本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)與結(jié)直腸癌長(zhǎng)春新堿耐藥相關(guān)的miRNA表達(dá)的引物，同時(shí)還涉及包含該引物的試劑盒和檢測(cè)方法，以及該miRNA在制備拮抗腫瘤耐長(zhǎng)春新堿的藥物中的應(yīng)用，屬于腫瘤生物治療
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的常見病及多發(fā)病，而結(jié)直腸癌(colorectalcancer，CRC)是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，在發(fā)達(dá)國家高居癌癥發(fā)病率第1位、死亡率第2位，高居我國癌癥死亡率第4位，同時(shí)其發(fā)病年齡趨向老齡化。近年的流行病學(xué)資料顯示，全世界CRC新發(fā)病例數(shù)占全部惡性腫瘤新發(fā)病例數(shù)的9.4％。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、生活水平的提高和生活方式的改變，CRC的發(fā)病率還將呈不斷上升的趨勢(shì)。目前CRC的治療是以手術(shù)為主，輔以放、化療治療，其中藥物治療包括化學(xué)藥物治療和靶向藥物治療。但是，由于腫瘤細(xì)胞群體具有內(nèi)在的、高度有序發(fā)展的抗藥能力，無論是細(xì)胞毒類藥物還是靶向藥物，均未能克服耐藥問題。腫瘤細(xì)胞一旦產(chǎn)生耐藥性，化療藥物就不能發(fā)揮完全的抗癌作用殺死癌細(xì)胞，即使大多數(shù)的腫瘤被殺死，而這一小部分具有抗藥性的癌細(xì)胞依然會(huì)繼續(xù)生長(zhǎng)，造成癌癥復(fù)發(fā)。因此腫瘤的耐藥性是影響化療療效和腫瘤根治的主要原因，腫瘤耐藥是腫瘤治療急需解決的關(guān)鍵問題之一。微小RNA(microRNA，miRNA)是長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸(nucleotide，nt)的單鏈小RNA分子，其中21nt～23nt長(zhǎng)度的miRNA占大多數(shù)，約為84％，屬于非編碼RNA(non-protein-codingRNAs，ncRNAs)的一種。miRNA通過在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)水平而參與調(diào)控生命活動(dòng)，包括細(xì)胞增殖、凋亡、脂肪代謝、神經(jīng)元發(fā)育、激素分泌、腫瘤血管生成、干細(xì)胞分化、腫瘤細(xì)胞浸潤及轉(zhuǎn)移等多種生理和病理過程。最近的研究表明，miRNA對(duì)多基因表達(dá)的調(diào)控具有高效性和特異性，對(duì)靶基因的異常調(diào)控可能構(gòu)成腫瘤耐藥機(jī)制，是腫瘤耐藥復(fù)雜性調(diào)控的重要構(gòu)成部分。近些年來，microRNAs不僅參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，而且在化療多藥耐藥性的不同機(jī)制和信號(hào)通路中也發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。它們可能成為逆轉(zhuǎn)腫瘤化療藥物耐藥性、改善化學(xué)治療效果、提高患者生存率的一種有效基因治療策略。長(zhǎng)春新堿(vincristine，VCR)是一種長(zhǎng)春花生物堿，被廣泛用于急性白血病和實(shí)體瘤的治療。但是在使用過程中腫瘤細(xì)胞會(huì)逐漸產(chǎn)生對(duì)VCR的耐藥性。研究表明，miRNA與腫瘤細(xì)胞的耐藥性密切相關(guān)，在MCF-7/VP-16乳腺癌耐藥細(xì)胞中miR-326表達(dá)下降，而在多藥耐藥(包括依托泊苷、順鉑、阿霉素等)的小細(xì)胞肺癌中miR-134表達(dá)下降。尋找耐藥相關(guān)的miRNA作為長(zhǎng)春新堿耐藥性診斷的標(biāo)志物，并通過將miRNA模擬物或抑制劑與長(zhǎng)春新堿聯(lián)合用藥來逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性，對(duì)腫瘤的個(gè)性化診斷和治療具有非常重要的意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)與結(jié)直腸癌長(zhǎng)春新堿耐藥相關(guān)的miRNA表達(dá)的引物。其次，本發(fā)明提供一種包含上述引物的試劑盒。次之，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)與結(jié)直腸癌長(zhǎng)春新堿耐藥相關(guān)的miRNA表達(dá)的方法。再次，本發(fā)明提供一種上述引物、試劑盒在判斷腫瘤細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿耐藥性或者篩選拮抗腫瘤細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿耐藥性藥物中的應(yīng)用。最后，本發(fā)明提供一種miRNA在制備拮抗腫瘤細(xì)胞耐藥性藥物中的應(yīng)用。同時(shí)，本發(fā)明提供一種用于治療結(jié)直腸癌的藥物組合物。為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：用于檢測(cè)與結(jié)直腸癌長(zhǎng)春新堿耐藥相關(guān)的miRNA表達(dá)的引物，根據(jù)該miRNA序列(如SEQIDNO:1所示)設(shè)計(jì)合成，包括逆轉(zhuǎn)錄引物和熒光定量PCR引物。所述逆轉(zhuǎn)錄引物如SEQIDNO:2、3或4所示。所述熒光定量PCR引物的正向引物如SEQIDNO:5或6所示，反向引物如SEQIDNO:7所示。用于檢測(cè)與結(jié)直腸癌長(zhǎng)春新堿耐藥相關(guān)的miRNA表達(dá)的試劑盒，除包含上述引物外，還可以包含通用的miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑和熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑。所述miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑包括逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPmix、buffer緩沖液等。所述熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑包括熒光染料、TaqDNA聚合酶、dNTPmix和buffer緩沖液等。所述試劑盒還可以包含DNA消化試劑以及內(nèi)參的逆轉(zhuǎn)錄引物和熒光定量PCR引物。所述DNA消化試劑包括DNaseI(RNase-free)、EDPC等。所述內(nèi)參可采用U6snRNA管家基因，內(nèi)參的逆轉(zhuǎn)錄引物如SEQIDNO:8所示，熒光定量PCR的正、反向引物分別如SEQIDNO:9、10所示。用于檢測(cè)與結(jié)直腸癌長(zhǎng)春新堿耐藥相關(guān)的miRNA表達(dá)的方法，包括以下步驟：1)以結(jié)直腸癌細(xì)胞的總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA；2)以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，檢測(cè)miRNA的表達(dá)量；步驟1)中逆轉(zhuǎn)錄的引物包括miRNA的逆轉(zhuǎn)錄引物和內(nèi)參的逆轉(zhuǎn)錄引物；步驟2)中熒光定量PCR擴(kuò)增的引物包括miRNA的熒光定量PCR引物和內(nèi)參的熒光定量PCR引物；miRNA的序列如SEQIDNO:1所示。步驟1)中逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系為：5×RTbuffer(250mMTris-HCl(pH8.3)、375mMKCl、15mMMgCl2、50mMDTT)4μL，200U/μL逆轉(zhuǎn)錄酶1μL，10μMmiRNA的逆轉(zhuǎn)錄引物0.5μL，dNTP(2.5mMeach)2.5μL，10μM內(nèi)參的逆轉(zhuǎn)錄引物0.5μL，1.0μg/μLRNA1μL，無RNA酶水補(bǔ)足至20μL。步驟1)中逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)條件為：16℃30min，42℃30min，85℃滅活逆轉(zhuǎn)錄酶5min。反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物放在冰上待用或-20℃保存。步驟2)中熒光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：dNTP(2.5mMeach)2.5μL，2×SYBRGreenPCRMasterMix(購自ABI公司)10μL，1.0μg/μLcDNA1μL，10μMmiRNA的熒光定量PCR引物(正、反向引物各0.5μL)1μL，10μM內(nèi)參的熒光定量PCR引物(正、反向引物各0.5μL)1μL，雙蒸水補(bǔ)足至20μL。步驟2)中熒光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95℃變性5min，40個(gè)循環(huán)(95℃15s，60℃15s，72℃20s，78℃20s，95℃15s)。具體的，步驟1)中miRNA的逆轉(zhuǎn)錄引物如SEQIDNO:2、3或4所示。步驟2)中miRNA的熒光定量PCR引物的正向引物如SEQIDNO:5或6所示，反向引物如SEQIDNO:7所示。步驟2)中檢測(cè)miRNA的表達(dá)量以U6snRNA管家基因作為內(nèi)參，采用相對(duì)定量法。所述內(nèi)參U6snRNA的逆轉(zhuǎn)錄引物如SEQIDNO:8所示。所述內(nèi)參U6snRNA的熒光定量PCR的正、反向引物分別如SEQIDNO:9、10所示。上述用于檢測(cè)與結(jié)直腸癌長(zhǎng)春新堿耐藥相關(guān)的miRNA表達(dá)的引物、試劑盒在判斷結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿耐藥性方面的應(yīng)用?；蛘呱鲜鲆铩⒃噭┖性诤Y選拮抗腫瘤細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿耐藥性藥物中的應(yīng)用。miRNA在制備拮抗腫瘤細(xì)胞耐長(zhǎng)春新堿的藥物中的應(yīng)用，或者在制備治療結(jié)直腸癌的藥物中的應(yīng)用，miRNA序列如SEQIDNO:1所示。具體為：根據(jù)miRNA序列設(shè)計(jì)合成miRNA抑制物，例如采用miRNA的反義寡核苷酸序列作為抑制物(如SEQIDNO:11所示)，以治療有效量的miRNA抑制物為藥效成分制備拮抗腫瘤細(xì)胞耐長(zhǎng)春新堿的藥物，或者以治療有效量的miRNA抑制物和治療有效量的長(zhǎng)春新堿為藥效成分制備治療結(jié)直腸癌的藥物。用于拮抗腫瘤細(xì)胞耐長(zhǎng)春新堿的藥物組合物，除包含治療有效量的miRNA抑制物外，還可以包含常規(guī)的藥用輔料。用于治療結(jié)直腸癌的藥物組合物，除包含治療有效量的miRNA抑制物和治療有效量的長(zhǎng)春新堿外，還可以包含常規(guī)的藥用輔料。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明首次通過試驗(yàn)證實(shí)SEQIDNO:1所示miRNA序列與長(zhǎng)春新堿的耐藥性相關(guān)，miRNA在長(zhǎng)春新堿耐藥細(xì)胞中高表達(dá)、敏感細(xì)胞中低表達(dá)，因此可以作為腫瘤細(xì)胞長(zhǎng)春新堿耐藥的標(biāo)志物。根據(jù)該標(biāo)志物設(shè)計(jì)的引物、試劑盒及檢測(cè)方法可用于臨床判斷腫瘤細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿的耐藥性，進(jìn)一步指導(dǎo)臨床用藥并實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療，提高療效，降低副作用。本發(fā)明為設(shè)計(jì)腫瘤細(xì)胞長(zhǎng)春新堿耐藥藥物提供了新的靶點(diǎn)，可用于直接開發(fā)拮抗腫瘤細(xì)胞長(zhǎng)春新堿耐藥性的藥物。又由于miRNA抑制物具有降低腫瘤細(xì)胞耐藥的生物學(xué)功能，將其與治療有效量的長(zhǎng)春新堿聯(lián)合使用，可以提高癌癥的化療效果，為有效逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞長(zhǎng)春新堿耐藥以及提高腫瘤細(xì)胞的臨床化療效果提供有效途徑。附圖說明圖1為結(jié)腸癌細(xì)胞原代消化后在VCR下的細(xì)胞存活率；圖2為結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8及HCT-8/VCR在不同VCR濃度下的相對(duì)存活率；圖3為HCT-8、HCT-8/VCR細(xì)胞中miRNA的表達(dá)水平；圖4為HCT-8細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA模擬物(minics)后對(duì)長(zhǎng)春新堿的耐藥能力；圖5為HCT-8/VCR細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA抑制物(inhibitor)后對(duì)長(zhǎng)春新堿的耐藥能力。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例僅對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。實(shí)施例1用于檢測(cè)與結(jié)直腸癌長(zhǎng)春新堿耐藥相關(guān)的miRNA表達(dá)的引物，根據(jù)該miRNA序列(如SEQIDNO:1所示)設(shè)計(jì)合成，包括逆轉(zhuǎn)錄引物和熒光定量PCR引物，逆轉(zhuǎn)錄引物如SEQIDNO:2、3或4所示，熒光定量PCR引物的正向引物如SEQIDNO:5或6所示，反向引物如SEQIDNO:7所示。實(shí)施例2用于檢測(cè)與結(jié)直腸癌長(zhǎng)春新堿耐藥相關(guān)的miRNA表達(dá)的試劑盒，包含實(shí)施例1中引物、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑和熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑。實(shí)施例3用于檢測(cè)與結(jié)直腸癌長(zhǎng)春新堿耐藥相關(guān)的miRNA表達(dá)的試劑盒，包含實(shí)施例1中引物、內(nèi)參U6snRNA的逆轉(zhuǎn)錄引物和熒光定量PCR引物，以及DNA消化試劑(DNaseI(RNase-free)、EDPC等)、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑(逆轉(zhuǎn)錄酶、RTbuffer、dNTPmix等)和熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑(dNTPmix、SYBRGreenPCRMasterMix等)。內(nèi)參U6snRNA的逆轉(zhuǎn)錄引物如SEQIDNO:8所示，熒光定量PCR的正、反向引物分別如SEQIDNO:9、10所示。實(shí)施例4檢測(cè)與結(jié)直腸癌長(zhǎng)春新堿耐藥相關(guān)的miRNA表達(dá)的方法，包括以下步驟：1)引物設(shè)計(jì)根據(jù)miRNA序列設(shè)計(jì)合成如下引物：miRNA序列：5′-CACGUGAAACCCUGUCUG-3′；逆轉(zhuǎn)錄引物：逆轉(zhuǎn)錄引物1：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCAGACAGG-3′；逆轉(zhuǎn)錄引物2：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCAGACAG-3′；逆轉(zhuǎn)錄引物3：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCAGACA-3′；熒光定量PCR引物：正向引物1：5′-ACACTCCAGCTGGGCACGTGAAACCCT-3′；正向引物2：5′-ACACTCCAGCTGGGCACGTGAAACCC-3′；反向引物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGT-3′。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中U6snRNA管家基因(Genbank:NR_004394.1)設(shè)計(jì)如下引物：U6snRNA的逆轉(zhuǎn)錄引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；U6snRNA的熒光定量PCR引物：U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；U6反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。2)結(jié)腸癌組織細(xì)胞的制備選取新鄉(xiāng)某醫(yī)院收治的19例結(jié)腸癌患者的結(jié)腸癌組織，病理分型確定，未經(jīng)任何化療；選取的結(jié)腸癌組織應(yīng)盡可能避免纖維結(jié)締組織或壞死的瘤組織，并立刻放到液氮中；在超凈工作臺(tái)上去除纖維結(jié)締組織或壞死的瘤組織，用10mLPBS清洗組織3遍，吸棄上清液，將結(jié)腸癌組織切成1.5mm3小塊(1～2mm3均可)，用10mLPBS輕懸組織塊，吸棄上清液；加入10mL預(yù)溫到37℃的0.1％膠原酶溶液，37℃消化45min(30～60min均可)，直至完全消化；終止消化，用100目篩網(wǎng)過濾，濾液500g離心9min(8～10min均可)，棄上清；用10mLPBS輕輕吹打，懸浮沉淀，濾液500g離心9min(8～10min均可)，棄上清；重復(fù)一次；用2.5mLRMPI-1640培養(yǎng)基輕輕吹打(2～3mL均可)，懸起沉淀，調(diào)整細(xì)胞濃度5×105～1×106/mL。3)MTT瓊脂法體外藥敏實(shí)驗(yàn)將5mL預(yù)溫到37℃的2×RMPI-1640培養(yǎng)基與5mL1.5％高壓滅菌后冷卻到50℃的瓊脂混勻，混勻后加入到96孔板中(每孔100μL)，室溫靜置30min備用；按照100μL細(xì)胞懸液加入150ng/mL濃度的長(zhǎng)春新堿，接種于96孔板中，每種藥物濃度三復(fù)孔，設(shè)立背景對(duì)照組(不含細(xì)胞的等體積培養(yǎng)液)，空白對(duì)照組加入不含VCR的培養(yǎng)液；37℃、5％CO2培養(yǎng)72小時(shí)后，MTT測(cè)細(xì)胞活性；96孔板中，每孔加入20μL5mg/mL的MTT溶液，37℃孵育4h；每孔加入100μL含10％SDS的PBS，60℃孵育30min；560nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。計(jì)算背景組平均值，并以此平均值為零點(diǎn)進(jìn)行調(diào)零，計(jì)算各組細(xì)胞的存活率。細(xì)胞存活率/％＝(試驗(yàn)組平均OD值-背景組平均OD值)/(空白對(duì)照組平均OD值-背景組平均OD值)×100％。以150ng/mL濃度的長(zhǎng)春新堿處理19例原代培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞，按照存活率小于40％作為敏感，大于70％作為耐藥的判斷指標(biāo)，介于40～70％的不做進(jìn)一步分析；結(jié)果表明，在19例原代培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞中，有13例判斷為敏感或耐藥的樣本，其中8例樣本是對(duì)VCR耐藥的，5例是敏感的(見圖1)。4)提取RNA選取13例上述敏感或耐藥的結(jié)腸癌原代細(xì)胞(5～10×106個(gè)/mL，見表1)，離心，棄上清；用移液管加入1mL提前預(yù)冷的Trizol試劑，反復(fù)吹打裂解細(xì)胞至均一透亮；將勻漿樣品在冰上放置5分鐘，保證細(xì)胞充分裂解；加入200μL氯仿，劇烈渦旋30秒后，室溫靜置5分鐘；4℃、12000×g離心15分鐘；小心轉(zhuǎn)移上清至1.5mLRNase-free離心管中，加入等體積異丙醇混勻；4℃、12000×g離心15分鐘，棄上清；加入750μL75％乙醇，4℃、12000×g離心5分鐘，棄上清；乙醇風(fēng)干后，加入45μLDEPC處理水，室溫靜置2分鐘溶解RNA；變性電泳檢測(cè)后測(cè)定濃度為1.8μg/μL，待用(或-80℃保存)。提取過程在冰上操作，以防止RNA降解；全程佩戴一次性手套；采用無RNA酶的非一次性玻璃器皿或塑料器皿，玻璃器皿可在150℃烘箱中烘烤4小時(shí)，塑料器皿可在0.5MNaOH溶液中浸泡10分鐘，用水徹底漂洗干凈后高壓滅菌備用。5)DNaseI處理配制10μLDNaseI處理體系：RNA(1.8μg/μL)1μg，10×Buffer(400mMTris-HCl(pH7.5)、80mMMgCl2、50mMDTT)1μL，70U/μL(60～80U/μL均可)DNaseI(RNase-free)1μL，0.1％DEPC處理水補(bǔ)足至10μL。處理?xiàng)l件為：37℃水浴30min，65℃水浴10min滅活DNaseI。6)逆轉(zhuǎn)錄配制20μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：5×RTbuffer(250mMTris-HCl(pH8.3)、375mMKCl、15mMMgCl2、50mMDTT)4μL，200U/μL逆轉(zhuǎn)錄酶1μL，10μMmiRNA的逆轉(zhuǎn)錄引物10.5μL，10μMU6snRNA的逆轉(zhuǎn)錄引物0.5μL，dNTPmix(2.5mMeach)2.5μL，RNA(1.0μg/μL)1μL，無RNA酶水補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件為：16℃30min，42℃30min，85℃滅活逆轉(zhuǎn)錄酶5min；反應(yīng)結(jié)束后將其放在冰上待用或-20℃保存。7)Real-timePCR配制20μL熒光定量PCR反應(yīng)體系：2×SYBRGreenPCRMasterMix(購自ABI公司)10μL，1.0μg/μLcDNA1μL，10μMmiRNA的正向引物1和反向引物各0.5μL，dNTPmix(2.5mMeach)2.5μL，10μMU6snRNA的正、反向引物各0.5μL，雙蒸水補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件為：95℃變性5min，40個(gè)循環(huán)(95℃15s，60℃15s，72℃20s，78℃20s，95℃15s)。8)miRNA表達(dá)量統(tǒng)計(jì)分析采用相對(duì)定量法，計(jì)算基因的表達(dá)量F，公式如下：F＝2—△Δct；式中，△Δct＝(待測(cè)樣本中目的基因的ct的平均值-待測(cè)樣本中管家基因的ct的平均值)-(對(duì)照樣本中目的基因的ct的平均值-對(duì)照樣本中管家基因的ct的平均值)。選取上述2號(hào)對(duì)VCR敏感的樣本miRNA的表達(dá)水平作為對(duì)照，設(shè)置為1，其他各樣板相對(duì)2號(hào)樣本的比值作為miRNA表達(dá)水平。結(jié)果表明，miRNA在VCR耐藥的細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)，表達(dá)量比敏感細(xì)胞樣本明顯上調(diào)(見下表1)。表1原代結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥性及miRNA的相對(duì)表達(dá)水平樣本編號(hào)耐藥性miRNA表達(dá)水平1耐藥2.352敏感1.03耐藥2.196耐藥2.867敏感0.908敏感0.8710耐藥3.1211敏感0.9113敏感0.9314耐藥2.7815耐藥2.7316耐藥3.0218耐藥2.64實(shí)施例5miRNA在制備拮抗腫瘤細(xì)胞耐長(zhǎng)春新堿的藥物中的應(yīng)用，具體為：根據(jù)miRNA序列(如SEQIDNO:1所示)設(shè)計(jì)合成miRNA的反義寡核苷酸序列作為抑制物(由吉滿生物科技上海有限公司合成，序列如SEQIDNO:11所示)，以治療有效量的miRNA抑制物和藥用輔料為原料制備片劑。miRNA在制備治療結(jié)直腸癌的藥物中的應(yīng)用，以治療有效量的miRNA抑制物(同上)、治療有效量的長(zhǎng)春新堿和藥用輔料為原料制備片劑。實(shí)施例6用于拮抗腫瘤細(xì)胞耐長(zhǎng)春新堿的藥物組合物，由治療有效量的miRNA抑制物和藥用輔料組成。用于治療結(jié)直腸癌的藥物組合物，由治療有效量的miRNA抑制物、治療有效量的長(zhǎng)春新堿和藥用輔料組成。試驗(yàn)例1長(zhǎng)春新堿在結(jié)腸癌的治療過程中發(fā)揮著重要作用，但出現(xiàn)的耐藥現(xiàn)象是限制其臨床療效的主要原因。明確SEQIDNO:1所示miRNA在結(jié)腸癌細(xì)胞長(zhǎng)春新堿耐藥中的生物學(xué)功能和機(jī)制，能夠?yàn)橛行岣呓Y(jié)腸癌的臨床療效提供新的生物靶標(biāo)。1、miRNA在長(zhǎng)春新堿耐藥細(xì)胞和敏感細(xì)胞中的表達(dá)1)構(gòu)建長(zhǎng)春新堿耐藥細(xì)胞系HCT-8/VCR采用逐步增加VCR濃度的方法建立結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-8/VCR：將敏感細(xì)胞HCT-8培養(yǎng)于含VCR的培養(yǎng)液中，初始濃度為5ng/mL，此后逐漸增加藥物濃度，分別為10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、3000ng/mL和4000ng/mL；在每個(gè)濃度獲得耐藥性后，以極限稀釋法克隆生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，然后進(jìn)入下一個(gè)濃度的培養(yǎng)，最后HCT-8在2000ng/mL的VCR中持續(xù)培養(yǎng)20代以上，于試驗(yàn)前1周停用VCR。2)細(xì)胞對(duì)VCR的藥敏性測(cè)試(MTT法)分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的耐藥株和敏感株細(xì)胞，通過培養(yǎng)基稀釋法用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL；以1×104個(gè)/孔接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，設(shè)立背景對(duì)照組(不含細(xì)胞的等體積培養(yǎng)液)，空白對(duì)照組加入不含VCR的培養(yǎng)液，試驗(yàn)組分別加入含10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、3000ng/mL、4000ng/mL的長(zhǎng)春新堿培養(yǎng)液，100μl/孔。各組細(xì)胞于37℃下溫育培養(yǎng)48h，每孔加入5mg/mLMTT溶液20μL，繼續(xù)放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中溫育4h；然后用移液器吸棄培養(yǎng)上清液，每孔加入DMSO150μL，充分振蕩后，將培養(yǎng)板放入酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀中，設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)為570nm，讀取各孔的吸光度值(OD)。計(jì)算背景組平均值，并以此平均值為零點(diǎn)進(jìn)行調(diào)零，計(jì)算各組細(xì)胞的存活率，然后計(jì)算50％細(xì)胞存活時(shí)的藥物濃度，即半數(shù)抑制濃度IC50。細(xì)胞存活率/％＝(試驗(yàn)組平均OD值-背景組平均OD值)/(空白對(duì)照組平均OD值-背景組平均OD值)×100％。使用不同濃度的VCR處理結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8及HCT-8/VCR，抑制率見圖2。HCT-8細(xì)胞和HCT-8/VCR細(xì)胞的半抑制濃度IC50分別為143.739和1982.194。3)檢測(cè)HCT-8、HCT-8/VCR細(xì)胞中miRNA的表達(dá)量操作同實(shí)施例4中步驟4)～8)；結(jié)果顯示，與HCT-8細(xì)胞相比，miRNA在HCT-8/VCR細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)，表達(dá)量比HCT-8細(xì)胞上調(diào)1.925倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，如圖3所示。2、細(xì)胞增殖-毒性試驗(yàn)檢測(cè)HCT-8細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA模擬物后的耐藥特性將生長(zhǎng)活躍的HCT-8細(xì)胞懸液于轉(zhuǎn)染前一天接種到12孔板中；第二天，轉(zhuǎn)染miRNA模擬物(25nM，由吉滿生物科技上海有限公司合成)，8小時(shí)后消化細(xì)胞，并分盤到96孔板中；加入長(zhǎng)春新堿(終濃度分別為10ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL和3000ng/mL)；48小時(shí)后，取出96孔板，向每孔加入10μLCCK8溶液(注意不要在孔中生成氣泡，以免影響OD值讀數(shù))；將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3小時(shí)，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度值。若暫時(shí)不測(cè)定OD值，可以向每孔中加入10μL1％(w/v)SDS溶液，并在室溫條件下避光保存，24小時(shí)內(nèi)測(cè)定則吸光度不發(fā)生變化。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miRNA模擬物的HCT-8的細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿的耐藥能力顯著高于未轉(zhuǎn)染組(見圖4)，說明miRNA能夠提高結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿的耐藥能力。3、細(xì)胞增殖-毒性試驗(yàn)檢測(cè)HCT-8/VCR細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA抑制物后的耐藥特性將生長(zhǎng)活躍的HCT-8/VCR細(xì)胞懸液于轉(zhuǎn)染前一天接種到12孔板中；第二天，轉(zhuǎn)染miRNA抑制物(25nM，由吉滿生物科技上海有限公司合成)，8小時(shí)后消化細(xì)胞，并分盤到96孔板中；加入長(zhǎng)春新堿(終濃度分別為10ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL和3000ng/mL)；48小時(shí)后取出96孔板，向每孔加入10μLCCK8溶液(注意不要在孔中生成氣泡，以免影響OD值讀數(shù))；將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3小時(shí)，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度值。若暫時(shí)不測(cè)定OD值，可以向每孔中加入10μL1％(w/v)SDS溶液，并在室溫條件下避光保存，24小時(shí)內(nèi)測(cè)定則吸光度不發(fā)生變化。結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照組未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染miRNA抑制物的HCT-8/VCR細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿的耐藥能力顯著降低(見圖5)，說明miRNA抑制物能夠在一定程度上逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿的耐藥能力，也進(jìn)一步證明miRNA與結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿的耐藥能力密切相關(guān)。試驗(yàn)例2選取某醫(yī)院2013～2015年62例結(jié)腸癌病例，提取石蠟標(biāo)本中的miRNA，采用實(shí)施例4中方法檢測(cè)SEQIDNO:1所示miRNA的表達(dá)量。結(jié)果顯示，該方法能夠特異、有效地?cái)U(kuò)增出miRNA序列。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，35例病例標(biāo)本中miRNA表達(dá)量平均為8.862±1.530，其余27例標(biāo)本中miRNA表達(dá)量平均為4.138±0.782，表達(dá)量相差2.14倍(P<0.01)。結(jié)合臨床治療效果分析，miRNA表達(dá)量高的樣本采用長(zhǎng)春新堿治療結(jié)腸癌的效果較差，而表達(dá)量低的樣本采用長(zhǎng)春新堿治療的效果較好，這也進(jìn)一步證實(shí)了miRNA的表達(dá)與結(jié)腸癌對(duì)長(zhǎng)春新堿的耐藥性有關(guān)。上述實(shí)施例及試驗(yàn)例中所用細(xì)胞系、試劑等均為市售商品。HCT-8細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。本發(fā)明提供的試劑盒及檢測(cè)方法可用于臨床判斷結(jié)腸癌對(duì)長(zhǎng)春新堿的耐藥性，進(jìn)一步指導(dǎo)臨床用藥并實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療，提高療效，降低副作用。需要說明的是，說明書中所列實(shí)施例僅用于理解發(fā)明技術(shù)方案，不具有任何限制作用。除了上述實(shí)施例外，還可以有其他實(shí)施方式。凡是采用等同替換或等效變換形成的任何技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍內(nèi)。序列表SEQUENCELISTING<110>新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院<120>用于檢測(cè)與結(jié)直腸癌長(zhǎng)春新堿耐藥相關(guān)的miRNA表達(dá)的引物、試劑盒、方法及應(yīng)用<170>PatentInversion3.5<211>18<212>RNA<213>序列<221>miRNA序列<222>(1)..(18)<400>1CACGUGAAACCCUGUCUG18<211>44<212>DNA<213>序列<221>逆轉(zhuǎn)錄引物1<222>(1)..(44)<400>2CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCAGACAGG44<211>43<212>DNA<213>序列<221>逆轉(zhuǎn)錄引物2<222>(1)..(43)<400>3CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCAGACAG43<211>42<212>DNA<213>序列<221>逆轉(zhuǎn)錄引物3<222>(1)..(42)<400>4CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCAGACA42<211>27<212>DNA<213>序列<221>熒光定量PCR的正向引物1<222>(1)..(27)<400>5ACACTCCAGCTGGGCACGTGAAACCCT27<211>26<212>DNA<213>序列<221>熒光定量PCR的正向引物2<222>(1)..(26)<400>6ACACTCCAGCTGGGCACGTGAAACCC26<211>20<212>DNA<213>序列<221>熒光定量PCR的反向引物<222>(1)..(20)<400>7CTCAACTGGTGTCGTGGAGT20<211>23<212>DNA<213>序列<221>內(nèi)參U6snRNA的逆轉(zhuǎn)錄引物<222>(1)..(23)<400>8CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT23<211>20<212>DNA<213>序列<221>內(nèi)參U6snRNA的正向引物<222>(1)..(20)<400>9CTCGCTTCGGCAGCACA17<211>20<212>DNA<213>序列<221>內(nèi)參U6snRNA的反向引物<222>(1)..(20)<400>10AACGCTTCACGAATTTGCGT20<211>18<212>RNA<213>序列<221>miRNA抑制物序列<222>(1)..(18)<400>11CAGACAGGGUUUCACGUG18當(dāng)前第1頁1 2 3