針對現(xiàn)有技術(shù)中對香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）的檢測和鑒定主要基于病原形態(tài)學(xué)特征，程序繁瑣、耗死長、對鑒定經(jīng)驗(yàn)要求高、準(zhǔn)確度低，難以滿足香蕉葉斑病診斷的實(shí)際需要問題，提供了一種香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）分子檢測引物及其快速檢測方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：

本發(fā)明首先提供了一種香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）分子檢測引物，其核苷酸序列為：

上游引物RMSF：5’-AACCCTGCGTAACTGAGTCG-3’；

下游引物RMSR：5’-TTCAGCGGGTATCCCTACCT-3’。

所述引物RMSF和RMSR對香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）特異性擴(kuò)增出383bp的產(chǎn)物。

本發(fā)明還提供了一種香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）的快速檢測方法，包括以下步驟：

(1)從香蕉植株組織中提取DNA；

用于檢測病原菌純培養(yǎng)物時，采用 CTAB 法提取供試菌株基因組 DNA；用于檢測香蕉植株組織是否存在香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）時，采用NaOH 快速裂解法提取香蕉植株組織基因組DNA。

(2) 以提取香蕉植株組織DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶，10μmol/L的RMSF和RMSR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達(dá)25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45sec，56℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35個循環(huán)；72℃延伸10min；

(3)上步所得的PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上用0.5×TBE緩沖液電泳分析，電壓為4-5V/cm；根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定檢測結(jié)果，如果能特異性擴(kuò)增出383bp的產(chǎn)物，則可判定所述的病原物為香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）或所述的香蕉植株組織中存在香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae），否則所述的病原物非香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）或所述的香蕉植株組織中不存在香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）。

本發(fā)明的積極有益效果在于：

（1）準(zhǔn)確性高：本發(fā)明是根據(jù)真菌核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）序列在真菌種內(nèi)的高度保守性和科屬種間可變性的特點(diǎn)設(shè)計(jì)對香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）具有特異擴(kuò)增作用的PCR 引物。已經(jīng)對不同地理來源的香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）、攜帶香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）的植物組織和健康的香蕉組織進(jìn)行了檢測驗(yàn)證，只有香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）和攜帶該病菌的香蕉組織中能特異性地?cái)U(kuò)增出一條383 bp 的電泳條帶，說明本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物用于檢測香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）準(zhǔn)確可靠；

（2）特異性強(qiáng)：本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物對香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）具有很強(qiáng)的特異性，能夠用于區(qū)別香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）、長喙殼葉斑?。?i>Ceratocytis paradoxa）、炭疽?。?i>Colletotrichum musae）、暗雙孢葉斑?。?i>Cordana musae）、彎孢霉葉斑?。?i>Curvularia lunata）、黑斑?。?i>Pseudocercospora fijiensis）、黃斑?。?i>Pseudocercospora musae）等香蕉葉斑病病原菌，從而能有效區(qū)分發(fā)生在香蕉葉片上癥狀特征相似的病害；

（3）靈敏度高：本發(fā)明將設(shè)計(jì)的特異引物與ITS 基因通用引物（ITS1/ITS4）聯(lián)合起來進(jìn)行巢式PCR 擴(kuò)增后，對香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）的檢測靈敏度在DNA 水平上可達(dá)到1fg；

（4）適用性廣、實(shí)用性好：本發(fā)明的香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）的檢測方法，不僅能對病菌菌絲體進(jìn)行檢測，也能對感病的香蕉植株組織進(jìn)行檢測，可實(shí)現(xiàn)香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）的早期檢測，即在病害顯癥前進(jìn)行檢測，防治病害的爆發(fā)流行；

（5）操作簡便快速：本發(fā)明只需進(jìn)行DNA 提取、PCR 擴(kuò)增和瓊脂糖電泳后即可判定結(jié)果，一般整個檢測過程可在數(shù)小時內(nèi)完成，操作簡便快捷。

附圖說明

圖1為本發(fā)明引物對香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）特異性擴(kuò)增電泳圖：其中泳道M為2000bp DNA Marker，泳道2、泳道3為香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae），泳道4-10分別為：長喙殼葉斑病菌（Ceratocytis paradoxa）、炭疽病菌（Colletotrichum musae）、暗雙孢葉斑病菌（Cordana musae）、彎孢霉葉斑病菌（Curvularia lunata）、黑斑病菌（Pseudocercospora fijiensis）、黃斑病菌（Pseudocercospora musae）、陰性對照。

圖2為本發(fā)明引物香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）的靈敏性檢測擴(kuò)增電泳圖：A：普通PCR靈敏度檢測，其中泳道M為2000bp DNA Marker，泳道2-12分別為：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、陰性對照、陽性對照； B為巢式PCR靈敏度檢測，其中泳道M為2000bp DNA Marker，泳道2-13分別為：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、100ag、陰性對照、陽性對照；

圖3為本發(fā)明香蕉葉片發(fā)病組織和葉柄組織擴(kuò)增電泳圖，其中泳道M為2000bp DNA Marker，泳道2-10分別為自然發(fā)病的香蕉葉片組織、自然發(fā)病香蕉葉柄組織、人工接種發(fā)病的香蕉葉片組織、人工接種發(fā)病香蕉葉柄組織、健康香蕉葉片組織、健康香蕉葉柄組織、健康香蕉果皮組織、陽性對照、陰性對照。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明所述的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明。

下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。

實(shí)施例1 分子檢測引物設(shè)計(jì)及香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）特異分子檢測方法的建立

1.香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）基因組DNA的提?。?/p>

采用 CTAB 法提取本實(shí)驗(yàn)室保存的4株香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）的基因組 DNA，具體步驟如下：

(1)取0.1 g菌絲粉于1.5 mL 離心管中，加入900 μL2%CTAB提取液，使用振蕩器振蕩混勻，60℃水浴60min，室溫條件下，12000r/min離心15 min；

(2)取上清液700 μL，加等體積酚、氯仿、異戊醇混合液（各體積比為25:24:1），溫和搖動，室溫條件下，8000 r/min離心10min ；

(3)取上清液500 μL，加入等體積氯仿再抽提一次，室溫條件下，8000 r/min離心10min；

(4)取上清液350 μL，加入1/10 體積3 mol/L NaAc 和2倍體積無水乙醇，-20℃沉淀60 min，4℃條件下，8000 r/min離心5 min ；

(5)棄去上清液，加入700μL 體積濃度為70%冰乙醇，輕搖10sec，4℃條件下，8000 r/min離心10sec，晾干，加入50 μL TE緩沖液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）ITS序列測定：

以真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS） 通用引物TS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' 為引物對提取香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）的DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系和反應(yīng)程序?yàn)椋篜CR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶（Takara 大連寶生物工程有限公司），10μmol/L的TIS1和ITS4各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達(dá)25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1 min，55℃退火45sec，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃延伸10min；所得PCR產(chǎn)物送大連寶生物工程有限公司測序。

3.香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）特異分子檢測引物的設(shè)計(jì)：

根據(jù)香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）序列在真菌種間高度變異和種內(nèi)穩(wěn)定性，用Clustal X軟件將測序得到的8 株香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）的ITS 序列與GenBank 中Ramichloridium屬不同種的ITS序列、長喙殼葉斑病菌（Ceratocytis paradoxa）ITS 序列、炭疽病菌（Colletotrichum musae）ITS 序列、暗雙孢葉斑病菌（Cordana musae）ITS 序列、彎孢霉葉斑病菌（Curvularia lunata）ITS 序列、黑斑病菌（Pseudocercospora fijiensis）ITS 序列、黃斑病菌（Pseudocercospora musae）ITS 序列進(jìn)行同源性分析和差異位點(diǎn)比較，用Primer Primer5軟件設(shè)計(jì)了對香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）具有特異性擴(kuò)增作用的一對PCR引物(由上海生工生物工程有限公司合成)，即特異分子檢測引物的序列為：

上游引物RMSF：5’-AACCCTGCGTAACTGAGTCG-3’；

下游引物RMSR：5’-TTCAGCGGGTATCCCTACCT-3’

4.香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）快速分子檢測方法的建立：

(1)從香蕉植株中提取DNA:

①用于檢測病原菌純培養(yǎng)物時，采用 CTAB 法提取供試菌株基因組 DNA;

②用于檢測香蕉植株組織是否存在香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）時，采用NaOH 快速裂解法提取香蕉植株組織基因組DNA，具體步驟如下：

a.稱取待檢測的植物組織0.1 g，加入0.5 mol/L NaOH 30 μL，將組織充分磨碎成糊；

b.將糊狀組織轉(zhuǎn)入1.5 mL 離心管中，12000r/min 離心6 min，取上清液5 μl

c.上清液中加入495μL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0），混合均勻，取1.0 μL 作為PCR 模板進(jìn)行擴(kuò)增；

(2) 以提取香蕉植株DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶，10μmol/L的RMSF和RMSR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達(dá)25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45sec，56℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35個循環(huán)；72℃延伸10min；

(3)上步所得的PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上用0.5×TBE緩沖液電泳分析，電壓為4-5V/cm；根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定檢測結(jié)果，如果能特異性擴(kuò)增出383bp的產(chǎn)物，則可判定所述的病原菌為香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae），或所述的香蕉植株中存在香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae），否則所述的病原菌非香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae），或所述的香蕉植株中不存在香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）。

實(shí)施例2 香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）特異性擴(kuò)增

1.采用CTAB 法提取2株香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）、長喙殼葉斑病菌（Ceratocytis paradoxa）、炭疽病菌（Colletotrichum musae）、暗雙孢葉斑病菌（Cordana musae）、彎孢霉葉斑病菌（Curvularia lunata）、黑斑病菌（Pseudocercospora fijiensis）、黃斑病菌（Pseudocercospora musae）的基因組DNA。

2. 以提取供試菌的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶，10μmol/L的RMSF和RMSR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達(dá)25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45sec，56℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35個循環(huán)；72℃延伸10min；電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。

3.特異性擴(kuò)增結(jié)果

如圖1所示，2株香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）可以特異性擴(kuò)增出383bp的條帶，而長喙殼葉斑病菌（Ceratocytis paradoxa）、炭疽病菌（Colletotrichum musae）、暗雙孢葉斑病菌（Cordana musae）、彎孢霉葉斑病菌（Curvularia lunata）、黑斑病菌（Pseudocercospora fijiensis）、黃斑病菌（Pseudocercospora musae）和陰性對照均無擴(kuò)增條帶，表明本發(fā)明的分子檢測引物可以將香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）與其他病原菌區(qū)分開來，具有很強(qiáng)的特異性，本發(fā)明的檢測方法可用于香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）的特異性擴(kuò)增。

實(shí)施例3本發(fā)明引物對香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）的靈敏性檢測

1.采用CTAB 法提取香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）的基因組DNA；

2.將提取的香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）的基因組DNA，經(jīng)分光光度計(jì)測定濃度后，用無菌超純水稀釋，配制成系列濃度，備用；

3. 以配制的成系列濃度DNA為模板進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶，10μmol/L的RMSF和RMSR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達(dá)25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45sec，56℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35個循環(huán)；72℃延伸10min；電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。

4. 以配制的成系列濃度DNA為模板進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增：

（1）第一輪PCR 擴(kuò)增：以真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS） 通用引物TS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-3' 為外引物對配制的成系列濃度DNA 進(jìn)行第一輪PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系和反應(yīng)程序?yàn)椋篜CR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶（Takara 大連寶生物工程有限公司），10μmol/L的TIS1和ITS4各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達(dá)25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1 min，55℃退火45sec，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃延伸10min；

（2）第二輪PCR擴(kuò)增：以第一輪PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板，以RMSF/RMSR為引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶，10μmol/L的RMSF和RMSR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達(dá)25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45sec，56℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35個循環(huán)；72℃延伸10min；電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。

5.檢測結(jié)果

如圖2所示，以本發(fā)明引物RMSF/RMSR為引物進(jìn)行常規(guī)PCR時，在25μL反應(yīng)體系中，1pg的香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）DNA可以獲得可視條帶，其檢測靈敏度可達(dá)到1pg（圖2-A）；而進(jìn)一步以真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）的通用引物TS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' 為外引物擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板，以本發(fā)明引物RMSF/RMSR為引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增時，在25μL反應(yīng)體系中，1fg的香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）DNA可以獲得可視條帶，其檢測靈敏度可達(dá)到1fg(圖2-B)。

實(shí)施例4發(fā)病香蕉植株中香蕉葉斑病菌（Ramichloridium musae）的檢測

1.采用NaOH 快速裂解法提取香蕉植株組織基因組DNA。

2. 以配制的成系列濃度DNA為模板進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶，10μmol/L的RMSF和RMSR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達(dá)25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45sec，56℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35個循環(huán)；72℃延伸10min；電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。

3. 檢測結(jié)果

如圖3所示，自然發(fā)病的香蕉葉片組織、自然發(fā)病香蕉葉柄組織、人工接種發(fā)病的香蕉葉片組織、人工接種發(fā)病香蕉葉柄組織、陽性對照中均可產(chǎn)生383bp左右的可視條帶，而健康香蕉葉片組織、健康的香蕉葉柄組織、健康的香蕉果皮組織、陰性對照均無任何條帶出現(xiàn)，表明本發(fā)明引物和檢測方法還可用于田間香蕉葉斑?。?i>Ramichloridium musae）發(fā)病植株的檢測。

SEQUENCE LISTING

<110>福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所

<120>一種香蕉葉斑病菌分子檢測引物及其快速檢測方法

<160>4

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>1

tccgtagggaacctgcgg 18

<210>2

<211>20

<212>DNA

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<400>2

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<211> 20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>3

aaccctgcgtaactgagtcg 20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>4

ttcagcgggtatccctacct 20