本發(fā)明屬于食品安全檢測(cè)或者病原微生物檢測(cè)領(lǐng)域，更具體涉及一種區(qū)分豬鏈球菌爆發(fā)菌株和散發(fā)菌株的檢測(cè)引物和應(yīng)用，本發(fā)明提供的引物適用于動(dòng)植物性產(chǎn)品、制品、公共安全和動(dòng)物疫病的快速檢測(cè)。

背景技術(shù)：

豬鏈球菌(Streptococcus suis,S.suis)是一種重要的人畜共患傳染病病原。S.suis不僅導(dǎo)致豬出現(xiàn)腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎、心內(nèi)膜炎和敗血癥等癥狀，造成豬只大量死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，還可以通過與感染豬、帶菌豬肉直接接觸而傳染給人，導(dǎo)致人永久性聽力喪失、敗血癥型休克甚至死亡，嚴(yán)重威脅著人類的身體健康和生命安全，已引起社會(huì)的高度關(guān)注。1998年在江蘇南通S.suis造成病死豬10萬余頭，人群感染25例；2005年四川省S.suis造成死亡豬幾千頭，人群感染208例。同期廣東、香港也有病例報(bào)導(dǎo)。豬鏈球菌病已成為泰國的重要傳染病，豬鏈球菌也是香港引起腦膜腦炎的第三大病原(僅次于肺炎鏈球菌和結(jié)核分枝桿菌)和越南引起腦膜腦炎的第一大病原(Streptococcus suis meningitis:the newest serious infectious disease.J Med Assoc Thai.2008；91(5):654-658；Streptococcus suis infection and risk factors for mortality.J Infect.2008；57(5):392-396；Streptococcus suis:an emerging human threat.J Infect Dis.2009；199(1):4-6.)。盡管該病原在我國引起兩次爆發(fā)事件，并且近年來連續(xù)報(bào)導(dǎo)人和豬感染豬鏈球菌病例，目前仍未有商業(yè)化的方法區(qū)分豬鏈球菌的爆發(fā)菌株和散發(fā)菌株。因此，亟需尋找可用于能夠區(qū)分爆發(fā)菌株和散發(fā)菌株的檢測(cè)靶點(diǎn)，并建立相應(yīng)的檢測(cè)方法，使得我們能夠?qū)υ摬≡M(jìn)行監(jiān)測(cè)，防患于未然；也有助于在中國突發(fā)公共衛(wèi)生事件中早期應(yīng)急處置疫情，進(jìn)而抑制疫情的爆發(fā)和蔓延。

目前豬鏈球菌的檢測(cè)方法主要有微生物學(xué)方法、生化方法、免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法等。微生物學(xué)方法和生化方法并不能用于區(qū)分不同菌株的致病性，更無法區(qū)分爆發(fā)菌株和散發(fā)菌株。免疫學(xué)方法只可用于檢測(cè)部分公認(rèn)的毒力因子，并且需要制備毒力因子相應(yīng)的抗血清，對(duì)操作人員要求較高，這些要求一定程度上限制了該方法的應(yīng)用。近年來分子生物學(xué)的檢測(cè)方法的發(fā)展較大程度上提高了病原檢測(cè)的特異性和靈敏度，減少了檢測(cè)時(shí)間，已經(jīng)成為重要的檢測(cè)技術(shù)。目前常見的分子生物學(xué)檢測(cè)方法如特異性的核酸探針，熒光實(shí)時(shí)定量PCR和PCR檢測(cè)方法等。盡管不同的分子生物學(xué)檢測(cè)方法各有利弊，共同需要解決的問題是檢測(cè)靶點(diǎn)的選擇。

我國學(xué)者對(duì)1998年和2005年爆發(fā)的菌株的基因組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩次爆發(fā)的中國強(qiáng)毒力菌株比歐洲菌株多出一段89kb的核酸片段，命名為為89K毒力島(A Glimpse of Streptococcal Toxic Shock Syndrome from Comparative Genomics of S.suis 2Chinese Isolates.PLoS ONE.2007Mar 21；2(3):1-9)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)位于89K毒力島上的基因Di-peptidyl peptidase IV、SalK/SalR和VirD4-89K等均與爆發(fā)菌株的致病性密切相關(guān)(Inactivation of Dipeptidyl Peptidase IV Attenuates the Virulence of Streptococcus suis Serotype 2that Causes Streptococcal Toxic Shock Syndrome.Curr Microbiol.2009Sep；59(3):248-55；SalK/SalR,a two-Component Signal Transduction System,Is Essential for Full Virulence of Highly Invasive Streptococcus suis Serotype 2.PLoS ONE.2008May 7；3(5):e2080；Role of a Type IV–Like Secretion System of Streptococcus suis 2 in the Development of Streptococcal Toxic Shock Syndrome.J Infect Dis.2011；204(2):274-81.)。綜上所述，89kb的核酸片段被公認(rèn)是用于區(qū)分爆發(fā)菌株和散發(fā)菌株的重要標(biāo)志，許多檢測(cè)方法也建立在此基礎(chǔ)上。

申請(qǐng)人經(jīng)過10年的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，89kb的核酸片段的許多區(qū)域存在于散發(fā)菌株中，即并非89kb毒力島上的所有序列均適合成為檢測(cè)靶點(diǎn)(Predominance of Streptococcus suis ST1and ST7 in human cases in China,and detection of a novel sequence type,ST658.Virulence.2016Sep 30:1-5.)。因此，我們有必要對(duì)該區(qū)域進(jìn)行深入分析，挖掘新型的檢測(cè)靶點(diǎn)，提高檢測(cè)的精確性。

通過檢索有以下專利申請(qǐng)，CN101440400A公開了“含89K毒力島豬鏈球菌2型核酸的熒光檢測(cè)試劑盒及方法，”該方法基于89kb的核酸序列直接設(shè)計(jì)引物和特異性核酸探針，容易出現(xiàn)上文描述的不準(zhǔn)確現(xiàn)象。

CN102312013A公開了“檢測(cè)2型豬鏈球菌89K毒力島基因的引物和探針、實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法及試劑盒，”該方法基于樣品中含SalK基因、virB4-89K基因以及cps2J基因，則認(rèn)為該樣品中存在致病力高的含89K毒力島的2型豬鏈球菌。但SalK、virB4-89K、cps2J這些基因的部分序列也存在于散發(fā)菌株中。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述問題，本發(fā)明的目的在于提供了一種區(qū)分豬鏈球菌爆發(fā)菌株和散發(fā)菌株的檢測(cè)引物和應(yīng)用，所述的引物為：SS-F：TAACTGATACGCTTGGAT和SS-R：AGATTCCGCATTTCCTCC。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了一種區(qū)分豬鏈球菌爆發(fā)菌株和散發(fā)菌株的檢測(cè)引物的應(yīng)用，該引物可以用于制備成區(qū)分豬鏈球菌爆發(fā)菌株和散發(fā)菌株試劑盒，用于食品、動(dòng)物疫病和衛(wèi)生檢測(cè)中。簡單易行，不需要提取基因組，節(jié)省時(shí)間，降低成本。對(duì)設(shè)備依賴程度低，反應(yīng)時(shí)間短，僅需要3小時(shí)便可以完成整個(gè)檢測(cè)過程，靈敏度高，能檢測(cè)到fg級(jí)別的核酸。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：

申請(qǐng)人對(duì)近10年收集的30株豬鏈球菌散發(fā)菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序，結(jié)合數(shù)據(jù)庫中已有的200株豬鏈球菌菌株，一共對(duì)230株菌株的基因組進(jìn)行分析，最終篩選到能夠用于精確區(qū)分檢測(cè)爆發(fā)菌株和散發(fā)菌株的靶點(diǎn)，利用該靶點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，最終獲得了一種區(qū)分豬鏈球菌爆發(fā)菌株和散發(fā)菌株的檢測(cè)引物，所述的引物為：SS-F：TAACTGATACGCTTGGAT和SS-R：AGATTCCGCATTTCCTCC。

區(qū)分豬鏈球菌爆發(fā)菌株和散發(fā)菌株的檢測(cè)引物的應(yīng)用，包括利用該檢測(cè)引物制備成區(qū)分豬鏈球菌爆發(fā)菌株和散發(fā)菌株試劑盒，該試劑盒可用于食品、動(dòng)物疫病和衛(wèi)生檢測(cè)領(lǐng)域中豬鏈球菌爆發(fā)菌株的檢測(cè)。

所述的試劑盒，優(yōu)選的，還包括：EasyTaq Buffer，dNTPs，EasyTaq DNA聚合酶，SYBR Green I熒光染料，陽性對(duì)照(豬鏈球菌SC19(Draft Genome Sequence of Hypervirulent and Vaccine Candidate Streptococcus suis Strain SC19.Genome Announc.2017Jan 19；5(3).)，陰性對(duì)照(無菌去離子水)。

利用上述試劑盒區(qū)分豬鏈球菌爆發(fā)菌株和散發(fā)菌株的方法，包括：

(1)前處理：將從疑似被豬鏈球菌污染的生肉、肉制品或其他食品以及疑似感染動(dòng)物的組織、血液或腦脊液中劃線分離到的疑似菌落，或者增菌液進(jìn)行離心集菌。將菌落或離心得到的菌體加入50μL 20mM Tris-HCl振蕩混勻，再于100℃中水浴10分鐘，完成待檢樣品前處理。

(2)豬鏈球菌的PCR擴(kuò)增：

反應(yīng)體系為：2.5μL 10×EasyTaq Buffer、2μL 2.5mM dNTPs、1μL EasyTaq DNA聚合酶(5units/μL)、1μL 10μM SS-F、1μL 10μM SS-R、1μL待測(cè)樣品，無菌去離子水補(bǔ)足至25μL；

反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，50℃退火30s、72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)，72℃溫育5min。

(3)結(jié)果判讀：以下兩種判定方法選其一則可。

(3.1)顯色反應(yīng)：取出PCR反應(yīng)管，加入SYBR Green I熒光染料，蓋緊管蓋，混勻后肉眼直接觀察顏色變化或者用紫外燈觀察顏色變化。在正常日光條件下呈綠色的為陽性反應(yīng)，橙紅色的為陰性反應(yīng)。在紫外燈下發(fā)出強(qiáng)烈綠色熒光的為陽性反應(yīng)，不能發(fā)出熒光的為陰性反應(yīng)。

(3.2)電泳檢測(cè)：從PCR反應(yīng)管中取出5μL樣品與1μL 6*loading buffer混勻后直接點(diǎn)樣于0.8％(質(zhì)量體積比)的瓊脂糖凝膠中，80V-120V電泳30-40分鐘后可在凝膠成像系統(tǒng)中觀察到特異性條帶(764bp)。

所述的食品包括但不限于超市或出入境的豬肉類食物，包括生豬肉、豬內(nèi)臟以及臘肉、熏肉、灌腸等各種豬肉制品。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)準(zhǔn)確性高：本發(fā)明通過基因組學(xué)和大數(shù)據(jù)分析方法對(duì)檢測(cè)靶點(diǎn)進(jìn)行了高通量篩選，在檢測(cè)靶點(diǎn)的選擇上進(jìn)行了創(chuàng)新，極大提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性；

(2)簡單易行：該方法簡單易行，不需要提取基因組，節(jié)省時(shí)間，降低成本，對(duì)設(shè)備依賴程度低，僅需要3小時(shí)便可以完成整個(gè)檢測(cè)過程；

(3)靈敏度高：能檢測(cè)到fg級(jí)別的核酸。

附圖說明

圖1為本發(fā)明提供的檢測(cè)引物對(duì)人源分離株的檢測(cè)示意圖；

其中圖1中A為PCR擴(kuò)增后的電泳圖；圖1中B為PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物中加入顯色液后在正常日光條件下的結(jié)果示意圖；圖1中C為PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物中加入顯色液后在紫外燈下顯示結(jié)果示意圖；

M為Maker，泳道1為陽性對(duì)照豬鏈球菌SC19、泳道2為陰性對(duì)照。

圖2為本發(fā)明提供的檢測(cè)引物對(duì)豬源分離株的檢測(cè)示意圖；

其中圖2中A為PCR擴(kuò)增后的電泳圖；圖2中B為PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物中加入顯色液后在正常日光條件下的結(jié)果示意圖；圖2中C為PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物中加入顯色液后在紫外燈下顯示結(jié)果示意圖；

M為Maker，泳道1為陽性對(duì)照豬鏈球菌SC19、泳道2為陰性對(duì)照。

圖3為本發(fā)明提供的引物的特異性檢測(cè)結(jié)果示意圖：

圖3中A為對(duì)待測(cè)菌株的PCR擴(kuò)增后的電泳圖；圖3中B為在應(yīng)用該檢測(cè)試劑盒對(duì)待測(cè)菌株的PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物中加入顯色液后在正常日光條件下的結(jié)果示意圖；圖3中C為在應(yīng)用該檢測(cè)試劑盒對(duì)待測(cè)菌株的PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物中加入顯色液后在紫外燈下顯示結(jié)果示意圖；

M：Maker，泳道1為陽性對(duì)照豬鏈球菌SC19、泳道2為陰性對(duì)照，泳道3-10分別為ATCC13311、ATCC13076、ATCC29213、ATCC6538、83175、F18ac、ATCC33846、ATCC19114。

圖4為利用本發(fā)明提供的引物對(duì)豬鏈球菌SC19的不同濃度的菌液檢測(cè)結(jié)果示意圖：

圖4中A為PCR擴(kuò)增后的電泳圖；圖4中B為PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物中加入顯色液后在正常日光條件下的結(jié)果示意圖；圖4中C為PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物中加入顯色液后在紫外燈下顯示結(jié)果示意圖；

M：Maker，泳道1-5分別為豬鏈球菌SC19的菌液濃度為3*10⁵CFU/μL、3*10⁴CFU/μL、3*10³CFU/μL、3*10²CFU/μL、30CFU/μL，泳道6為陰性對(duì)照。

圖5為利用本發(fā)明提供的引物對(duì)豬鏈球菌SC19的不同濃度基因組檢測(cè)結(jié)果示意圖：

圖5中A為PCR擴(kuò)增后的電泳圖；圖5中B為PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物中加入顯色液后在正常日光條件下的結(jié)果示意圖；圖5中C為PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物中加入顯色液后在紫外燈下顯示結(jié)果示意圖；

M：Maker，泳道1-7分別為豬鏈球菌SC19的基因組濃度為7.4μg/μL、740pg/μL、74pg/μL、7.4pg/μL、740fg/μL、74fg/μL、7.4fg/μL，泳道8為陰性對(duì)照。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，這些實(shí)例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍，本發(fā)明所述試劑或材料，如未特別說明，均來源于商業(yè)渠道。

實(shí)施例1：

一種區(qū)分豬鏈球菌爆發(fā)菌株和散發(fā)菌株的引物在制備檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用：

一種區(qū)分豬鏈球菌爆發(fā)菌株和散發(fā)菌株的檢測(cè)試劑盒，包括：引物：SS-F：TAACTGATACGCTTGGAT和SS-R：AGATTCCGCATTTCCTCC，EasyTaq Buffer，EasyTaq DNA聚合酶，dNTPs，SYBR Green I的熒光染料。

利用所述試劑盒檢測(cè)的PCR反應(yīng)體系：2.5μL 10×EasyTaq Buffer、2μL 2.5mM dNTPs、1μL EasyTaq DNA聚合酶(5units/μL)、1μL 10μM SS-F、1μL 10μM SS-R、1μL待測(cè)樣品，無菌去離子水補(bǔ)足至25μL；

所述的待測(cè)樣品為菌液或基因組。

反應(yīng)條件：在94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，50℃退火30s、72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)，72℃溫育5min條件下反應(yīng)。

陽性對(duì)照是豬鏈球菌SC19；陰性對(duì)照是無菌去離子水。

結(jié)果判讀：以下兩種判定方法選其一則可。

(1)顯色反應(yīng)：取出PCR反應(yīng)管，加入SYBR Green I熒光染料，蓋緊管蓋，混勻后肉眼直接觀察顏色變化或者用紫外燈觀察顏色變化。在正常日光條件下呈綠色的為陽性反應(yīng)，橙紅色的為陰性反應(yīng)。在紫外燈下發(fā)出強(qiáng)烈綠色熒光的為陽性反應(yīng)，不能發(fā)出熒光的為陰性反應(yīng)。

(2)電泳檢測(cè)：從PCR反應(yīng)管中取出5μL樣品與1μL 6*loading buffer混勻后直接點(diǎn)樣于0.8％(質(zhì)量體積比)的瓊脂糖凝膠中，80V-120V電泳30-40分鐘后可在凝膠成像系統(tǒng)中觀察到特異性條帶(764bp)。

實(shí)施例2：

引物SS-F和SS-R對(duì)豬鏈球菌爆發(fā)菌株和散發(fā)菌株的區(qū)分：

本實(shí)施例所用菌株如下：

豬鏈球菌散發(fā)菌株：Stre08001、Stre08002、Stre09001、Stre09002、Stre11001、Stre11002、Stre13003、Stre13004、RA1、RA2、RA3(Loss of 89K Pathogenicity Island in Epidemic Streptococcus suis,China.Emerg Infect Dis.2016Jun；22(6):1126-7；人感染豬鏈球菌Ⅱ型菌株的毒力基因及分子分型特征分析.中國預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志.2016；17(3):202-206.)。

豬鏈球菌爆發(fā)菌株：SC19、05ZYH33和SC21(Draft Genome Sequence of Hypervirulent and Vaccine Candidate Streptococcus suis Strain SC19.Genome Announc.2017Jan 19；5(3)；Theβ-galactosidase(BgaC)of the zoonotic pathogen Streptococcus suis is a surface protein without the involvement of bacterial virulence.Sci Rep.2014Feb 21；4:4140；Trigger factor of Stre ptococcus suis is involved in stress tolerance and virulence.Microb Pathog.2011Jul-Aug；51(1-2):69-76.)。

其余菌株為本實(shí)驗(yàn)室分離的菌株。

(1)前處理：活化菌株，將菌落或離心得到的菌體加入50μL 20mM Tris-HCl振蕩混勻，再于100℃中水浴10分鐘，完成待檢菌株前處理。

(2)豬鏈球菌的PCR擴(kuò)增：

反應(yīng)體系為：2.5μL 10×EasyTaq Buffer、2μL 2.5mM dNTPs、1μL EasyTaq DNA聚合酶、1μL 10μM SS-F、1μL 10μM SS-R、1μL待測(cè)菌液，無菌去離子水補(bǔ)足至25μL；

SS-F：TAACTGATACGCTTGGAT，SS-R：AGATTCCGCATTTCCTCC。

反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，50℃退火30s、72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)，72℃溫育5min。

(3)結(jié)果判讀：

(3.1)電泳檢測(cè)：從PCR反應(yīng)管中取出5μL樣品與1μL 6*loading buffer混勻后直接點(diǎn)樣于0.8％(質(zhì)量體積比)的瓊脂糖凝膠中，電泳后可在凝膠成像系統(tǒng)中觀察。

本實(shí)施例將菌株分為了人源豬鏈球菌(圖1)和豬源豬鏈球菌(圖2)分別進(jìn)行檢測(cè)。

泳道1為陽性對(duì)照、泳道2為陰性對(duì)照，陽性對(duì)照是豬鏈球菌SC19；陰性對(duì)照是無菌去離子水。

結(jié)果如下：

圖1中：泳道1、泳道4和泳道5為已知爆發(fā)菌株；泳道6-13和泳道16-18為已知散發(fā)菌株；其余泳道菌株為本實(shí)驗(yàn)室分離的菌株。

由圖1中A可知，3株已知爆發(fā)菌株均擴(kuò)出條帶，11株已知散發(fā)菌株均未擴(kuò)出條帶，說明該檢測(cè)引物能夠區(qū)分爆發(fā)菌株和散發(fā)菌株且未出現(xiàn)漏檢情況；

由本實(shí)驗(yàn)室自主分離的豬鏈球菌中，泳道21、23、24、25，均擴(kuò)出條帶，并且后期通過測(cè)序證實(shí)該4株菌株具有完整的89K毒力島；泳道14、15、27擴(kuò)出條帶但不具有完整的89K毒力島，推測(cè)該批菌株疑似爆發(fā)菌株，有待進(jìn)一步研究；泳道3、19、20、22、26、28，均未擴(kuò)出條帶，推測(cè)該批菌株疑似散發(fā)菌株，有待進(jìn)一步研究。

圖2中：除泳道1陽性對(duì)照豬鏈球菌SC19和泳道2為陰性對(duì)照外，其余泳道菌株為本實(shí)驗(yàn)室分離的菌株。

結(jié)果分析：泳道3、4、5、7、8、9、10、11、12、14、15、17，均未擴(kuò)出條帶，推測(cè)該批菌株疑似散發(fā)菌株，有待進(jìn)一步研究；泳道6、13、16、18，均擴(kuò)出條帶但不具有完整的89K毒力島，推測(cè)該批菌株疑似爆發(fā)菌株，有待進(jìn)一步研究。

說明該檢測(cè)引物能夠區(qū)分爆發(fā)菌株和散發(fā)菌株，無論是人源還是豬源均能準(zhǔn)確區(qū)分，未出現(xiàn)漏檢情況。

(3.2)顯色反應(yīng)：取出PCR反應(yīng)管，加入1μL 10％(體積比)SYBR Green I的熒光染料，蓋緊管蓋，混勻后肉眼直接觀察顏色變化或者用紫外燈觀察顏色變化。在正常日光條件下呈綠色的為陽性反應(yīng)，橙紅色的為陰性反應(yīng)(圖1中B、圖2中B)。在紫外燈下發(fā)出強(qiáng)烈綠色熒光的為陽性反應(yīng)，不能發(fā)出熒光的為陰性反應(yīng)(圖1中C、圖2中C)。

實(shí)施例3：

引物SS-F和SS-R的特異性檢測(cè)：

本實(shí)施例所用的菌株為：

1株豬鏈球菌菌株SC19(陽性對(duì)照)、2株沙門氏菌(ATCC13311、ATCC13076)、2株金黃色葡萄球菌(ATCC29213、ATCC6538)、2株大腸桿菌(83175、F18ac)、1株副溶血弧菌(ATCC33846)以及1株李斯特菌(ATCC19114)，共9株菌株。

(1)前處理：活化菌株，將菌落或離心得到的菌體加入50μL 20mM Tris-HCl振蕩混勻，再于100℃中水浴10分鐘，完成待檢菌株前處理。

(2)豬鏈球菌的PCR擴(kuò)增：

反應(yīng)體系為：2.5μL 10×EasyTaq Buffer、2μL 2.5mM dNTPs、1μL EasyTaq DNA聚合酶、1μL 10μM SS-F、1μL 10μM SS-R、1μL待測(cè)菌液，無菌去離子水補(bǔ)足至25μL；

SS-F：TAACTGATACGCTTGGAT，SS-R：AGATTCCGCATTTCCTCC。

反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，50℃退火30s、72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)，72℃溫育5min。

(3)結(jié)果判讀：

(3.1)電泳檢測(cè)：從PCR反應(yīng)管中取出5μL樣品與1μL 6*loading buffer混勻后直接點(diǎn)樣于0.8％(質(zhì)量體積比)的瓊脂糖凝膠中，電泳后可在凝膠成像系統(tǒng)中觀察。

其中圖3中A中的泳道1為陽性對(duì)照、泳道2為陰性對(duì)照、泳道3-10為非豬鏈球菌菌株。除陽性對(duì)照菌株外的菌株均未擴(kuò)出條帶，說明該檢測(cè)引物特異性良好。

陽性對(duì)照是豬鏈球菌SC19；陰性對(duì)照是無菌去離子水。

(3.2)顯色反應(yīng)：取出PCR反應(yīng)管，加入1μL 10％(體積比)SYBR Green I的熒光染料，蓋緊管蓋，混勻后肉眼直接觀察顏色變化或者用紫外燈觀察顏色變化。在正常日光條件下呈綠色的為陽性反應(yīng)，橙紅色的為陰性反應(yīng)(圖3中B)。在紫外燈下發(fā)出強(qiáng)烈綠色熒光的為陽性反應(yīng)，不能發(fā)出熒光的為陰性反應(yīng)(圖3中C)。

實(shí)施例4：

引物SS-F和SS-R的靈敏度檢測(cè)：

本實(shí)施例使用豬鏈球菌SC19進(jìn)行檢測(cè)。

(1)前處理：活化菌株，將菌落或離心得到的菌體加入50μL 20mM Tris-HCl振蕩混勻，再于100℃中水浴10分鐘，完成豬鏈球菌SC19的前處理。或使用基因組提取試劑盒提取豬鏈球菌SC19的基因組，將得到的基因組或是菌液進(jìn)行梯度稀釋，以用于以下引物靈敏度的檢測(cè)。

(2)豬鏈球菌的PCR擴(kuò)增：

反應(yīng)體系為：2.5μL 10×EasyTaq Buffer、2μL 2.5mM dNTPs、1μL EasyTaq DNA聚合酶、1μL 10μM SS-F、1μL 10μM SS-R、1μL豬鏈球菌SC19的不同濃度的菌液或基因組，無菌去離子水補(bǔ)足至25μL；

SS-F：TAACTGATACGCTTGGAT，SS-R：AGATTCCGCATTTCCTCC。

反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，50℃退火30s、72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)，72℃溫育5min。

(3)結(jié)果判讀：

(3.1)電泳檢測(cè)：從PCR反應(yīng)管中取出5μL樣品與1μL 6*loading buffer混勻后直接點(diǎn)樣于0.8％(質(zhì)量體積比)的瓊脂糖凝膠中，電泳后可在凝膠成像系統(tǒng)中觀察。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知(圖4中A、圖5中A)，該檢測(cè)引物可檢測(cè)的SC19的最低菌液濃度為300CFU/μL、最低基因組濃度為74fg/μL，說明該檢測(cè)引物靈敏度高。

陽性對(duì)照是豬鏈球菌SC19；陰性對(duì)照是無菌去離子水。

(3.2)顯色反應(yīng)：取出PCR反應(yīng)管，加入1μL 10％(體積比)SYBR Green I的熒光染料，蓋緊管蓋，混勻后肉眼直接觀察顏色變化或者用紫外燈觀察顏色變化。在正常日光條件下呈綠色的為陽性反應(yīng)，橙紅色的為陰性反應(yīng)(圖4中B、圖5中B)。在紫外燈下發(fā)出強(qiáng)烈綠色熒光的為陽性反應(yīng)，不能發(fā)出熒光的為陰性反應(yīng)(圖4中C、圖5中C)。當(dāng)豬鏈球菌SC19的菌液或基因組濃度較低時(shí)，在其PCR產(chǎn)物中加入熒光染料，在正常日光條件下呈橙紅色但在紫外燈下可發(fā)出綠色熒光與電泳結(jié)果一致，說明在紫外燈下觀察的結(jié)果更準(zhǔn)確。

實(shí)施例5：

實(shí)施例1中的試劑盒在食品、動(dòng)物疫病(病原)、公共衛(wèi)生檢測(cè)中的應(yīng)用：

(1)前處理：將從被分別使用已知豬鏈球菌(散發(fā)菌株：RA1或爆發(fā)菌株：SC19)人工污染了的生肉、肉制品或其他食品以及動(dòng)物的組織、血液或腦脊液中劃線分離到的菌落，或者增菌液進(jìn)行離心集菌。將菌落或離心得到的菌體加入含有50μL前處理液中振蕩混勻，再于100℃中水浴10分鐘，完成待檢樣品的前處理。

所述的前處理液為：20mM Tris-HCl；

(2)PCR擴(kuò)增：

步驟1.根據(jù)待測(cè)樣品個(gè)數(shù)，設(shè)置PCR反應(yīng)管數(shù)N，N＝樣品個(gè)數(shù)+2(含有1管陽性對(duì)照和1管陰性對(duì)照)；

所述的陽性對(duì)照為豬鏈球菌SC19；陰性對(duì)照為無菌去離子水。

步驟2.配制PCR反應(yīng)體系：2.5μL 10×EasyTaq Buffer(200mM Tris-HCl、100mM(NH₄)₂SO₄、200mM KCl、20mM MgSO₄)、2μL 2.5mM dNTPs、1μL EasyTaq DNA聚合酶(5units/μL)、1μL 10μM SS-F、1μL 10μM SS-R、1μL待測(cè)樣品，無菌去離子水補(bǔ)足至25μL；

步驟3.依次向反應(yīng)管中分別加入1μL陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和待檢樣品，蓋緊管蓋并做好相應(yīng)標(biāo)記；

步驟4.PCR擴(kuò)增過程。置于PCR儀上進(jìn)行DNA擴(kuò)增，94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，50℃退火30s、72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)，72℃溫育5min。

(3)結(jié)果判讀：兩種判定方法選其一則可。

(3.1)電泳檢測(cè)：從PCR反應(yīng)管中取出5μL樣品與1μL 6*loading buffer混勻后直接點(diǎn)樣于0.8％(質(zhì)量體積比)的瓊脂糖凝膠中，電泳后可在凝膠成像系統(tǒng)中觀察。使用已知豬鏈球菌爆發(fā)菌株污染的樣品PCR擴(kuò)增均得到了對(duì)應(yīng)分子量大小的條帶；使用已知豬鏈球菌散發(fā)菌株污染的樣品PCR擴(kuò)增均沒有條帶。說明該檢測(cè)試劑盒能夠很好地區(qū)分爆發(fā)菌株和散發(fā)菌株。

(3.2)顯色反應(yīng)：取出PCR反應(yīng)管，依次加入1μL顯色液，蓋緊管蓋，混勻后肉眼直接觀察顏色變化或者用紫外燈觀察顏色變化。在正常日光條件下呈綠色的為陽性反應(yīng)，橙紅色的為陰性反應(yīng)。在紫外燈下發(fā)出強(qiáng)烈綠色熒光的為陽性反應(yīng)，不能發(fā)出熒光的為陰性反應(yīng)。

上述的一種區(qū)分豬鏈球菌爆發(fā)菌株和散發(fā)菌株的檢測(cè)試劑盒在各種超市或出入境的生豬肉、豬內(nèi)臟以及臘肉、熏肉、灌腸等各種豬肉制品中檢測(cè)，其他疑似被污染的食品(豬鏈球菌有可能從肉類交叉污染到各種制品和蔬菜上)都可以通過該方法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)的是病原。

上述的一種區(qū)分豬鏈球菌爆發(fā)菌株和散發(fā)菌株的檢測(cè)試劑盒對(duì)疑似被豬鏈球菌感染的豬和人可以檢測(cè)，檢測(cè)的是病原。

SEQUENCE LISTING

<110> 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 一種區(qū)分豬鏈球菌爆發(fā)菌株和散發(fā)菌株的檢測(cè)引物和應(yīng)用

<130> 一種區(qū)分豬鏈球菌爆發(fā)菌株和散發(fā)菌株的檢測(cè)引物和應(yīng)用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

taactgatac gcttggat 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agattccgca tttcctcc 18