促進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨再生關(guān)鍵基因高表達(dá)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域中的一種促進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨再生關(guān)鍵基因高表達(dá)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]骨組織缺損是因外傷、感染、腫瘤等因素使機(jī)體喪失一些骨質(zhì)從而形成較大間隙，這一問題在臨床較為常見并且較難處理。如何促進(jìn)骨組織缺損的修復(fù)，一直是該領(lǐng)域研究人員研究的重點(diǎn)。近年來，隨著骨組織工程技術(shù)的發(fā)展，這一問題得到了一定程度的解決。骨組織工程中種子細(xì)胞起著關(guān)鍵的作用。因此，種子細(xì)胞的選擇至關(guān)重要，早期研究人員選用骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞，但是這些種子細(xì)胞取材困難，容易對(duì)患者造成二次傷害，并且這些細(xì)胞體外擴(kuò)增能力較弱。此后，研究人員將種子細(xì)胞的目標(biāo)鎖定在了間充質(zhì)干細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化的潛能，在一定的條件下可分化為成骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞等成熟的細(xì)胞。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSC)是從臍帶組織中分離出來的一種間充質(zhì)干細(xì)胞，其具一下優(yōu)點(diǎn):臍帶組織來源廣泛，保證有充足的細(xì)胞來源;臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化的潛能;臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞免疫原性較低，不會(huì)引起患者自身的免疫排斥反應(yīng)。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞如同其它組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，其成骨誘導(dǎo)后決定骨再生的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子(0SteriX、RUNX)和骨再生早期典型代表因子(骨橋蛋白-0ΡΝ、堿性磷酸酶-ALP)的基因表達(dá)均上調(diào)，但是成骨誘導(dǎo)這一過程需要至少14天的時(shí)間。因此，如何縮短成骨誘導(dǎo)時(shí)間或避免成骨誘導(dǎo)的步驟，顯的尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種促進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨再生關(guān)鍵基因表達(dá)上調(diào)的培養(yǎng)體系，采用本發(fā)明的培養(yǎng)體系培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞依然保持著較高的干性;采用本發(fā)明的培養(yǎng)體系培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞用于骨組織工程治療骨缺損，避免了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨誘導(dǎo)的步驟，為臨床應(yīng)用骨組織工程治療骨缺損縮短了至少14天的時(shí)間。
[0004]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:
[0005]—種促進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨再生關(guān)鍵基因高表達(dá)的方法，步驟如下:
[0006]⑴臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離:獲取無菌的臍帶組織，無菌條件下剝離臍帶組織的外膜和臍帶組織內(nèi)動(dòng)、靜脈，分離出臍帶華通氏膠并剪碎至2-3_3，將剪碎的華通氏膠貼于培養(yǎng)瓶底面，l_4h后向培養(yǎng)瓶內(nèi)添加適量培養(yǎng)液，培養(yǎng)液分別采用a-MEM+10 %FBS和a-MEM+5%血小板裂解物+50mg/ml抗壞血酸+10nmol/L胰高血糖素樣肽-1 ；
[0007]⑵臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的消化、傳代，待臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞長至80%時(shí)，采用0.05%的胰蛋白酶+0.02%的EDTA對(duì)其進(jìn)行消化，以1 X 104cells/cm2傳至新的培養(yǎng)瓶中；
[0008]而且，取兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)的第三代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行流式鑒定，兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞陽性率均高于95%，陰性率均低于5% ;
[0009]而且，取第三代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，提取RNA-反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA-進(jìn)行Q-PCR，比較兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨再生相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Osterix和RUNX基因和骨再生早期典型代表因子基因0PN和ALP的表達(dá)量。
[0010]一種促進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨再生關(guān)鍵基因高表達(dá)體系，a-MEM+5 %血小板裂解物+50mg/ml抗壞血酸+10nmol/L胰高血糖素樣肽-1。
[0011]本發(fā)明的有益效果是:
[0012]⑴本發(fā)明采用一種新的培養(yǎng)體系，從臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞原代開始用該培養(yǎng)體系進(jìn)行培養(yǎng)，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)體系相比較，本發(fā)明采用的培養(yǎng)體系培養(yǎng)出的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)決定成骨再生的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子(OsteriX、RUNX)和骨再生早期典型代表因子(0PN、ALP)的基因明顯高表達(dá)。
[0013]⑵應(yīng)用本發(fā)明的培養(yǎng)體系可以促進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨再生的轉(zhuǎn)錄因子(OsteriX、RUNX)和骨再生早期典型代表因子(0PN、ALP)高表達(dá)，為骨缺損修復(fù)提供合適的種子細(xì)胞。
[0014]⑶本發(fā)明采用的一種新的培養(yǎng)方法，在臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞正常培養(yǎng)時(shí)使用本發(fā)明的培養(yǎng)體系，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在維持其原有干性的同時(shí)，決定成骨再生的相關(guān)因子的基因表達(dá)上調(diào)，為應(yīng)用骨組織工程治療骨缺損提供了必要的種子細(xì)胞，也為骨組織工程治療骨缺損縮短了時(shí)間。
[0015]⑷采用本發(fā)明的培養(yǎng)體系培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，提高了成骨再生關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子(Osterix、RUNX)和骨再生早期典型代表因子(0PN、ALP)的基因的表達(dá)；
[0016](5)采用本發(fā)明的培養(yǎng)體系培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞依然保持著較高的干性;采用本發(fā)明的培養(yǎng)體系培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞用于骨組織工程治療骨缺損，避免了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨誘導(dǎo)的步驟，為臨床應(yīng)用骨組織工程治療骨缺損縮短了至少14天的時(shí)間。
【附圖說明】
[0017]圖1為08七6^1的1111?熟表達(dá)水平(相對(duì)熒光強(qiáng)度)；
[0018]圖2為RUNX的mRNA表達(dá)水平(相對(duì)熒光強(qiáng)度)；
[0019]圖3為0ΡΝ的mRNA表達(dá)水平(相對(duì)熒光強(qiáng)度)；
[0020]圖4為ALP的的mRNA表達(dá)水平(相對(duì)熒光強(qiáng)度)；
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合附圖并通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0022]—種促進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨再生關(guān)鍵基因高表達(dá)的方法，步驟如下:
[0023]⑴臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離:獲取無菌的臍帶組織，無菌條件下剝離臍帶組織的外膜和臍帶組織內(nèi)動(dòng)、靜脈，分離出臍帶華通氏膠并剪碎至2-3_3，將剪碎的華通氏膠貼于培養(yǎng)瓶底面，l_4h后向培養(yǎng)瓶內(nèi)添加適量培養(yǎng)液，培養(yǎng)液分別采用a-MEM+10 %FBS和a-MEM+5%血小板裂解物+50mg/ml抗壞血酸+10nmol/L胰高血糖素樣肽-1 ；
[0024]⑵臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的消化、傳代，待臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞長至80%時(shí)，采用0.05%的胰蛋白酶+0.02%的EDTA對(duì)其進(jìn)行消化，以1 X 104cells/cm2傳至新的培養(yǎng)瓶中；
[0025]⑶取兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)的第三代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行流式鑒定，兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞陽性率均高于95%，陰性率均低于5% ;
[0026]⑷取培養(yǎng)到第三代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，提取RNA-反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA-進(jìn)行Q-PCR，比較兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨再生相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子(OsteriX、RUNX)和骨再生早期典型代表因子(0PN、ALP)基因的表達(dá)量。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種促進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨再生關(guān)鍵基因高表達(dá)的方法，其特征在于:步驟如下: ⑴臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離:獲取無菌的臍帶組織，無菌條件下剝離臍帶組織的外膜和臍帶組織內(nèi)動(dòng)、靜脈，分離出臍帶華通氏膠并剪碎至2-3_3，將剪碎的華通氏膠貼于培養(yǎng)瓶底面，l_4h后向培養(yǎng)瓶內(nèi)添加適量培養(yǎng)液，培養(yǎng)液分別采用a-MEM+10 %FBS和a-MEM+5 %血小板裂解物+50mg/ml抗壞血酸+10nmol/L胰高血糖素樣肽-1 ； ⑵臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的消化、傳代，待臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞長至80 %時(shí)，采用0.05 %的胰蛋白酶+0.02%的EDTA對(duì)其進(jìn)行消化，以1 X 104cells/cm2傳至新的培養(yǎng)瓶中。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨再生關(guān)鍵基因高表達(dá)的方法，其特征在于:取兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)的第三代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行流式鑒定，兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞陽性率均高于95%，陰性率均低于5%。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨再生關(guān)鍵基因高表達(dá)的方法，其特征在于:取第三代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，提取RNA-反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA-進(jìn)行Q-PCR，比較兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨再生相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Osterix和RUNX基因和骨再生早期典型代表因子基因0PN和ALP的表達(dá)量。4.一種促進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨再生關(guān)鍵基因高表達(dá)體系，其特征在于:a-MEM+5 %血小板裂解物+50mg/ml抗壞血酸+10nmol/L胰高血糖素樣肽-1。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種促進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨再生關(guān)鍵基因高表達(dá)的方法，步驟如下：臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離：獲取無菌的臍帶，經(jīng)過前處理用培養(yǎng)液重懸沉淀，計(jì)數(shù)，以1×106/cm2接種至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)液分別采用a-MEM+10％FBS和a-MEM+5％血小板裂解物+50mg/ml抗壞血酸+10nmol/L胰高血糖素樣肽-1。采用本發(fā)明的培養(yǎng)體系培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞用于骨組織工程治療骨缺損，避免了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨誘導(dǎo)的步驟，為臨床應(yīng)用骨組織工程治療骨缺損縮短了至少14天的時(shí)間。
【IPC分類】C12N5/0775
【公開號(hào)】CN105441388
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510933962
【發(fā)明人】趙剛, 馬潔, 劉微微, 高偉瑋
【申請(qǐng)人】天津市康婷生物工程有限公司
【公開日】2016年3月30日
【申請(qǐng)日】2015年12月15日