:國(guó)知局

技術(shù)特征:

1.一種用于檢測(cè)食源性致病菌沙門氏菌的重組酶聚合酶擴(kuò)增引物對(duì)和探針,其中引物對(duì)的序列信息如下:

正向引物的核苷酸序列為SEQ ID NO:1,

反向引物的核苷酸序列為SEQ ID NO:2,

探針的核苷酸序列為SEQ ID NO:3。

2.如權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增引物對(duì)和探針,其特征在于,所述的反向引物的5′端進(jìn)行生物素Biotin標(biāo)記。

3.如權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增引物對(duì)和探針,其特征在于,所述的探針的5′端進(jìn)行羧基熒光素FAM標(biāo)記。

4.如權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增引物對(duì)和探針,其特征在于,所述的探針的3′端進(jìn)行C3-Spacer標(biāo)記;且第30位的C用四氫呋喃替代。

5.權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增引物對(duì)和探針在非疾病診斷或治療領(lǐng)域的食源性致病菌沙門氏菌的檢測(cè)中的應(yīng)用。

6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用,其特征在于,所述非疾病診斷或治療領(lǐng)域的食源性致病菌沙門氏菌的檢測(cè),是指對(duì)水產(chǎn)品中食源性致病菌沙門氏菌的檢測(cè)。

7.一種檢測(cè)水產(chǎn)品中食源性致病菌沙門氏菌的方法,其特征在于,所述的方法包括如下的步驟:

1)配制RPA反應(yīng)體系:

各引物的終濃度為:正向引物和反向引物各420nmol/μL;探針120nmol/μL;緩沖液組成及濃度為:Tris-HCl 50mmol/μL、KAc 100mmol/μL,DTT 2mmol/μL,5%PEG 20mol/μL,dNTPs 200μmol/μL,ATP 3mmol/μL,磷酸肌酸激酶)50mmol/μL,肌酸激酶)100ng/μL,DNA聚合酶Bsu 30ng/μL、單鏈綁定蛋白Gp32 300ng/μL、重組酶UvsX 240ng/μL、輔助酶UvsY 60ng/μL、核酸內(nèi)切酶Nfo 200ng/μL;待檢測(cè)的樣品DNA模板10ng,加雙蒸水使未反應(yīng)的混合體系體積為18μL;280mmol/μL MgAc 1.0μL,使反應(yīng)體系總體積為20μL;

所述的引物和探針為權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增引物對(duì)和探針;

2)RPA反應(yīng)體系擴(kuò)增:

無(wú)菌離心管中依次加入除醋酸鎂和模板DNA以外的所有反應(yīng)組分,振蕩后離心;加入10ng模板DNA,振蕩后離心;向混合體系中加入280mmol/μL MgAc1.0μL于無(wú)菌離心管的蓋子上,蓋上蓋子,離心;搖晃10次,離心;37℃,孵育4min;取出反應(yīng)管,搖晃10次,離心;40℃,繼續(xù)孵育16min;

3)LFD檢測(cè):取2.0μL核酸擴(kuò)增產(chǎn)物將產(chǎn)物加入到98μL Buffer中混勻,然后將LFD試紙條垂直浸入混合溶液中顯色檢測(cè),通過(guò)試紙條顯色情況判斷擴(kuò)增結(jié)果。試紙條的檢測(cè)線和控制線都呈紅色,說(shuō)明結(jié)果陽(yáng)性;只有控制線呈現(xiàn)紅色,檢測(cè)線位置無(wú)顏色,說(shuō)明結(jié)果陰性;控制線未顯色,結(jié)果無(wú)效。

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