背景技術(shù)：
：內(nèi)皮細(xì)胞對組織器官修復(fù)、血管新生具有非常重要的作用，而且是組織工程移植物再血管化的必要細(xì)胞成分。但是成熟內(nèi)皮細(xì)胞體外增殖能力有限，很難滿足體外再血管化的需要。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外增殖能力強(qiáng)，具有多向分化潛能，而且這些細(xì)胞分離方便，對嬰兒和母親沒有影響，可以凍存以便將來使用，所以，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在組織器官修復(fù)和心血管組織工程再血管化研究領(lǐng)域?qū)⒂蟹浅４蟮那熬?。我們采用酶消化法，成功從臍帶組織中分離出干細(xì)胞(武開宏，莫緒明，劉迎龍，盧士紅，韓忠朝。酶消化法分離臍帶干細(xì)胞。中華小兒外科雜志。2008；29(3)：159-162)。我們研究發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)劑內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(50ng/ml)的作用下，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞能夠分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，但是分化效率較低，只有約30％的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞能夠分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞(武開宏，莫緒明，盧士紅，韓忠朝。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究。中華小兒外科雜志2010；31(12)：954-6)。我們經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)劑中加入堿性成纖維細(xì)胞生長因子和表皮生長因子，能明顯提高臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的效率，分化效率由30％提高到50-70％，為組織器官修復(fù)研究和組織工程移植物再血管化研究，進(jìn)一步提高干細(xì)胞分化為內(nèi)血管皮細(xì)胞的效率，提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)資料。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
：采用膠原酶消化法分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。取培養(yǎng)分離的第5代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，接種于24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)板用Matrigel包被，血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化液含M199培養(yǎng)基，2％胎牛血清和50ng/ml血管內(nèi)皮生長因子。2周后，對誘導(dǎo)分化后的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行內(nèi)皮特異性抗體CD34檢測和攝取DiI-Ac-LDL檢測，觀測陽性細(xì)胞比例。在血管內(nèi)皮誘導(dǎo)培養(yǎng)液中加入堿性成纖維細(xì)胞生長因子和表皮生長因子，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞分化效率。同時確定誘導(dǎo)分化時間，為實(shí)際應(yīng)用中的濃度和時間提供參考基礎(chǔ)。確定可以用20ng/ml濃度的堿性成纖維細(xì)胞生長因子和10ng/ml表皮生長因子，能夠明顯提高臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的效率。

本發(fā)明為組織器官修復(fù)研究和組織工程移植物再血管化研究，提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)資料。本發(fā)明內(nèi)容未公開發(fā)表，本領(lǐng)域的相關(guān)技術(shù)人員如不花費(fèi)創(chuàng)造性勞動根本不可能根據(jù)現(xiàn)有的技術(shù)推斷得到本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法。

附圖說明：

圖1：分離培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞增殖能力旺盛，呈旋渦狀生長。

圖2：內(nèi)皮細(xì)胞定向誘導(dǎo)1周后，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞形成網(wǎng)格樣結(jié)構(gòu)。

圖3：2周后，免疫熒光染色示分化后的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮特異性抗體CD34，誘導(dǎo)分化效率30％。

圖4：加入堿性成纖維細(xì)胞生長因子和表皮生長因子后，流式細(xì)胞儀檢測內(nèi)皮特異性抗體CD144示血管內(nèi)皮細(xì)胞分化效率為50-70％。

具體實(shí)施方式：

1.采用酶消化法分離臍帶干細(xì)胞并進(jìn)行鑒定。流式細(xì)胞分析臍帶干細(xì)胞表達(dá)CD13、CD29、CD44、CD90、CD105、CD166和MHC-I，而不表達(dá)CD31、CD34和CD106，MHC-II。誘導(dǎo)前臍帶干細(xì)胞形態(tài)成典型的成纖維樣細(xì)胞形態(tài)，誘導(dǎo)2周后，細(xì)胞的形態(tài)不斷發(fā)生變化一些細(xì)胞的體積增大，空泡樣改變。取培養(yǎng)分離的第5代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)板用Matrigel包被，每孔接種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞5×10³個。內(nèi)皮誘導(dǎo)分化液為M199培養(yǎng)劑，2％胎牛血清，50ng/mlVEGF，100U/ml青、鏈霉素。每2天更換一次培養(yǎng)液，換液時取D-Hank’s輕輕沖洗細(xì)胞，去除死亡脫落的細(xì)胞，持續(xù)誘導(dǎo)2周，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)分化后的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮特異性抗體CD34并且攝取DiI-Ac-LDL檢測陽性(攝取DiI-Ac-LDL是成熟內(nèi)皮細(xì)胞具有的功能)，觀測陽性細(xì)胞比例約為30％。

2.在血管內(nèi)皮誘導(dǎo)培養(yǎng)液中加入堿性成纖維細(xì)胞生長因子和表皮生長因子，培養(yǎng)方法同方法1，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)分化后的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮特異性抗體CD34，具有攝取DiI-Ac-LDL功能，同時流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的效率提高到50-70％。同時，確定可以用20ng/ml濃度的堿性成纖維細(xì)胞生長因子和10ng/ml表皮生長因子來提高臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的效率。