人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子在制備修復(fù)皮膚損傷的生物制劑中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子在制備修復(fù)皮膚損傷的生物制劑中的應(yīng)用，所述的皮膚損傷包括激光灼傷，也可以是熱灼傷、冷凍傷或普通外傷皮膚物理化學(xué)性損傷。本發(fā)明首次將臍帶干細(xì)胞復(fù)合生長因子用于人皮膚激光損傷治療當(dāng)中，在一定保存條件下，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子可以保存最大活性，并發(fā)揮最大的損傷修復(fù)治療作用。
【專利說明】人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子在制備修復(fù)皮膚損傷的生物制劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子在制備修復(fù)皮膚損傷的生物制劑中的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是一種來自與人體臍帶組織的間充質(zhì)細(xì)胞，具有高度增殖、自我更新和多向分化能力。間充質(zhì)干細(xì)胞來源廣泛，可來源于骨髓、脂肪、臍血、胎盤、羊水、臍帶等等組織。體外培養(yǎng)應(yīng)用不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基可分化為軟骨、骨、骨骼肌、肌腱、脂肪、神經(jīng)、皮膚等等細(xì)胞。另外，間充質(zhì)干細(xì)胞具有貼壁生長的特點，方便了條件培養(yǎng)基的收集。
[0003]與其他來源的間充質(zhì)干細(xì)胞相比，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞更方便提取，并且更易獲得。在再生醫(yī)學(xué)的應(yīng)用中，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有更強(qiáng)的抑制內(nèi)皮細(xì)胞及組織凋亡，調(diào)節(jié)免疫的作用，而這些作用與其所分泌的復(fù)合細(xì)胞因子有非常密切的作用。在臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)過程中會分泌肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF),粒細(xì)胞巨卩遼細(xì)胞集落刺激因子，白介素6、7、8、11，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF),血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF),腦源性營養(yǎng)因子(brain derivedneurotrophic factor),神經(jīng)生長因子(nerve growth factor, NGF),以及其他還沒有被分離的分子物質(zhì)。所以這種復(fù)合細(xì)胞因子具有這促進(jìn)皮膚組織生長，調(diào)節(jié)損傷后免疫的功能可以用于激光灼傷等理化因素造成的皮膚損傷。
[0004]隨著美容整形市 場的擴(kuò)大，越來越多的人群選擇應(yīng)用激光祛斑、光子嫩膚等方法進(jìn)行面部美容。皮膚激光美容術(shù)是通過光熱作用進(jìn)行皮膚治療，通過產(chǎn)生高能量，準(zhǔn)確聚焦，在人皮膚組織局部產(chǎn)生高能量，通過去除和破壞組織達(dá)到美容的目的。但是因為治療選擇不當(dāng)、操作不當(dāng)?shù)仍蛟斐尚g(shù)后并發(fā)癥的人群在逐年增多。因操作不當(dāng)會造成過多的組織損傷，嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，以及毛細(xì)血管怒張等等相反的效果。主要的副作用包括水腫、水皰、色素沉著、色素減退、毛細(xì)血管擴(kuò)張、皮膚敏感性增高等等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子在制備修復(fù)皮膚損傷的生物制劑中的應(yīng)用，所述的皮膚損傷包括激光灼傷，也可以是熱灼傷、冷凍傷或普通外傷皮膚物理化學(xué)性損傷，所述的復(fù)合細(xì)胞因子為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子，所述的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子通過以下步驟制備而得:
1)從人臍帶組織中提取臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；
2)將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在體外進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)；
3)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞換用無血清的條件培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并且將培養(yǎng)基進(jìn)行收集；
4)將條件培養(yǎng)基進(jìn)行離心純化，截留分子量3.5kDa的物質(zhì)；
5)將離心后培養(yǎng)基(含>3.5kDa分子)進(jìn)行透析濃縮，得到濃縮液；6)將濃縮液進(jìn)行凍干處理，得到人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子凍干粉。
[0006]更加優(yōu)選地，
所述的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子通過以下步驟制備而得:
I)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的提取:通過抽脂手術(shù)以及其他手術(shù)中獲取的人體臍帶組織為原料，通過膠原酶消化后離心提取臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中在飽和濕度5% 二氧化碳濃度，37 ° C恒溫下培養(yǎng)。
[0007]2)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng):人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞為長梭形貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞生長至80-90%融合時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
[0008]3)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基的收集:培養(yǎng)細(xì)胞至第三代，融合率達(dá)到80-90%進(jìn)行細(xì)胞因子的收集，應(yīng)用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞正常培養(yǎng)后，將經(jīng)過培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基進(jìn)行收集。
[0009]4)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基的離心過濾，濃縮及凍干:將所收集的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基進(jìn)行過濾離心，所用離心濾膜為截留分子量為3.5kDa的分子濾膜。將離心后的條件培養(yǎng)基通過超濾的方式進(jìn)行進(jìn)一步的濃縮，通過Slide-A-Lyzer等透析膜濃縮2-20倍。將最終的濃縮液放置于容器中進(jìn)行最終凍干，制備成凍干粉。注意全程無菌化處理。 [0010]一種含有人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子的修復(fù)材料，所述的修復(fù)材料包括人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子和透明質(zhì)酸，每1ml修復(fù)材料中含有0.1ng-1OOmg人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子。制備方法包括以下步驟:將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子濃縮液或凍干粉按照一定比例加入透明質(zhì)酸中，配置成每1ml修復(fù)材料中含有
0.1ng-1OOmg復(fù)合細(xì)胞因子的修復(fù)材料。
[0011]所述的修復(fù)材料為膠狀修復(fù)材料、面膜修復(fù)材料或膏狀修復(fù)材料。
[0012]本發(fā)明具有如下技術(shù)效果:
I)激光灼傷主要病理變化包括局部皮膚粘膜細(xì)胞的變性壞死以及免疫功能異常等等。按照嚴(yán)重程度可按照燒(灼)傷的標(biāo)準(zhǔn)三度四分法進(jìn)行判定，如I度燒傷僅傷及表皮，局部紅腫；二度傷及真皮，局部出現(xiàn)水泡；三度傷及皮膚全層，深達(dá)皮膚、肌肉、骨骼等等。但是激光灼傷也具有自身的特點，如皮膚點狀損傷，后期愈合后毛細(xì)血管怒張等等。復(fù)合細(xì)胞因子具有多種細(xì)胞因子有效成分，能夠?qū)p傷組織進(jìn)行修復(fù)，促進(jìn)損傷組織的生長愈合，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等等。
[0013]2)透明質(zhì)酸材料為一種酸性粘多糖，溶解后比例為0.1_10%，理想濃度為1%，是人體的一種成分，富含水分，具有特殊的保水作用，對激光創(chuàng)面以及其他理化損傷創(chuàng)面保持濕潤環(huán)境。
[0014]3)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的復(fù)合細(xì)胞因子為肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growthfactor, HGF)，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子，白介素6、7、8、11，腫瘤壞死因子(tumornecrosis factor, TNF),血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),腦源性營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor),神經(jīng)生長因子(nervegrowth factor, NGF),以及其他還沒有被分離的分子物質(zhì)等多種有效成分的混合物,具有明顯的治療作用。本發(fā)明首次將臍帶干細(xì)胞復(fù)合生長因子用于人皮膚激光損傷治療當(dāng)中，在一定保存條件下，復(fù)合細(xì)胞因子可以保存最大活性，并發(fā)揮最大的損傷修復(fù)治療作用。【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖l(al)為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)圖；
圖l(a2)為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)至第三代形態(tài)圖；
圖l(a3)為第三代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的流式細(xì)胞分析結(jié)果；
圖2為使用上述皮膚修復(fù)材料的人皮膚二氧化碳激光點陣掃描后修復(fù)圖。其中=FxCR8mJ照射后應(yīng)用復(fù)合細(xì)胞因子(Tl)，F(xiàn)xCR 8mJ照射后應(yīng)用對照空白培養(yǎng)基(Cl)，F(xiàn)xCR 16mJ照射后應(yīng)用復(fù)合細(xì)胞因子(T2)，F(xiàn)xCR 16mJ照射后應(yīng)用對照空白培養(yǎng)基(C2)。
[0016]圖3a為二氧化碳激光后不同組之間(T:實驗組；C:對照組)應(yīng)用紅斑指數(shù)(Erythema index)測量恢復(fù)情況對照曲線。
[0017]圖3b為二氧化碳激光后不同組之間(T:實驗組；C:對照組)應(yīng)用黑色素指數(shù)(Melanin index)測量恢復(fù)情況對照曲線。
【具體實施方式】
[0018]實施例1制備含有人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子
含有人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子的制備方法，包括如下步驟:
I)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的提取
通過抽脂手術(shù)以及其他手術(shù)中獲取的人體臍帶組織為原料，通過膠原酶消化后離心提取臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中在飽和濕度5% 二氧化碳濃度，37° C恒溫下培養(yǎng)。
[0019]2)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)
人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞為長梭形貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞生長至80-90%融合時進(jìn) 行傳代培養(yǎng)。
[0020]臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)(al)和培養(yǎng)至第三代形態(tài)(a2)如圖1 (al)和圖1(a2)所示，流式細(xì)胞分析如圖1 (a3)所示，表明抗原，CD29(99.96%，bl)，CD90 (47.1%, b4),CD34 (0.87%, b2)，CD71 (0.94%, b3)，陰性對照 PE (0.56%, b5)，F(xiàn)ITC (1.09%, b6)。
[0021]3)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基的收集
培養(yǎng)細(xì)胞至第三代，融合率達(dá)到80-90%進(jìn)行細(xì)胞因子的收集，應(yīng)用無血清培 養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞正常培養(yǎng)后，將經(jīng)過培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基進(jìn)行收集。
[0022]4)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基的離心過濾，濃縮及凍干
將所收集的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基進(jìn)行過濾離心，所用離心濾膜為截留分子量為3.5kDa的分子濾膜。將離心后的條件培養(yǎng)基通過超濾的方式進(jìn)行進(jìn)一步的濃縮，通過Slide-A-Lyzer等透析膜濃縮2_20倍。將最終的濃縮液放置于容器中進(jìn)行最終凍干，制備成凍干粉。注意全程無菌化處理。
[0023]實施例2
選擇19名過去12個月未做過二氧化碳激光的志愿者參加實驗，年齡24-33歲，F(xiàn)itzpatrick皮膚分級為3-4級。在每個志愿者雙手臂內(nèi)側(cè)共四處應(yīng)用二氧化碳激光照射，相對稱區(qū)域用8mJ及16mJ的輻射計量。圖2為典型照射后圖片，T為實驗組，C為對照組，I為8mJ福射，2為16mJ福射，分別為術(shù)后1、7、14天圖片。[0024]分別統(tǒng)計紅斑指數(shù)和黑色素指數(shù)，T為實驗組，C為對照組，I為SmJ輻射，2為16mJ輻射，分別為術(shù)后0、1、4、7、14、21天。
[0025]對二氧化碳激光后不同組之間(T:實驗組；C:對照組)應(yīng)用紅斑指數(shù)(Erythemaindex)測量恢復(fù)情況。T1、C1為8mJ激光，T2、C2為16mJ激光。如圖3a所示，第一天實驗組與對照組之間有明顯差異(T檢驗，P〈0.05)。
[0026]對二氧化碳激光后不同組之間(T:實驗組；C:對照組)應(yīng)用黑色素指數(shù)(Melaninindex)測量恢復(fù)情況。如圖3b所示，在術(shù)后第1、7、14、21天細(xì)胞因子組明顯降低了黑色素含量(T檢驗，P〈0.05)。
[0027]結(jié)論:應(yīng)用含有細(xì)胞因子的修復(fù)材料可以明顯改善傷口的恢復(fù)情況，降低傷口的紅斑指數(shù)和黑色素指數(shù)。
[0028]實施例3含有人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子的功能性修復(fù)材料
功能性修復(fù)材料:可應(yīng)用于激光灼傷、急性創(chuàng)傷、挫傷等等皮膚創(chuàng)面的修復(fù)，含有高劑量細(xì)胞因子，對新鮮或陳舊未閉合創(chuàng)面的修復(fù)有非常強(qiáng)效的作用。1ml修復(fù)材料含:HA
0.1g,超純水約1ml,人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子10mg,堿性細(xì)胞生長因子10ng,表皮生長因子10 μ g。制備劑型為膠狀涂抹修復(fù)材料，可直接涂抹于皮膚創(chuàng)口，并在表面貼服透氣材料防止修復(fù)材料損失。
[0029]實施例4含有人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子的日常護(hù)理面膜 日常護(hù)理面膜:主要用于日常的皮膚護(hù)理，將細(xì)胞因子加入面膜液中混勻制備為面膜，長期面部應(yīng)用可以起到皮膚美白、修復(fù)、抗衰老的作用。具體成分如下:
聚乙烯醇 12%
甘油10%
咪唑烷基脲 1%
乙醇5%
月桂醇聚氧乙烯醚7%
細(xì)胞因子液 0.1%
香精、防腐劑適量 純化水補(bǔ)充至100%
其中細(xì)胞因子液中細(xì)胞因子濃度約為0.5 μ g/100ml。
[0030]所制備面膜中每片約含有人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子0.1ngo
[0031]實施例5含有人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子的即時修復(fù)材料
即時修復(fù)材料:主要用于皮膚損傷后的即時修復(fù)，主要針對的損傷為表皮破損或傷及真皮組織的損傷，包括激光損傷、皮膚擦傷等等，一般在創(chuàng)面形成后4小時內(nèi)應(yīng)用。在非清潔創(chuàng)面，需先對創(chuàng)面進(jìn)行清創(chuàng)處理，清潔創(chuàng)面則可直接將修復(fù)材料涂抹于創(chuàng)面組織后進(jìn)行低溫護(hù)理。即時修復(fù)材料成分包括:透明質(zhì)酸1%，純化水99%，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子1mg均勻溶解于透明質(zhì)酸1%膠狀液中。
【權(quán)利要求】
1.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子在制備修復(fù)皮膚損傷的生物制劑中的應(yīng)用，所述的皮膚損傷包括激光灼傷，也可以是熱灼傷、冷凍傷或普通外傷皮膚物理化學(xué)性損傷，其特征在于，所述的復(fù)合細(xì)胞因子為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子，所述的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子通過以下步驟制備而得: 1)從人臍帶組織中提取臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞； 2)將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在體外進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)； 3)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞換用無血清的條件培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并且將培養(yǎng)基進(jìn)行收集； 4)將條件培養(yǎng)基進(jìn)行離心純化，截留分子量3.5kDa的物質(zhì)； 5)將離心后培養(yǎng)基(含>3.5kDa分子)進(jìn)行透析濃縮，得到濃縮液； 6)將濃縮液進(jìn)行凍干處理，得到人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子凍干粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子通過以下步驟制備 而得: 1)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的提取:通過抽脂手術(shù)以及其他手術(shù)中獲取的人體臍帶組織為原料，通過膠原酶消化后離心提取臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中在飽和濕度5% 二氧化碳濃度，37 ° C恒溫下培養(yǎng)； 2)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng):人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞為長梭形貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞生長至80-90%融合時進(jìn)行傳代培養(yǎng)； 3)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基的收集:培養(yǎng)細(xì)胞至第三代，融合率達(dá)到80-90%進(jìn)行細(xì)胞因子的收集，應(yīng)用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞正常培養(yǎng)后，將經(jīng)過培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基進(jìn)行收集； 4)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基的離心過濾，濃縮及凍干:將所收集的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基進(jìn)行過濾離心，所用離心濾膜為截留分子量為3.5kDa的分子濾膜；將離心后的條件培養(yǎng)基通過超濾的方式進(jìn)行進(jìn)一步的濃縮，通過Slide-A-Lyzer等透析膜濃縮2_20倍；將最終的濃縮液放置于容器中進(jìn)行最終凍干，制備成凍干粉；注意全程無菌化處理。
3.含有如權(quán)利要求1或2所述的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子的修復(fù)材料，其特征在于，所述的修復(fù)材料包括人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子和透明質(zhì)酸，每1ml修復(fù)材料中含有0.1ng-1OOmg人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的修復(fù)材料，其特征在于，所述的修復(fù)材料為膠狀修復(fù)材料、面膜修復(fù)材料或膏狀修復(fù)材料。
【文檔編號】A61K38/19GK104027794SQ201410273905
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月19日
【發(fā)明者】徐妍, 郭世磊, 周炳榮 申請人:徐妍