小麥條銹菌的定量檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種小麥條誘菌的定量檢測(cè)試劑盒及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 小麥條誘病的早期監(jiān)測(cè)與定量分析一直是該病害治理的重要環(huán)節(jié)之一。特別是在 小麥苗期條誘病處于潛育階段時(shí)，建立快速、準(zhǔn)確的測(cè)定方法，對(duì)該病害的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)和防 治具有重要的意義?？蒞在病害的潛育期盡早確定和預(yù)測(cè)病害的發(fā)生程度，并在病害未大 面積流行前，通過快速、準(zhǔn)確的早期監(jiān)測(cè)及時(shí)制定藥劑防治措施W降低初始菌源量，抑制或 減慢病害的發(fā)展。
[0003] 長(zhǎng)期W來(lái)，現(xiàn)有的監(jiān)測(cè)方法，如人工調(diào)查、葉片培養(yǎng)、遙感監(jiān)測(cè)等尚不能實(shí)現(xiàn)對(duì)病 原菌侵染后小麥葉片處于潛育狀態(tài)時(shí)侵染程度的準(zhǔn)確、快速的定量分析。近年來(lái)，分子生 物學(xué)技術(shù)的發(fā)展使得對(duì)病害的快速檢測(cè)成為可能，并開始應(yīng)用于小麥條誘病的早期檢測(cè)。 Zhao等、Cao等設(shè)計(jì)小麥條誘菌的特異性引物，利用普通PCR方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)條誘病的分子 檢測(cè)。此后，Wang等建立了PCR方法檢測(cè)侵入小麥葉片中的條誘菌的方法，Wang等進(jìn)一步 發(fā)展了巢式PCR的檢測(cè)方法。Real-timePCR是近些年來(lái)發(fā)展起來(lái)的可W定量檢測(cè)植物病 原菌的方法。Winton等利用巧光Real-timePCR在一管中同時(shí)檢測(cè)到多種病原菌。另外， Gachon等、Bohm等、Mercado-Bianco等都利用相同的方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)病原菌在寄主植物內(nèi)動(dòng) 態(tài)變化的追蹤?；痑aije等利用Real-timePCR開展了小麥條誘菌的研究工作，不過引物最 低可檢測(cè)的病原菌量?jī)H為40pg。
[0004] 目前國(guó)內(nèi)外開展了一些對(duì)小麥條誘病病原菌的定性檢測(cè)研究，尚未見小麥條誘病 早期定量監(jiān)測(cè)方法的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽(yáng)0化]本研究通過比較普通PCR和Real-timePCR方法在早期檢測(cè)小麥條誘病方面的優(yōu) 缺點(diǎn)，建立SYBRGreenI方法，W定量測(cè)定小麥條誘病菌在潛育狀態(tài)下的侵染量，為該病害 的早期預(yù)測(cè)和防治決策提供依據(jù)。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0007] 用于定量檢測(cè)小麥條誘菌的試劑盒，包括巧光定量PCR擴(kuò)增的常規(guī)試劑，其特征 在于，還包括檢測(cè)條誘菌的引物；所述引物的正向和反向的核巧酸序列如下：
[0008] osgQ607/osgQ608 ：
[0009] GGATGCCTCGAAGGGTTATACC/TGCTAGATACAATGGCACATCTGA。
[0010] 所述巧光定量PCR擴(kuò)增的常規(guī)試劑包括：2XSGPCRMasterMix和/或2XSG GreenqPCRMix,W及雙蒸水。
[0011] 一種定量檢測(cè)小麥條誘菌的方法，其特征在于，包括如下步驟：
[0012] (1)獲取標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：
[0013] 所述標(biāo)準(zhǔn)曲線方程是W系列DM標(biāo)準(zhǔn)品的梯度拷貝數(shù)濃度為橫坐標(biāo)，w采用引物 osgQ607/osgQ608對(duì)所述系列DNA標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行巧光定量PCR擴(kuò)增所得的Ct值為縱坐標(biāo) 繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合得出的方程；
[0014] (2)采用引物osgQ607/osgQ608對(duì)提取自待測(cè)樣品的曲NA進(jìn)行巧光定量PCR擴(kuò) 增；
[0015] (3)收集待測(cè)樣品DNA的巧光定量PCR擴(kuò)增的巧光信號(hào)，根據(jù)所述闊值確定待測(cè)樣 品DNA的Ct值；
[0016] (4)將待測(cè)樣品DNA的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得待測(cè)樣品DNA的拷貝數(shù)濃度；
[0017] 所述DNA標(biāo)準(zhǔn)品為條誘菌曲NA的普通PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；所述待測(cè)樣品為 小麥曲NA;所述引物osgQ607/osgQ608 的序列如下：GGATGCCTCGAAGGGTTATACC/ TGCTAGATACAATGGCACATCTGA。
[0018] 所述巧光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：2XSG Green qPCRMix:0. 5yl/yl，所述 引物正向和反向各為：〇. 25iiM，DNA模板：0.05^1/^1，其余為雙蒸水。
[0019] 所述巧光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性10分鐘；95°C變性20秒，60°C 退火延伸30秒，45個(gè)循環(huán)。 W20] 所述DNA模板為曲NA或W曲NA為模板的普通PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0021] 所述普通PCR擴(kuò)增是指W曲NA為模板，用所述引物osgQ607/osgQ608進(jìn)行的普通 PCR擴(kuò)增反應(yīng)；所述普通PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：2XSGPCRMasterMix:0. 5y1/y1，所述 引物正向和反向各為：〇. 25iiM，普通PCR擴(kuò)增產(chǎn)物：0.05^1/^1，其余為雙蒸水；反應(yīng)程序 為：94°C預(yù)變性10分鐘；94°C變性20秒，60°C退火延伸30秒，40個(gè)循環(huán)。
[0022] 本研究義用"GlassandDonaldson, 1995."報(bào)道的真菌保守基因引物E5t2a/Bt2b， 其核巧酸序列為：5' -GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3' /5'ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3'。 W小麥條誘菌、小麥葉誘菌、小麥桿誘菌等病原菌的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR比較擴(kuò)增。 擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果顯示，該引物在小麥條誘菌的DNA中擴(kuò)增出36化P長(zhǎng)度的片段，在小麥葉誘 菌、小麥桿誘菌的DNA中擴(kuò)增出的條帶都是49化P，具體見圖6, 7, 8。為了獲得能夠特異地 將條誘菌從葉誘、桿誘菌及其它類似麥類病原真菌中鑒別出來(lái)，需要進(jìn)一步設(shè)計(jì)特異引物。
[0023] 本發(fā)明根據(jù)小麥條誘菌（Pucciniastrii化rmis)的特異性片段362bp大小的 基因序列設(shè)計(jì)對(duì)該病原菌種具有特異性的引物0SgQ607/〇SgQ608，并分別在普通PCR和 Real-timePCR擴(kuò)增時(shí)對(duì)該引物的特異性和靈敏性進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明該引物對(duì)小麥條 誘菌特異性高，可穩(wěn)定擴(kuò)增出82bp的目標(biāo)條帶。應(yīng)用此特異性引物，建立了Real-timePCR 測(cè)定系統(tǒng)，定量測(cè)定了條誘菌在小麥葉片接種后組織內(nèi)的DM隨時(shí)間的變化。利用本發(fā)明 所述試劑盒中的所述引物，普通PCR和Real-timePCR擴(kuò)增的最低檢出限分別為lOpg和 Ifg。Real-timePCR的靈敏度為普通PCR的100倍。本發(fā)明還建立了Real-timePCR標(biāo)準(zhǔn) 曲線，用于定量測(cè)定侵染在小麥葉片內(nèi)條誘病病原菌的DNA。本發(fā)明基于AB口500巧光定量 擴(kuò)增儀，優(yōu)化Real-TimePCR反應(yīng)體系，成功地建立SYBRGreenI巧光染料法定量PCR檢 測(cè)體系。
[0024] 本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物與目前應(yīng)用于條誘病分子檢測(cè)的其他引物相比，更適用于 Real-timePCR的檢測(cè)。本發(fā)明中目標(biāo)菌在Real-timePCR的溶解曲線中顯示為單一產(chǎn)物 峰，無(wú)引物二聚體等非特異性帶干擾。在設(shè)計(jì)篩選引物的過程中發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增片段過長(zhǎng)的引物 雖然在普通PCR檢測(cè)中表現(xiàn)特異性，擴(kuò)增產(chǎn)物為單一片段，但在Real-timePCR檢測(cè)上可能 并不表現(xiàn)為單一產(chǎn)物；而本發(fā)明所選擇的引物，消除了其他引物在Real-time檢測(cè)上的缺 點(diǎn)。
[00巧]本發(fā)明提供的試劑盒和方法能相對(duì)準(zhǔn)確地定量測(cè)定小麥條誘菌在潛育狀態(tài)下的 侵染量，具有檢出限低、靈敏度好、特異性強(qiáng)、擴(kuò)增效率高等特點(diǎn)，為早期預(yù)測(cè)和防治小麥條 誘病提供了一種可靠的檢測(cè)手段。
【附圖說明】
[0026] 圖1是W梯度濃度的條誘菌曲NA的普通PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為系列DNA標(biāo)準(zhǔn)品為模 板，采用本發(fā)明所述試劑盒進(jìn)行巧光定量PCR擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增曲線圖及闊值。
[0027] 圖2是W梯度濃度的條誘菌曲NA的普通PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物作為系列DNA標(biāo)準(zhǔn)品為 模板，采用本發(fā)明所述試劑盒進(jìn)行巧光定量PCR擴(kuò)增獲得的烙解曲線圖。
[0028] 圖3是W梯度濃度的條誘菌曲NA的普通PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物作為系列DNA標(biāo)準(zhǔn)品為 模板，采用本發(fā)明所述試劑盒進(jìn)行巧光定量PCR擴(kuò)增獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0029] 圖4是采用本發(fā)明所述試劑盒對(duì)小麥樣品進(jìn)行巧光定量PCR擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增曲線 圖。
[0030] 圖5是采用本發(fā)明所述試劑盒對(duì)小麥樣品進(jìn)行巧光定量PCR擴(kuò)增獲得的烙解曲線 圖。
[0031] 圖6小麥條誘菌、葉誘菌和桿誘菌的曲NA的PCR比較擴(kuò)增結(jié)果，
[0032] 其中，點(diǎn)樣孔中的樣品從左至右依次為2個(gè)條誘、2個(gè)葉誘、2個(gè)桿誘；Marker條帶 大小從下往上依次為lOObp，250bp，500bp，750bp，lOOObp，2000bp。
[003引圖7小麥桿誘菌與葉誘菌的特異性DM片段比對(duì)結(jié)果， 陽(yáng)034]其中，6-1片段為小麥桿誘菌的特異性DNA片段，3-1片段為小麥葉誘菌的特異性DNA片段，其同源性為100%。
[003引圖8小麥條誘菌與葉誘菌的特異性DNA片段比對(duì)結(jié)果，
[0036] 其中，1-5片段為小麥條誘菌的特異性DNA片段，3-1片段為小麥葉誘菌的特異性 DNA片段，其同源性為31. 23%。
[0037] 圖9普通per驗(yàn)證本發(fā)明特異性引物的特異性：
[0038] 其中，泳道 1-5 :小麥條誘菌CY33,CY32,CY17,CY18,CY19 ;
[0039] 6-8,小麥葉誘菌PHT，THT，T皿；
[0040] 9-11，小麥桿誘菌 34C1,MFM;
[0041] 12-13,小麥白粉菌 1、10 ;
[0042] 14-15,小麥赤霉菌PH-1,PH-2 ;
[0043] 16-17,TCK;18,T化；19;TCT;20 ;d地20;Marker為肥B的LowMWDNALadder。
【具體實(shí)施方式】
[0044] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但并不限制本發(fā)明的范 圍。如無(wú)特殊說明，下述實(shí)施例中使用的操作均為常規(guī)方法，所采用的試劑均可W商購(gòu)獲 得。
[0045]牛物材料的夾源巧巧裁m化
[0046] 條誘菌CY33作為已知菌株可W商購(gòu)獲得；
[0047] 本發(fā)明采用的小麥?zhǔn)茉嚥牧蠟橐阎贩N明賢169,由中國(guó)農(nóng)科院植物保護(hù)研究所 麥類病害組保存，自申請(qǐng)日起二十年內(nèi)可向公眾發(fā)放用于實(shí)驗(yàn)研究。
[0048] 小麥病原真菌菌種及來(lái)源：小麥誘菌菌種CY33、CY32、CY17、CY18、CY19;小麥葉誘 菌菌種PHT、THT、T皿；小麥桿誘菌菌種34CUMFM;小麥白粉菌1、10 ;小麥赤霉菌菌種PH-1、 PH-2;小麥矮腥黑穗病菌TCK;光腥黑粉菌菌種T化；網(wǎng)腥黑粉菌菌種TCT，均為公眾已知菌 種，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所有保存，承諾自申請(qǐng)日起二十年內(nèi)可向公眾發(fā)放用于 實(shí)驗(yàn)研究。
[0049]豐要試劑 陽(yáng)化0] 2XSG PCR Master Mix購(gòu)自SinoGene，產(chǎn)品型號(hào)為#33-10201) ;2XSG Green qPCR Mix (with RO訝購(gòu)自SinoGene，產(chǎn)品型號(hào)為#22-10102 ;質(zhì)粒DM提取試劑盒；植物基 因組DM提取試劑盒；雙蒸水。 W引]豐要化器巧備
[0052]分光光度計(jì)度io地otometer，Elppendorf);定量PCR儀（StepOnePLUS，Applied Biosystems)。
[0053] 實(shí)施例1、采用真菌保守基因引物分析小麥誘菌
[0054] 參照"Glass and Donaldson,1995."報(bào)道的化2a/Bt2b其核巧酸序列為： 陽(yáng)化5] Bt2a :5' -GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3,（SeqIDNo.1)， 陽(yáng)化6] Bt2b:5'-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3'(SeqIDNo. 2)。
[0057] 對(duì)小麥條誘菌、葉誘菌和桿誘菌曲NA的進(jìn)行PCR分析，分析均在MJ Research,Inc.的PTC2220 型PC