一種彎曲菌六重pcr檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及細菌檢測技術領域，具體地說設及檢測空腸彎曲菌、結腸彎曲菌、胎兒 彎曲菌、海聘彎曲菌和烏普薩拉彎曲菌的六重PCR檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 彎曲菌是主要的食源性病原菌，其感染導致的疾病稱為彎曲菌病，屬于人類新發(fā) 傳染病之一。目前，歐美國家彎曲菌的感染被列為食源性病原菌感染的首位，其感染率顯著 超過其他食源性病原菌。除腸炎外，空腸彎曲菌的感染可W導致格林-己利綜合征(GBS)。 GBS是一種自身免疫導致急性神經肌肉擁痕，殘疾率7~15 %，死亡率3 %~10 %，目前沒有 特效藥物，疾病負擔嚴重。美國將可導致GBS空腸彎曲菌列為生物恐怖病原之一。
[0003] 目前研究發(fā)現導致人類彎曲菌病的彎曲屬的主要菌種是空腸彎曲菌和結腸彎曲 菌。此外，胎兒彎曲菌、海聘彎曲菌和烏普薩拉彎曲菌同樣可W導致人類的感染病引起疾 病。彎曲菌屬內不同菌種鑒定技術的建立對于彎曲菌的研究具有重要意義。
[0004] 目前無論腹瀉患者W及動物的糞便標本W及不同的食物標本中，不僅可W檢測到 空腸彎曲菌和結腸彎曲菌，還同時可W檢出彎曲菌屬的其它菌種，最常見的是胎兒彎曲菌、 海聘彎曲菌和烏普薩拉彎曲菌。研究發(fā)現彎曲菌屬內不同菌種的耐藥特征及致病特點各有 不同，屬內菌種的鑒定對于彎曲菌感染的防控和治療具有重要的意義。目前關于彎曲菌屬 內不同菌種的鑒定大多依賴于生化反應的特點W及針對不同菌種的PCR技術，鑒定過程復 雜繁瑣。為保障人民食品健康安全，針對不同食源性彎曲菌感染采取積極有效的防控措施， 迫切需要一種能夠快速、準確、廣譜鑒定彎曲菌屬內菌種的方法。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種彎曲菌六重PCR檢測試劑盒。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種檢測五種彎曲菌的方法，所述五種彎曲菌分別 為:空腸彎曲菌、結腸彎曲菌、胎兒彎曲菌、海聘彎曲菌和烏普薩拉彎曲菌。
[0007] 本發(fā)明的技術方案主要包括W下兩個方面：（1)通過16SRNA基因的DNA序列的比 對，獲得彎曲菌屬內特異核酸片段；（2)利用BLASTn與vector N口 suite 6.0軟件對所有特 異基因的DNA序列進行比對，NCBI數據庫篩查，確定DNA序列特異性，確定6條特異序列片段； (3)通過引物設計軟件W及多種PCR優(yōu)化技術優(yōu)化PCR條件，建立六重PCR技術，一次PCR完成 包括彎曲菌屬及屬內五種菌種的鑒定。
[000引具體地，本發(fā)明提供了檢測彎曲菌的引物組合，含有6對引物，其核巧酸序列如SEQ ID NO. 1-12所示。
[0009]本發(fā)明提供了上述引物組合在制備彎曲菌檢測試劑盒或檢測試劑中的應用。
[0010]本發(fā)明提供了核巧酸序列如SEQ ID NO. 1-2所示的引物對在檢測彎曲菌中的應用 或在制備檢測彎曲菌試劑盒中的應用。
[0011]本發(fā)明提供了核巧酸序列如SEQ ID NO.3-4所示的引物對在檢測空腸彎曲菌中的 應用或在制備檢測空腸彎曲菌試劑盒中的應用。
[0012] 本發(fā)明提供了核巧酸序列如SEQ ID NO.5-6所示的引物對在檢測結腸彎曲菌中的 應用或在制備檢測結腸彎曲菌試劑盒中的應用。
[0013] 本發(fā)明提供了核巧酸序列如SEQ ID NO.7-8所示的引物對在檢測胎兒彎曲菌中的 應用或在制備檢測胎兒彎曲菌試劑盒中的應用。
[0014] 本發(fā)明提供了核巧酸序列如SEQ ID NO.9-10所示的引物對在檢測海聘彎曲菌中 的應用或在制備檢測海聘彎曲菌試劑盒中的應用。
[0015] 本發(fā)明提供了核巧酸序列如SEQ ID NO.11-12所示的引物對在檢測烏普薩拉彎曲 菌中的應用或在制備檢測烏普薩拉彎曲菌試劑盒中的應用。
[0016] 本發(fā)明提供一種彎曲菌檢測試劑盒，含有沈Q ID NO. 1-2、SEQ ID NO.3-4、SEQ ID ^.5-6、569 10^.7-8、569 10^.9-10和/或沈9 10^.11-12所示的引物對。
[0017]進一步地，本發(fā)明提供一種彎曲菌檢現聯劑盒，含有沈Q ID NO. 1-12所示引物。
[0018] 更進一步地，本發(fā)明提供的彎曲菌檢測試劑盒能夠鑒定空腸彎曲菌、結腸彎曲菌、 胎兒彎曲菌、海聘彎曲菌和烏普薩拉彎曲菌。
[0019] 本發(fā)明的試劑盒，使用本發(fā)明提供的上述引物組合對待現蜘菌DNA進行PCR檢測，
[0020] 當PCR擴增片段出現81化p+3(K)bp的兩條帶時，菌株鑒定為空腸彎曲菌；
[0021] 當PCR擴增片段出現81化p+5(K)bp的兩條帶時，菌株鑒定為結腸彎曲菌；
[0022] 當PCR擴增片段出現81化P+43化P的兩條帶時，菌株鑒定為胎兒彎曲菌；
[0023] 當PCR擴增片段出現81化P+25化P的兩條帶時，菌株鑒定為海聘彎曲菌；
[0024] 當PCR擴增片段出現81化p+2(K)bp的兩條帶時，菌株鑒定為烏普薩拉彎曲菌。
[00巧]所述PCR的反應程序為：
[0026] 94°C5min；
[0027] 94°C Imin，64°C Imin，72 °C Imin，共 2個循環(huán)；
[0028] 94°C Imin，62 °C Imin，72 °C Imin，共 2個循環(huán)；
[00 巧]94°C Imin，60 °C Imin，72 °C Imin，共 2個循環(huán)；
[0030] 94°C Imin，58°C Imin，72°C Imin，共 2個循環(huán)；
[0031] 94°C Imin，56°C Imin，72°C Imin，共 2個循環(huán)；
[0032] 94°C Imin，54°C Imin，72 °C Imin，共 30 個循環(huán)；
[0033] 72°C10min。
[0034] 本發(fā)明還提供了用于檢測彎曲菌的祀基因組合，含有6條特異性祀基因，其核巧酸 序列分別如SEQ ID NO. 13-18所示，其編碼的氨基酸序列分別如SEQ ID NO. 19-24所示。
[0035] 本發(fā)明提供了上述祀基因組合在制備檢測彎曲菌試劑盒中的應用。
[0036] 本發(fā)明提供了彎曲菌祀基因在制備檢測彎曲菌試劑盒中的應用，所述祀基因為 569 10側.13、569 10顯.14、569 10顯.15、569 10顯.16、569 10顯.17和/或沈9 10 NO.18。
[0037] 本發(fā)明進一步提供了檢測食品、糞便中彎曲菌的方法，使用核巧酸序列如SEQ ID NO. 1-12所示的引物，對待測食品、糞便中分離的菌株進行PCR檢測，
[003引當PCR擴增片段出現81化p+3(K)bp的兩條帶時，菌株鑒定為空腸彎曲菌；
[0039]當PCR擴增片段出現81化p+5(K)bp的兩條帶時，菌株鑒定為結腸彎曲菌；
[0040]當PCR擴增片段出現81化P+43化P的兩條帶時，菌株鑒定為胎兒彎曲菌；
[0041 ]當PCR擴增片段出現81化P+25化P的兩條帶時，菌株鑒定為海聘彎曲菌；
[0042] 當PCR擴增片段出現81化p+2(K)bp的兩條帶時，菌株鑒定為烏普薩拉彎曲菌。
[0043] 本發(fā)明W彎曲菌的特異DNA序列W及五種彎曲菌菌種(包括空腸彎曲菌、結腸彎曲 菌、胎兒彎曲菌、海聘彎曲菌和烏普薩拉彎曲菌)特異的DNA序列及引物序列，建立了高特異 度、并且穩(wěn)定的六重PCR檢測彎曲菌的方法，進一步建立檢測五種常見彎曲菌的試劑盒。本 發(fā)明方法靈敏度高、特異性強，靈敏度和特異度均達到100%。本發(fā)明所用到的6對引物的設 計均通過在NCBI數據庫中大量數據比對獲得，具有高度的種類保守性和種間特異性。本發(fā) 明方法無需分別采用屬內不同的彎曲菌特異引物分別進行PCR，通過六重PCR方法，一步法 實現對空腸彎曲菌、結腸彎曲菌、胎兒彎曲菌、海聘彎曲菌和烏普薩拉彎曲菌，極大地縮短 了檢測時間，降低檢測成本。
【附圖說明】
[0044] 圖1為本發(fā)明六重PCR方法檢測彎曲菌電泳結果圖。其中泳道從左到右依次： marker(DL2000)，空腸彎曲菌（816bp+300bp)，結腸彎曲菌（816bp巧OObp)，胎兒腸彎曲菌 (816bp+435bp)，海鳴腸彎曲菌(816bp巧50bp)，烏普薩控腸彎曲菌(816bp巧00bp)?及陰性 對照。
[0045] 圖2為空腸彎曲菌引物特異性及夷敏性篩查結果圖，其中泳道從左到右依次： Marker(DL2000)，陽性：C. jejuni，陰性：Escherichia coli大腸埃希菌，Microbacterium微 桿菌，Stenotrophomonas maltophiIia嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，DySgonomonas遞送諾莫司菌， Enterococcus faecium( 1)尿腸球菌（臨床分離株1) ,Enterobacter aerogenes產氣腸桿 菌，Enterococcus faecal is糞腸球菌，Leifsonia soIi雷夫宋尼亞索里菌，Lactococcus garvieae格氏乳球菌，Enterococcus faecium(2)尿腸球菌（臨床分