專利名稱：一種生物被膜狀態(tài)下豬鏈球菌總蛋白的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白組學(xué)研究領(lǐng)域中的生物被膜狀態(tài)下細(xì)菌總蛋白的提取方法。
背景技術(shù)：
隨著眾多物種基因組測序的完成，人們的注意力開始轉(zhuǎn)向如何從結(jié)構(gòu)、功能以及生物系統(tǒng)的控制角度來闡述基因組序列中的信息。蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)的出現(xiàn)為研究復(fù)雜生物系統(tǒng)開辟了嶄新的途徑。在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中使用最為廣泛同時也是平行實驗中較為可靠的技術(shù)是雙向電泳技術(shù)，然后對分離的蛋白進行生物質(zhì)譜鑒定(Gorg A，WeissW，Dunn Mj.しurrent two-dimensional electrophoresis technology for proteomics.Proteomics,2004,4 :3665-3685.)。由于各種用于雙向電泳的蛋白提取方法，往往因為細(xì)菌 的種類和處于的生長狀態(tài)不同而差別很大，因此高質(zhì)量的細(xì)菌蛋白的提取，成為雙向電泳以及后續(xù)質(zhì)譜鑒定工作中最具挑戰(zhàn)性的工作之一。細(xì)菌生物被膜(biofilm，BF)是指細(xì)菌自身產(chǎn)生的外部多糖基質(zhì)、纖維蛋白質(zhì)、脂蛋白等包裹著的菌細(xì)胞的結(jié)果；単一或多種類群細(xì)菌為了適應(yīng)周圍環(huán)境，吸附于異物或組織表面，繁殖并分泌大量多糖基質(zhì)、纖維蛋白、月旨蛋白等多糖蛋白復(fù)合物，使得細(xì)菌相互粘連、聚集、纏繞，形成具有三維立體結(jié)構(gòu)的膜樣物，是細(xì)菌微菌落聚集體(Hall-Stoodley L,Costerton Jff,Stoodley P. Bacterial biofilms from the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol,2004,2 :95-108.)。因此處于生物被膜狀態(tài)下的菌體通常被大量的多糖蛋白包裹，會影響雙向電泳的分離蛋白的效果，進而干擾后期的質(zhì)譜鑒定工作(Marzban G, Herndl A, MaghulyF, Katinger H, Laimer M. Mapping of fruit allergens by 2Delectrophoresis andimmunodetection. Expert Rev Proteomics,2008, 5 :61-75.)。目前，已有多種提取的方法被應(yīng)用于細(xì)菌浮游態(tài)下蛋白組學(xué)的研究中(JingHB,Yuan J, Wang J, Yuan Y, Zhu L, Liu XK, Zheng YL, Wei KH, Zhang XM, Geng HR, Duan Q,Feng SZ,Yang RF,Cao WC,Wang HL,Jiang YQ. Proteome analysis of Streptococcus suisserotype 2. Proteomics, 2008,8 :333-349.),并且也獲得了理想的雙向電泳結(jié)果，處于生物被膜狀態(tài)下的細(xì)菌蛋白組學(xué)研究目前還較少，特別對于豬鏈球菌這類革蘭氏陽性細(xì)菌，主要的困難不僅在于分離細(xì)菌與包裹在外的多糖蛋白，而且革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁有大量的肽聚糖層，細(xì)胞壁較厚，使得高質(zhì)量蛋白提取異常困難。目前，分離細(xì)菌和包裹在外的多糖蛋白的采用方法為渦旋震蕩使其機械分離，該方法存在機械震蕩不能完全使得細(xì)菌于包裹的胞外基質(zhì)分離，造成提取蛋白中有多糖等成分的殘留，影響實驗結(jié)果。提取細(xì)菌全菌蛋白應(yīng)用最廣泛的是直接超聲波破碎后，用三氯こ酸-丙酮沉淀(TCA)細(xì)菌蛋白，該方法在防止蛋白降解和去除部分干擾性雜質(zhì)方面具有很好的效果，但是對于革蘭氏陽性等細(xì)胞壁較厚的細(xì)菌來說存在細(xì)胞壁破碎不完全，常常造成部分蛋白的丟失。還有ー種是利用玻璃珠破碎法，該方法利用機械破碎細(xì)菌細(xì)胞壁來獲得全菌蛋白，同樣造成破壁不完全，導(dǎo)致部分蛋白丟失，2D圖上蛋白有大量拖尾的現(xiàn)象(Svensater G, Welin J, Wilkins JC, Beighton D,Hamilton 丄R. Protein expression by pianktonic and bioiilm cells of Streptococcusmutans. FEMS Microbiol Lett，2001，205 :139-146.)。還有ー種提取方法-酚抽提
法，該方法的基本原理是通過將蛋白質(zhì)溶解在Tris飽和酚中，然后通過反復(fù)抽提除去各種雜質(zhì)，最后利用醋酸銨飽和的甲醇溶液將酹相中的蛋白質(zhì)沉淀下來(Carpentier SC,Witters E, Laukens K, Deckers P, Swennen R ana Panis B.Preparation of proteinsextracts from recalcitrant plant tissues An evaluation of different methods fortwo-dimensional gel electroPHoresis analysis. Proteomics,2005, 5 :2497-2507)。在酚抽提法中，利用蛋白質(zhì)溶于Tris飽和酚的特性，通過加入提取液反復(fù)抽提，可以有效地去除不溶于有機溶劑的雜質(zhì)，并且在抽提過程中，大多數(shù)鹽離子被留在提取液中，從而起到一定程度的除鹽作用(Li XF, Han HP, Wang XC, Fan PX and Li YX. Extraction methodsior two-dimensional electrophoresis analysis of shoot proteins in halophyteSalicornia europaea. Acta Ecologica Sinica, 2006, 26 :1848-1853.),但是在細(xì)胞中，多酚類物質(zhì)會以氫鍵與蛋白質(zhì)不可逆結(jié)合，導(dǎo)致雙向電泳膠圖像中出現(xiàn)成片狀彌散現(xiàn)象，一 些難溶性碳化合物還會堵塞IPG膠條的膠孔，從而延長聚焦時間，最終導(dǎo)致拖尾和部分蛋白質(zhì)丟失。另外，處于生物被膜狀態(tài)的細(xì)菌細(xì)胞中廣泛存在大量的多糖、脂類等物質(zhì)，同樣會造成膠上的彌散現(xiàn)象，因此在制備用于2-DE的蛋白質(zhì)樣品的時候，一定要先最大量的去除包裹細(xì)菌形成生物被膜的多糖等雜質(zhì)，并盡可能的溶解細(xì)菌細(xì)胞壁，減少總蛋白的丟失。因此，為了更好的研究處于生物被膜狀態(tài)下豬鏈球菌蛋白表達差異，深入了解豬鏈球菌形成生物被膜的原因和致病分子機理，需要一種簡單、實用、高效的細(xì)菌生物被膜狀態(tài)下總蛋白的提取方法。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述問題，本發(fā)明的目的是提供ー種具有較高提取效率的生物被膜狀態(tài)下豬鏈球菌總蛋白的提取方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案采用了一種處于生物被膜狀態(tài)下豬鏈球菌總蛋白的提取方法，包括以下步驟(I)對處于生物被膜狀態(tài)下豬鏈球菌的處理，將培養(yǎng)皿中上清移除，并用30-70mMTris/HCl PH 7. 5清洗2_3遍后，用細(xì)胞刮刀刮下黏附于培養(yǎng)皿的處于生物被膜狀態(tài)下的細(xì)菌菌體；細(xì)胞懸液被超聲震蕩5-10min后，再用30_70mM Tris/HC1(PH 7. 5)清洗2-3遍，每遍以渦旋振蕩器渦旋震蕩，離心5-15min收集菌體；(2)清洗的菌體細(xì)胞以30-50mM Tris-HCl，3_7mM MgCl2和30% -50%的蔗糖緩沖液重懸，每毫升緩沖液中添加500-1000U/ml變?nèi)芫?Mutanolysin)，以37°C孵育60-90分鐘；(3)離心IOmin收集處于原生質(zhì)體的細(xì)胞，以超聲緩沖液(5-10M urea, 1-3Mthiourea，3-5% CHAPS和50-75mM DTT)重懸細(xì)胞，加入蛋白酶抑制劑，冰浴中超聲破碎(最大功率的70-120W，脈沖5s，停IOs)，共60-100個循環(huán)；(4)隨后在15-32°c孵育10-60!1^11，25で，10，000\8離心301^11，以除去細(xì)胞碎片
和沒有裂解的細(xì)菌；(5)蛋白上清液加入5-15% TCA后冰浴15_60min。用預(yù)冷的丙酮洗蛋白2_3次后，離心5-10min收集總蛋白，室溫條件下干燥收集到的總蛋白，獲得細(xì)菌總蛋白。
在上述提取方法中，步驟(I)中處理菌體的總量以不超過5X IO9為最優(yōu)。Tris/HCl的濃度以50mM為最優(yōu)，清洗，3遍最優(yōu)；超聲震蕩的時間以7分鐘最優(yōu)。步驟⑵中清洗細(xì)胞的緩沖液最優(yōu)化為50mM Tris-HCl, 5mM MgCl2和50%的蔗糖緩沖液，變?nèi)芫靥砑恿恳?50U/ml為最優(yōu)，以Sigma公司的產(chǎn)品最優(yōu)，孵育時間以90分鐘最優(yōu)。步驟(3)中超聲緩沖液的最優(yōu)化配方為7M urea, 2M thiourea，4 % CHAPS和65mMDTT，超聲破碎的最大功率以100W為最優(yōu)，循環(huán)數(shù)以90個循環(huán)為最優(yōu)。步驟(4)中孵育的溫度以25°C最優(yōu)，孵育的時間以30分鐘為最優(yōu)。步驟(5)中TCA的濃度以10%為最優(yōu)，冰浴時間以30分鐘最優(yōu)，預(yù)冷的丙酮清洗最優(yōu)為2次,離心時間以10分鐘最優(yōu)。
步驟(I)到步驟(5)中離心條件以4°C, IOOOOg為最優(yōu)。本發(fā)明的豬鏈球菌生物被膜狀態(tài)下細(xì)菌總蛋白的提取取方法利用細(xì)胞刮刀刮取，超聲波和機械震蕩的相結(jié)合，利用Tris/HCl清洗，有效的解決了包裹于外表面的多糖和細(xì)菌的分離。利用變?nèi)芫貙τ诟锾m氏陽性細(xì)菌細(xì)胞壁的去除作用，有效的溶解了豬鏈球菌的細(xì)胞壁，并利用低溫超聲破碎，可以最大量的破碎細(xì)胞，獲得全菌蛋白，減少蛋白的丟失。TCA和丙酮的處理可以有效的沉淀全菌蛋白，有效去除雜質(zhì)，最終獲得高質(zhì)量的蛋白質(zhì)。通過雙向電泳檢測提取效果，結(jié)果該方法提取的蛋白聚焦效果好，能夠獲得更多的蛋白點。本發(fā)明的方法為處于生物被膜狀態(tài)下細(xì)菌總蛋白的提取提供了很有價值的參考；可廣泛應(yīng)用于各種處于生物被膜狀態(tài)下細(xì)菌總蛋白的提取，特別是對于細(xì)菌生物被膜狀態(tài)下細(xì)菌蛋白組學(xué)研究中，應(yīng)用前景廣闊。


圖I為用本發(fā)明方法提取豬鏈球菌生物被膜狀態(tài)下細(xì)菌總蛋白的雙向電泳檢測結(jié)果。
具體實施例方式實施例I :本實施例的提取豬鏈球菌生物被膜狀態(tài)下細(xì)菌總蛋白的方法如下所用到的試劑IPG 干膠條(Ready StripTM IPG Strip, 13cm, PH4-7)和 PH4-7 的 IPG Buffer,礦物油、溴酹藍、蛋白定量試劑盒(QuickStart Bradford Protein Assay kit)、urea(尿素)、thiourea(硫脲)、CHAPS、碘こ酰胺(IAA)為GE公司產(chǎn)品；ニ硫蘇糖醇(DTT)、測序級胰蛋白酶、變?nèi)芫?、?-巰基こ醇等為Sigma公司產(chǎn)品；蛋白酶抑制劑為Roche公司產(chǎn)品；Tris, EDTA,過硫酸銨，ΤΜΕΜ,三氯こ酸,丙酮,鹿糖,氯化鈉，甲醇，こ醇,甘油,硫酸銨和こ酸均為化學(xué)分析純，購自鼎國公司(南京)；下述實施例中所用的其它試劑均購自GE公司。雙向電泳中所用到得水為超純水。雙向凝膠電泳第一向等電聚焦儀、第二向垂直板電泳儀為GE 公司產(chǎn)品；掃描儀為 Power look 2100XL(U MAX)；具體步驟如下(I)豬鏈球菌生物被膜的培養(yǎng)將處于對數(shù)生長期的豬鏈球菌母種子液以I : 100轉(zhuǎn)接于含有IOml THB (每升培養(yǎng)基中3g酵母浸出物，20g胰蛋白胨，5g牛肉膏，2gNaCl，2. 5gNa2C03，l. 18g Na2HPO4. 12H20，PH 7.8)液體培養(yǎng)基的100mm的聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37°C靜置培養(yǎng)24h ;將培養(yǎng)皿中上清移除，并用50mM Tris/HC1(PH 7. 5)清洗3遍，每次IOml ;用細(xì)胞刮刀刮下附于培養(yǎng)皿底部的處于生物被膜狀態(tài)的細(xì)菌菌體，以IOml 50mMTris/HCl(PH7. 5)重懸大約IO9細(xì)胞，懸液被超聲震蕩7min后，再用50mM Tris/HCl (PH7. 5)清洗3遍，每遍IOml以渦旋振蕩器渦旋震蕩；4°C，lOOOOg，離心IOmin收集菌體；(2)清洗的菌體細(xì)胞以2ml 50mM Tris-HCl，5mM MgCljP 50%的蔗糖緩沖液重懸，每毫升緩沖液中添加750U/ml變?nèi)芫兀?7°C的溫度下孵育90分鐘；(3) 4 V，IOOOOg,離心IOmin收集處于原生質(zhì)體的細(xì)胞，以5ml超聲緩沖液(7Murea，2M thiourea，4% CHAPS和65mM DTT)重懸細(xì)胞，加入蛋白酶抑制劑，冰浴中超聲破碎(最大功率的100W，脈沖5s，停10s)，共90個循環(huán)；(4)隨后在25°C的溫度下孵育30min，25°C，10，OOOXg離心30min，以除去細(xì)胞碎
片和沒有裂解的細(xì)菌；(5)蛋白上清液加入10% TCA，每管2ml分為3管后冰浴30min，用預(yù)冷的丙酮洗蛋白2次后，每次2ml，離心IOmin收集總蛋白，共獲得3管，室溫干燥蛋白，獲得細(xì)菌總蛋白；(6)干燥的蛋白以 0. 5ml 溶解緩沖液(7M urea, 2M thiourea, 4 % CHAPS 和65mMDTT) 25°C溶解30min，每隔IOmin震蕩一次，以4°C，10, 000 X g離心20min收集總蛋白。以蛋白定量試劑盒檢測大約為400微克細(xì)菌總蛋白。實施例2將實施例I提取到的細(xì)菌總蛋白進行測試，步驟及結(jié)果如下(I)實施例I提到到的細(xì)菌總蛋白樣品以Quick Start Bradford ProteinAssay kit定量，用等電聚焦緩沖液懸浮尿素(8M尿素，2% CHAPS，50mM 二硫蘇糖醇，0. 2%Bio-Lyte4-7兩性電解質(zhì)，0. 001%溴酚蘭公司)溶解分裝成200 μ g小份，直接上樣；采用13cm, PH 4-7的IPG干膠條，放于其中泡脹，蛋白溶解于等電聚焦緩沖液中，上面履蓋礦物油；第一相固相等電聚焦程序按照GE操作手冊進行，即20°C主動水化12h后，500v線性4h，IOOOv 快速 lh, 2000v 線性 lh, 4000v 線性 lh, 8000v 線性 2. 5h, 8000v 快速 0. 5h ；(2)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)先將膠條進行兩次平衡，第一次平衡將膠條浸于3mL平衡緩沖液I (75mMTris-HCl、6M尿素、2% SDS、29. 3%甘油、1%二硫蘇糖醇)中15min ;第二次平衡將膠條浸于3mL平衡緩沖液2(75mM Tris_HCl、6M尿素、2 % SDS、29. 3 %甘油、2. 5 %碘乙酰胺)中15min，兩步平衡后，采用12. 5%的SDS-PAGE 二向垂直板電泳，并用1%瓊脂糖封口 ；先按15mA/gel電泳30min,之后按30mA/gel電泳到溴酹藍指示劑到膠底部；電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍G250染色；脫色后用掃描儀掃描采集圖像，運用roQuestTM2D 7. 4. O軟件進行分析。利用本法提取到處于生物被膜狀態(tài)的細(xì)菌總蛋白在2-DE膠上，背景非常干凈，幾乎見不到拖尾和彌散現(xiàn)象，可以檢測到得蛋白點也較多，蛋白點形狀為圓形或橢圓形，說明聚焦充分，可用于蛋白組學(xué)相關(guān)應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.ー種生物被膜狀態(tài)下豬鏈球菌總蛋白的提取方法，其特征在于包括以下步驟 (1)對處于生物被膜狀態(tài)下豬鏈球菌的處理，將上清移除，并用30-70mMTris/HClPH7. 5清洗2-3遍后，刮下黏附于培養(yǎng)皿的處于生物被膜狀態(tài)下的細(xì)菌菌體；細(xì)胞懸液被超聲震蕩5-10min后，再用30-70mM Tris/HCl PH 7· 5清洗2-3遍，并離心5_15min收集菌體； (2)步驟(I)得到的清洗的菌體細(xì)胞以緩沖液重懸，每毫升緩沖液中添加500-1000U/ml變?nèi)芫?，?6. 5-37. 5°C的溫度下孵育60-90分鐘； (3)離心8-15min收集處于原生質(zhì)體的細(xì)胞，以超聲緩沖液重懸細(xì)胞，加入蛋白酶抑制齊U，冰浴中超聲破碎共60-100個循環(huán)； (4)隨后在15-32°C的溫度下孵育10-6011^11，25で，10，000\8離心301^11，除去細(xì)胞碎片和沒有裂解的細(xì)菌； (5)蛋白上清液加入5-15%TCA后冰浴15-60min。用預(yù)冷的丙酮洗蛋白2_3次后，離心5-10min收集總蛋白，室溫條件下干燥收集到的總蛋白，獲得細(xì)菌總蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物被膜狀態(tài)下豬鏈球菌總蛋白的提取方法，其特征在于步驟(I)中處理菌體的總量以不超過5X109。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物被膜狀態(tài)下豬鏈球菌總蛋白的提取方法，其特征在于步驟(I)中Tris/HCl的濃度優(yōu)選50mM，清洗3遍；超聲震蕩的時間以7分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物被膜狀態(tài)下豬鏈球菌總蛋白的提取方法，其特征在于步驟(2)中清洗細(xì)胞的蔗糖緩沖液的組成為30-50mM Tris-HCl，3_7mM MgCl2和30% -50%蔗糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生物被膜狀態(tài)下豬鏈球菌總蛋白的提取方法，其特征在于步驟(2)中清洗細(xì)胞的蔗糖緩沖液的組成為50mM Tris-HCl, 5mM MgCl2和50%的蔗糖緩沖液，變?nèi)芫靥砑恿績?yōu)選750U/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物被膜狀態(tài)下豬鏈球菌總蛋白的提取方法，其特征在于步驟(3)中超聲緩沖液的組成為 5-10M urea，l-3M thiourea，3-5% CHAPS 和 50_75mMDTT。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物被膜狀態(tài)下豬鏈球菌總蛋白的提取方法，其特征在于步驟⑶中超聲緩沖液的優(yōu)選組成為7M urea, 2M thiourea, 4% CHAPS和65mM DTT。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物被膜狀態(tài)下豬鏈球菌總蛋白的提取方法，其特征在于步驟(3)超聲破碎的最大功率的100W，脈沖5s，停10s。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物被膜狀態(tài)下豬鏈球菌總蛋白的提取方法，其特征在于步驟(4)中孵育的溫度優(yōu)選25°C，孵育的時間優(yōu)選30分鐘。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物被膜狀態(tài)下豬鏈球菌總蛋白的提取方法，其特征在于步驟(5)中TCA的濃度優(yōu)選10%，冰浴時間優(yōu)選30分鐘，預(yù)冷的丙酮清洗為2次，離心時間為10分鐘。
11.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物被膜狀態(tài)下豬鏈球菌總蛋白的提取方法，其特征在于步驟(I)到步驟(5)中離心條件優(yōu)選為4°C，10000g。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物被膜狀態(tài)下豬鏈球菌總蛋白的提取方法，包括以下步驟(1)對處于生物被膜狀態(tài)下豬鏈球菌的處理；(2)步驟(1)得到的清洗的菌體細(xì)胞以蔗糖緩沖液重懸，每毫升緩沖液中添加變?nèi)芫?，?6.5—37.5℃的溫度下孵育；(3)離心8—15min收集處于原生質(zhì)體的細(xì)胞，以超聲緩沖液重懸細(xì)胞，加入蛋白酶抑制劑,冰浴中超聲破碎共60-100個循環(huán)；(4)隨后在15-32℃的溫度下孵育10-60min；(5)蛋白上清液加入5-15%TCA后冰??；用預(yù)冷的丙酮洗蛋白，離心收集總蛋白，室溫條件下干燥收集到的總蛋白，即獲得所述細(xì)菌總蛋白。本發(fā)明的方法可廣泛應(yīng)用于各種處于生物被膜狀態(tài)下細(xì)菌總蛋白的提取，特別是對于細(xì)菌生物被膜狀態(tài)下細(xì)菌蛋白組學(xué)研究中，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號C07K1/14GK102690319SQ20111040660
公開日2012年9月26日 申請日期2011年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月8日
發(fā)明者劉一塵, 張煒, 易力, 李小康, 汪洋, 王臣, 程相朝 申請人:河南科技大學(xué)