7°C、5%C02培養(yǎng)箱中。
[0067] 5.細(xì)胞貼壁后換培養(yǎng)基，保證去除死細(xì)胞。培養(yǎng)皿中的細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%~ 90%時按1 : 3的比例傳代至細(xì)胞培養(yǎng)板中，傳代使用的生長培養(yǎng)基為本發(fā)明培養(yǎng)基和普 通干細(xì)胞培養(yǎng)基。顯微鏡下觀察臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生長狀況。圖1A所示，培養(yǎng)于本發(fā)明 無血清的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基中的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞保持良好的貼壁特性，臍帶間充 質(zhì)干細(xì)胞均呈現(xiàn)出梭形的成纖維狀細(xì)胞形態(tài)。
[0068]6.傳至第2代時，MTT法檢測細(xì)胞活性繪制細(xì)胞生長曲線，具體操作：將生長至 80%融合度的第2代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞酶解懸浮，調(diào)整細(xì)胞濃度至1X104個/mL，加入24 孔板，每孔800μL，置于37°C、飽和濕度、5%的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔6小時取出一份24 孔板，每孔加入80yL的MTT溶液（5g/L)后，37°C下放置4h，在每孔加入600yL的二甲基 亞砜（DMS0)，用酶標(biāo)儀在550nm處測定各孔吸光光度值（0D值），以0D值代表細(xì)胞的相對 數(shù)量，繪制生長曲線，結(jié)果如圖2所示，本發(fā)明生長培養(yǎng)基中的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在54小時 前能夠生長至平臺期。但對照生長培養(yǎng)基中的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞只能在66小時后才能夠 生長至平臺期。由此可以看出，本發(fā)明的生長培養(yǎng)基能夠有效地加速臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的 生長速度。
[0069](三）培養(yǎng)細(xì)胞的表面標(biāo)記分析
[0070] 取P2代的細(xì)胞，去掉培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，用1 : 1的0. 05%胰蛋白酶液消化， 1000r/min離心5min，用PBS洗滌1次，調(diào)整細(xì)胞濃度，制成濃度為106/ml的單細(xì)胞懸液， 加入10μL抗體，在4°C下孵育30min，用PBS洗滌1次，1000r/min離心5min，用500μL的 PBS重懸細(xì)胞，然后上流式細(xì)胞儀檢測，進(jìn)行對比。結(jié)果見表4。本發(fā)明所述無血清培養(yǎng)基 和對照組培養(yǎng)基培養(yǎng)MSC流式細(xì)胞表型對比結(jié)果顯示，本發(fā)明提供的無血清培養(yǎng)基和對照 組培養(yǎng)基MSC陽性表達(dá)⑶73、⑶90、⑶105,陰性表達(dá)⑶14、⑶19、⑶34和⑶45,沒有統(tǒng)計學(xué) 差異。
[0071] 表5Ρ2代細(xì)胞表面分子標(biāo)記表達(dá)百分比
[0072]
[0073] 本方法中所述的DMEM是一種含各種氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基，是在MEM培養(yǎng)基 的基礎(chǔ)上研制的。與MEM比較增加了各種成分用量，同時又分為高糖型（低于4500mg/L) 和低糖型（低于l〇〇〇mg/L)。高糖型有利于細(xì)胞停泊于一個位置生長，適于生長較快、附著 較困難腫瘤細(xì)胞等。
[0074] 本方法中所述的DMEM是dulbecco'smodifiedeaglemedium的縮寫，所以其特 點主要包括以下：（1)氨基酸含量為依格爾培養(yǎng)基的2倍，且含有非必需氨基酸，如甘氨酸 等；（2)維生素含量為依格爾培養(yǎng)基的4倍；（3)含有糖酵解途徑中的重要物質(zhì)一一丙酮酸； (4)含有微量的鐵離子。
[0075] 該DMEM培養(yǎng)基廣泛應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)和各種初代病毒宿主細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)及單一 細(xì)胞培養(yǎng)；如A9、3T6、BALB/3T3、C0S-1、C0S-3、C0S-7、L6、WEHI-3b等細(xì)胞系的培養(yǎng)。
[0076] 本方法中所述的DMEM培養(yǎng)基可以采用下述成分的DMEM培養(yǎng)基。
[0077]DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基成份：
[0078]
[0079] 本方法中所述的細(xì)胞MTT測試：
[0080]MTT全稱為 3-(4,5-dimethyl-2_thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H_tetrazolium bromide，漢語化學(xué)名為3- (4, 5-二甲基噻唑-2) -2, 5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán)。 是一種黃顏色的染料。
[0081]MTT主要有兩個用途：
[0082] 1.藥物（也包括其他處理方式如放射線照射）對體外培養(yǎng)的細(xì)胞毒性的測定；
[0083] 2.細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性測定。
[0084]MTT檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶 性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臢（Z0)(F〇rmazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜 (DMS0)能溶解細(xì)胞中的甲臢（Ζδ)，用酶標(biāo)儀在490nm波長處（英文說明書寫的是570nm) 測定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。根據(jù)測得的吸 光度值（0D值），來判斷活細(xì)胞數(shù)量，0D值越大，細(xì)胞活性越強（如果是測藥物毒性，則表示 藥物毒性越小）。
[0085] 本發(fā)明的一種無血清的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，不含血清，可避免動物源血清 成份對細(xì)胞培養(yǎng)的影響；成份明確，可用于研究臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分化增殖調(diào)節(jié)機制； 培養(yǎng)基中添加了植物多糖黃芪多糖促進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，替代特殊抗體因子，降 低了成本。
[0086] 本發(fā)明所述無血清培養(yǎng)基和對照組培養(yǎng)基培養(yǎng)MSC流式細(xì)胞表型對比結(jié)果顯示， 本發(fā)明提供的無血清培養(yǎng)基和對照組培養(yǎng)基MSC陽性表達(dá)⑶73、⑶90、⑶105,陰性表達(dá) ⑶14、⑶19、⑶34和⑶45,沒有統(tǒng)計學(xué)差異。
【主權(quán)項】
1. 一種無血清的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加成份； 其中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基，添加成份及其含量如下： 堿性成纖維生長因子hFGF:l-20ng/mL; 表皮生長因子hEGF:l-20yg/mL; 胰島素111:1-2〇4 8/1]11^; 白血病抑制因子hLIF:0.l_5ng/mL; L-谷氨酰胺; 2-巰基乙醇：50-200μΜ; 亞硒酸鈉：20-50ηΜ; 轉(zhuǎn)鐵蛋白：10-30yg/mL; 人白蛋白：l〇-l〇〇mg/mL; 纖連蛋白：50-200μg/mL; 黃芪多糖APS:50-200μg/mL。2. -種如權(quán)利要求1所述的無血清的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，添加成份及其含量如 下： 堿性成纖維生長因子hFGF:5_15ng/mL，優(yōu)選10ng/mL; 表皮生長因子hEGF:5-15μg/mL，優(yōu)選10μg/mL; 胰島素hi:5-18μg/mL，優(yōu)選 10μg/mL; 白血病抑制因子hLIF:0· 5-2. 5ng/mL，優(yōu)先Ing/mL; L_谷氨酰胺：5-8mM，優(yōu)選5mM; 2-巰基乙醇：80-150μΜ，優(yōu)選100μΜ; 亞硒酸鈉：25-40ηΜ，優(yōu)選30ηΜ; 轉(zhuǎn)鐵蛋白：15-25μg/mL，優(yōu)選 25μg/mL; 人白蛋白：30-80mg/mL，優(yōu)選 50mg/mL; 纖連蛋白：80-150μg/mL，優(yōu)選 100μg/mL; 黃芪多糖APS:80-150μg/mL，優(yōu)選 100μg/mL。3. -種臍帶間充質(zhì)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)及擴增的方法，其特征在于該實驗方法的步驟是： (一） 首先制備如權(quán)利要求1~2任一項的無血清的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基； (二） 傳代培養(yǎng)及擴增步驟： a. 把經(jīng)常規(guī)法分離所得并液氮保存的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞凍存管從液氮中取出來，立即 投入37°C水浴鍋中，輕微搖動，2min內(nèi)即可溶解，同時預(yù)熱上述無血清的臍帶間充質(zhì)干細(xì) 胞培養(yǎng)基； b. 把經(jīng)37°C解凍后的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞吸到裝有9mL培養(yǎng)基的15mL的離心管中，同 時用培養(yǎng)液洗2次凍存管，一起加到離心管中吹勻，避免產(chǎn)生泡沫，然后250倍重力的轉(zhuǎn)速 咼心5分鐘； c. 棄上清液，分別加2mL預(yù)熱的的上述培養(yǎng)基，輕輕吹勻，保證細(xì)胞完全懸浮起來；將 重懸的細(xì)胞接種到T25的培養(yǎng)瓶中，加入適量的培養(yǎng)液，再把細(xì)胞搖均勻，保證所有的細(xì)胞 能夠均勻的分布； d. 標(biāo)好細(xì)胞種類和日期、培養(yǎng)基種類等，放入37°C、5%C02培養(yǎng)箱中； e. 細(xì)胞貼壁后換培養(yǎng)基，保證去除死細(xì)胞； 培養(yǎng)皿中的細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%~90%時按1:3的比例傳代至細(xì)胞培養(yǎng)板中，傳代使 用的生長培養(yǎng)基為本發(fā)明培養(yǎng)基；顯微鏡下觀察臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生長狀況；拍照紀(jì)錄； f. 傳至第2代時，MTT法檢測細(xì)胞活性繪制細(xì)胞生長曲線，具體操作：將生長至80% 融合度的第2代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞酶解懸浮，調(diào)整細(xì)胞濃度至1X104個/mL，加入24孔板， 每孔800μL，置于37°C、飽和濕度、5%的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔6小時取出一份24孔板， 每孔加入80μL濃度為5g/L的MTT溶液后，37°C下放置4h，在每孔加入600μL的二甲基亞 砜DMSO,用酶標(biāo)儀在550nm處測定各孔吸光光度OD值，以O(shè)D值代表細(xì)胞的相對數(shù)量，繪制 生長曲線，紀(jì)錄結(jié)果。4.如權(quán)利要求3所述的一種臍帶間充質(zhì)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)及擴增的方法，其特征在于該 方法進(jìn)一步包括步驟(三）培養(yǎng)細(xì)胞的表面標(biāo)記分析的試驗步驟：取P2代的細(xì)胞，去掉培養(yǎng) 液，PBS洗滌2次，用1:1的0.05%質(zhì)量濃度胰蛋白酶液消化，1000r/min離心5min，用 PBS洗滌1次，調(diào)整細(xì)胞濃度，制成濃度為106/mL的單細(xì)胞懸液，加入10μL抗體，在4°C下 孵育30min，用PBS洗滌1次，1000r/min離心5min，用500μL的PBS重懸細(xì)胞，然后上流式 細(xì)胞儀檢測，進(jìn)行對比。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種無血清的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，該無血清的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加成份；其中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基，添加成份有：堿性成纖維生長因子hFGF；表皮生長因子hEGF；胰島素hI；白血病抑制因子hLIF；黃芪多糖APS；臍帶間充質(zhì)細(xì)胞在上述培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)及擴增，之后對培養(yǎng)細(xì)胞表面標(biāo)記分析。本發(fā)明的一種無血清的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基克服了血清外源性污染缺陷和細(xì)胞擴增數(shù)量與降低成本之間的矛盾問題。其不含血清，可避免動物源血清成份對細(xì)胞培養(yǎng)的影響；可用于研究臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分化增殖調(diào)節(jié)機制。
【IPC分類】C12N5/0775
【公開號】CN105420182
【申請?zhí)枴緾N201510796481
【發(fā)明人】楊繼建, 杜麗英, 田麗娜, 王偉, 徐婭妮, 孫鎮(zhèn), 秦倍倍
【申請人】山東景源生物科技有限公司
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2015年11月18日