一種無血清的臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種無血清的臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng) 基。
【背景技術(shù)】
[0002] 臍帶間充質(zhì)干細胞是指存在于新生兒臍帶組織中的一種多能干細胞，細胞表面 強表達特異性標記⑶90,⑶73,⑶105,而不表達造血系或內(nèi)皮系細胞的標記⑶45、⑶14、 ⑶11、⑶34、⑶19,低表達或不表達主要組織相容性抗原HLA-DR。研究顯示，臍帶間充質(zhì)干 細胞具有較高的分化潛能，可向多個方向進行分化如骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、 內(nèi)皮和心肌等。與骨髓間充質(zhì)干細胞相比，臍帶間充質(zhì)干細胞含量和增殖能力均優(yōu)于后者， 且免疫原性低、取材方便、無倫理學(xué)爭議等優(yōu)點，因此在間充質(zhì)干細胞中具有更高的臨床應(yīng) 用價值。
[0003] 在實際臨床應(yīng)用中，無外源性污染和細胞數(shù)量是保證臍帶間充質(zhì)干細胞治療的必 要因素。目前，臍帶間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)體系大都含有動物血清（如胎牛血清），一方面由 于血清中不明蛋白的存在，對細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞表面標志形成干擾，另一方面采用添 加血清培養(yǎng)的干細胞進行體內(nèi)移植，可能引起病原體的交叉感染，因此需要開發(fā)化學(xué)成分 明確的無血清培養(yǎng)基。目前，市場上存在的無血清干細胞培養(yǎng)基用于培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細 胞培養(yǎng)時，一部分由于無血清培養(yǎng)基組成方面的不足，生長速度慢，容易出現(xiàn)老化的特征影 響細胞的大量擴增，一部分培養(yǎng)基中添加了昂貴的抗體等特殊因子，增加了臍帶間充質(zhì)干 細胞擴增成本。以上弊端一定程度上阻礙了臍帶間充質(zhì)干細胞的臨床治療應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)是解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種無血清的臍帶間充質(zhì)干細胞 培養(yǎng)基，克服血清外源性污染缺陷和細胞擴增數(shù)量與降低成本之間的矛盾問題。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案是按以下方式實現(xiàn)的，一種臍帶間充質(zhì)細胞在無血清的臍帶間 充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)及擴增的實驗方法，該實驗方法的步驟是：
[0006]( -）首先制備無血清的臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基，該無血清的臍帶間充質(zhì)干細 胞培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加成份；其中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基，添加成份及其含 量如下：
[0007] 堿性成纖維生長因子hFGF:l-20ng/mL;
[0008]表皮生長因子hEGF:1-20μg/mL;
[0009]胰島素hi:1-20μg/mL;
[0010]白血病抑制因子hLIF:0·l_5ng/mL;
[0011] L-谷氨酰胺;
[0012] 2-巰基乙醇：50-200μΜ;
[0013]亞硒酸鈉：20-50ηΜ;
[0014]轉(zhuǎn)鐵蛋白：10-30μg/mL;
[0015]人白蛋白：10_100mg/mL;
[0016]纖連蛋白：50-200μg/mL;
[0017] 黃芪多糖APS:50-200μg/mL。
[0018](二）臍帶間充質(zhì)細胞在上述培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)及擴增的實驗步驟是：
[0019]a.把經(jīng)常規(guī)法分離所得并液氮保存的臍帶間充質(zhì)干細胞凍存管從液氮中取出來， 立即投入37°C水浴鍋中，輕微搖動，2min內(nèi)即可溶解，同時預(yù)熱上述無血清的臍帶間充質(zhì) 干細胞培養(yǎng)基；
[0020] b.把經(jīng)37°C解凍后的臍帶間充質(zhì)干細胞吸到裝有9mL培養(yǎng)基的15mL的離心管 中，同時用培養(yǎng)液洗2次凍存管，一起加到離心管中吹勻，避免產(chǎn)生泡沫，然后250倍重力的 轉(zhuǎn)速離心5分鐘；
[0021] c.棄上清液，分別加2mL預(yù)熱的的上述培養(yǎng)基，輕輕吹勾，保證細胞完全懸浮起 來；將重懸的細胞接種到T25的培養(yǎng)瓶中，加入適量的培養(yǎng)液，再把細胞搖均勻，保證所有 的細胞能夠均勻的分布；
[0022] d.標好細胞種類和日期、培養(yǎng)基種類等，放入37 °C、5 %C02培養(yǎng)箱中；
[0023]e.細胞貼壁后換培養(yǎng)基，保證去除死細胞；
[0024] 培養(yǎng)皿中的細胞覆蓋率達到80%~90%時按1:3的比例傳代至細胞培養(yǎng)板中，傳 代使用的生長培養(yǎng)基為本發(fā)明培養(yǎng)基；顯微鏡下觀察臍帶間充質(zhì)干細胞生長狀況；拍照紀 錄；
[0025]f.傳至第2代時，MTT法檢測細胞活性繪制細胞生長曲線，具體操作：將生長至 80%融合度的第2代臍帶間充質(zhì)干細胞酶解懸浮，調(diào)整細胞濃度至IX104個/mL，加入24孔 板，每孔800μL，置于37°C、飽和濕度、5%的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔6小時取出一份24孔 板，每孔加入80μL濃度為5g/L的MTT溶液后，37°C下放置4h，在每孔加入600μL的二甲 基亞砜DMS0,用酶標儀在550nm處測定各孔吸光光度0D值，以0D值代表細胞的相對數(shù)量， 繪制生長曲線，紀錄結(jié)果；
[0026](三）培養(yǎng)細胞的表面標記分析的試驗步驟是：
[0027] 取P2代的細胞，去掉培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，用1:1的0. 05%質(zhì)量濃度胰蛋白酶液 消化，l〇〇〇r/min離心5min，用PBS洗滌1次，調(diào)整細胞濃度，制成濃度為106/mL的單細胞懸 液，加入10μL抗體，在4°C下孵育30min，用PBS洗滌1次，1000r/min離心5min，用500μL 的PBS重懸細胞，然后上流式細胞儀檢測，進行對比。
[0028] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比所產(chǎn)生的有益效果是：
[0029] 本發(fā)明的一種無血清的臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基克服了血清外源性污染缺陷和 細胞擴增數(shù)量與降低成本之間的矛盾問題。
[0030] 本發(fā)明的一種無血清的臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基，不含血清，可避免動物源血清 成份對細胞培養(yǎng)的影響；成份明確，可用于研究臍帶間充質(zhì)干細胞的分化增殖調(diào)節(jié)機制； 培養(yǎng)基中添加了植物多糖黃芪多糖促進臍帶間充質(zhì)干細胞的增殖，替代特殊抗體因子，降 低了成本。
[0031] 培養(yǎng)于本發(fā)明無血清的臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基中的臍帶間充質(zhì)干細胞保持良 好的貼壁特性，臍帶間充質(zhì)干細胞均呈現(xiàn)出梭形的成纖維狀細胞形態(tài)。
[0032] 本發(fā)明生長培養(yǎng)基中的臍帶間充質(zhì)干細胞在54小時前能夠生長至平臺期。但對 照生長培養(yǎng)基中的臍帶間充質(zhì)干細胞只能在66小時后才能夠生長至平臺期。由此可以看 出，本發(fā)明的生長培養(yǎng)基能夠有效地加速臍帶間充質(zhì)干細胞的生長速度。
[0033] 本發(fā)明所述無血清培養(yǎng)基和對照組培養(yǎng)基培養(yǎng)MSC流式細胞表型對比結(jié)果顯示， 本發(fā)明提供的無血清培養(yǎng)基和對照組培養(yǎng)基MSC陽性表達⑶73、⑶90、⑶105,陰性表達 ⑶14、⑶19、⑶34和⑶45,沒有統(tǒng)計學(xué)差異。
【附圖說明】
[0034] 圖1A和圖1B為不同干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細胞的形態(tài)圖片：
[0035]圖1A為本發(fā)明無血清的臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細胞的形 態(tài)圖片；
[0036] 圖1B為普通干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細胞的形態(tài)圖片。
[0037] 圖2不同的生長培養(yǎng)基中生長的臍帶間充質(zhì)干細胞的生長曲線圖：
[0038]圖2中的1曲線為本發(fā)明無血清的臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的生長曲線圖；
[0039]圖2中的2曲線為普通干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細胞的生長曲線圖；
[0040] 圖2中，橫坐標表示生長時間（單位為小時），縱坐標表示550nm處測定各孔吸光 光度值（0D值）。
【具體實施方式】
[0041] 下面對本發(fā)明的一種無血清的臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基作以下詳細說明。
[0042] 本發(fā)明的一種無血清的臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基，以及利用該培養(yǎng)基使臍帶間充 質(zhì)細胞傳代培養(yǎng)及擴增能力的實驗方法，其句喲實施的實驗是：
[0043](一）無血清培養(yǎng)基中細胞因子的組合實驗：
[0044] 所選用的生長因子：重組人成纖維細胞生長因子2(hFGF)、人重組胰島素（hi)、人 重組表皮生長因子（hEGF)、人重組白血病抑制因子（hLIF)和黃芪多糖（APS)濃縮液，經(jīng)無 囷過濾除囷，冷減或凍減備用。
[0045] 對于不同的生長因子設(shè)計不同的濃度（表1)添加到培養(yǎng)液中并根據(jù)生長曲線找 到該生長因子的最佳效應(yīng)濃度。經(jīng)過濃度的篩選實驗將最佳濃度的不同生長因子進行組合 (表2)，考察各自對干細胞生長情況的影響（表3)，得到最佳生長因子組合培養(yǎng)液。
[0046] 表1各種生長因子的濃度
[0047]
[0048] 表2細胞因子及濃度組合表
[0049]
[0051] 表3不同組合的培養(yǎng)基體系中細胞生長增殖的對比
[0052]

[0055] 表4是日本田口正交試驗得出結(jié)果。
[0056] 根據(jù)表4結(jié)果分析：綜合培養(yǎng)相同天數(shù)后細胞收獲量和所需成本考量，各生長因 子最佳效應(yīng)濃度最終確定為：
[0057] hFGF的最佳濃度為10ng/ml，
[0058] hEGF的最佳濃度為10μg/ml，
[0059]hi的最佳濃度為10μg/ml，
[0060] hLIF的最佳效應(yīng)濃度為lng/ml，
[0061] APS的最佳效應(yīng)濃度為0·lmg/ml。
[0062](二）臍帶間充質(zhì)細胞在培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)及擴增能力的比較分析
[0063] 1.把經(jīng)常規(guī)法分離所得并液氮保存的臍帶間充質(zhì)干細胞凍存管從液氮中取出來， 立即投入37°C水浴鍋中，輕微搖動（2min內(nèi)溶解），同時預(yù)熱上述培養(yǎng)基。
[0064] 2.把經(jīng)37°C解凍后的臍帶間充質(zhì)干細胞吸到裝有9mL培養(yǎng)基的15mL的離心管 中，同時用培養(yǎng)液洗2次凍存管，一起加到離心管中吹勻，避免產(chǎn)生泡沫。然后250G轉(zhuǎn)速離 心5分鐘。
[0065] 3.棄上清液，分別加2mL預(yù)熱的上述培養(yǎng)基，輕輕吹勾，保證細胞完全懸浮起來； 將重懸的細胞接種到T25的培養(yǎng)瓶中，加入適量的培養(yǎng)液，再把細胞搖均勻，保證所有的細 胞能夠均勻的分布。
[0066] 4.標好細胞種類和日期、培養(yǎng)基種類等，放入3