本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種基于POCKIT Micro熒光PCR平臺的牛羊細粒棘球蚴病的檢測試劑盒及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

細粒棘球蚴病蚴病是一種危害嚴重的人獸共患寄生蟲病，在我國四川、青海、甘肅、寧夏、新疆等地區(qū)普遍存在，其中牦牛、羊是其主要的中間宿主，牛羊感染細粒棘球蚴后一方面嚴重影響其生長性能，另一方面感染細粒棘球蚴的牛羊內(nèi)臟不經(jīng)處理被犬吞食是造成該病流行的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

目前基層對牛羊臟器是否感染細粒棘球蚴主要靠眼觀手摸，具有很大的局限性，對于較小的包囊，或者其它寄生蟲造成的疑似包囊(比如肝片吸蟲、細頸囊尾蚴等)無法準(zhǔn)確判定。而實驗室檢測主要是PCR方法，需要專門的儀器(PCR儀，離心機等)，基層檢疫部門往往缺乏相應(yīng)的儀器和技術(shù)人員，因此對牛羊內(nèi)臟是否感染細粒棘球蚴的現(xiàn)場快速檢測方法的建立就迫在眉睫。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明針對上述的問題，提供了一種基于POCKIT Micro熒光PCR平臺的牛羊細粒棘球蚴病的檢測試劑盒及應(yīng)用，本發(fā)明是基于POCKIT Micro平臺的熒光PCR，操作簡單、敏感性高、特異性強，可以現(xiàn)場對牛羊細粒棘球蚴病的檢測提供科學(xué)依據(jù)，對保障人畜健康、提高公共衛(wèi)生安全水平具有重要意義。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種基于POCKIT Micro熒光PCR平臺的牛羊細粒棘球蚴病檢測的引物和探針，所述引物和探針包括：牛羊細粒棘球蚴病上游引物、牛羊細粒棘球蚴病下游引物和牛羊細粒棘球蚴病探針，其中，所述牛羊細粒棘球蚴病上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述牛羊細粒棘球蚴病下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述牛羊細粒棘球蚴病探針如SEQ ID NO.3所示。

本發(fā)明還公開了一種上述的引物和探針在制備牛羊細粒棘球蚴病檢測試劑盒方面的應(yīng)用。

本發(fā)明還公開了一種基于POCKIT Micro熒光PCR的牛羊細粒棘球蚴病的試劑盒，該試劑盒包括DNA模板、熒光定量PCR反應(yīng)液、陽性對照品和陰性對照品；

所述熒光定量PCR反應(yīng)液包括牛羊細粒棘球蚴病上游引物3.5μL，牛羊細粒棘球蚴病下游引物3.5μL，牛羊細粒棘球蚴病探針1.5μL，Taq酶1.5μL，預(yù)混buffer 25μL，去離子水14μL，總量為49μL，DNA模板與熒光定量PCR反應(yīng)液的總量為50μL；

所述牛羊細粒棘球蚴病上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述牛羊細粒棘球蚴病下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述牛羊細粒棘球蚴病探針如SEQ ID NO.3所示。

進一步地，Taq酶的終濃度為5U·μL^-1，牛羊細粒棘球蚴病上游引物和牛羊細粒棘球蚴病下游引物的終濃度均為400nM，牛羊細粒棘球蚴病探針的終濃度為250nM。

進一步地，陽性對照品為：含有細粒棘球絳蟲ND1基因片段的pEASY-T1載體質(zhì)粒，所述ND1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述陰性對照品為：無ND1基因片段的pEASY-T1空載體。

進一步地，含有細粒棘球絳蟲ND1基因片段的pEASY-T1載體質(zhì)粒，由以下方法制備得到：

1)利用牛羊細粒棘球蚴病上游引物和牛羊細粒棘球蚴病下游引物，以細粒棘球絳蟲的基因組DNA為模板，進行PCR擴增獲得目的基因的PCR 擴增產(chǎn)物；

2)將PCR擴增產(chǎn)物克隆到pEASY-T1載體上，構(gòu)建含有細粒棘球絳蟲ND1基因片段的pEASY-T1載體質(zhì)粒；

3)抽提質(zhì)粒，定量并稀釋至10³拷貝/μl，制備得到含有細粒棘球絳蟲ND1基因片段的pEASY-T1載體質(zhì)粒，即為陽性對照品。

本發(fā)明還公開了一種上述的試劑盒定性檢測牛羊細粒棘球蚴病的方法，包括以下步驟：

a)采用PetNAD核酸快速提取試劑盒從待檢測的標(biāo)本中提取DNA，用無菌去離子水調(diào)整DNA濃度為1.5ng/μl，制備得到DNA提取液；

b)以提取得到的DNA作為模板，加入到裝有熒光定量PCR反應(yīng)液的PCR管中，對照PCR管中分別加入等體積的陽性對照模板和陰性對照模板，將PCR管放置到POCKIT Micro熒光PCR儀中進行檢測，42分鐘以后判讀結(jié)果。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術(shù)效果：

1)本發(fā)明提供了一種牛羊細粒棘球蚴病的熒光PCR檢測試劑盒，其優(yōu)點是異性強、靈敏度高、無污染、無需電泳，可在現(xiàn)場快速檢測。

2)本發(fā)明能快速、準(zhǔn)確地檢測出被檢樣本中的細粒棘球絳蟲DNA，也可用于牛羊細粒棘球蚴病感染的分子流行病學(xué)調(diào)查。

3)本發(fā)明的模板DNA制備步驟簡單費用低，操作簡單，不僅省時省力而且節(jié)省了大量的試劑和耗材，提高了工作效率。

4)本發(fā)明是建立在分子生物學(xué)基礎(chǔ)上的一種敏感性高、特異性強的檢測方法。

當(dāng)然，實施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時達到以上所述的所有技術(shù)效果。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，構(gòu)成本發(fā)明的一 部分，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：

圖1是本發(fā)明牛羊細粒棘球蚴病陽性樣本靈敏度檢測結(jié)果；其中，1：10⁵；2：10⁴；3：10³；4：10²；

圖2是本發(fā)明中所用的臨床樣本核酸快速提取方法概覽。

具體實施方式

以下將配合實施例來詳細說明本發(fā)明的實施方式，藉此對本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題并達成技術(shù)功效的實現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實施。

本發(fā)明實施例中通用基因組提取試劑盒(Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0)為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；PetNAD核酸快速提取試劑盒，POCKIT Micro儀器(廈門金瑞鴻捷公司)；引物、探針設(shè)計與合成均由六合華大公司完成。

本發(fā)明PCR特異性檢測中所用的細粒棘球絳蟲、多房棘球絳蟲、肝片吸蟲、前后盤吸蟲、羊泡狀帶絳蟲和日本血吸蟲基因組DNA均由本實驗室保存。

實施例1基于POCKIT Micro熒光PCR的牛羊細粒棘球蚴病的試劑盒

一種檢測牛羊細粒棘球蚴病的試劑盒，包括以下組分：

(1)DNA模板：采用PetNAD核酸快速提取試劑盒從待檢測的標(biāo)本中提取的DNA；

(2)熒光定量PCR反應(yīng)液：牛羊細粒棘球蚴病上游引物3.5μL(終濃度400nM)，牛羊細粒棘球蚴病下游引物3.5μL(終濃度400nM)，牛羊細粒棘球蚴病探針1.5μL(終濃度250nM)，Taq酶1.5μL(終濃度5U·μL^-1)，預(yù)混buffer 25μL，去離子水14μL，總量為49μL，DNA模板與熒光定量PCR 反應(yīng)液的總量為50μL；

牛羊細粒棘球蚴病上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述牛羊細粒棘球蚴病下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述牛羊細粒棘球蚴病探針如SEQ ID NO.3所示，具體的核苷酸序列如表1所示。

(3)陽性對照品：含有細粒棘球絳蟲ND1基因片段的pEASY-T1載體質(zhì)粒，所述ND1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

陽性對照品通過以下方式制備得到：采用牛羊細粒棘球蚴病上游引物和牛羊細粒棘球蚴病下游引物PCR擴增細粒棘球絳蟲DNA，擴增出的ND1基因部分序列(SEQ ID NO.4)克隆到pEASY-T1(全式金公司)，轉(zhuǎn)化后進行菌落PCR鑒定，陽性菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進行測序。測序結(jié)果正確質(zhì)粒采用NanoDrop2000精確定量，然后根據(jù)質(zhì)粒分子量進行計算摩爾量，制備出10³拷貝/μl的標(biāo)準(zhǔn)品用作為陽性對照品。

(4)陰性對照品：無ND1基因片段的pEASY-T1空載體，制備方法陽性對照品，制備出10³拷貝/μl的無目的基因的pEASY-T1作為陰性對照品。

表1檢測牛羊細粒棘球蚴病的上下游引物和探針

實施例2用實施例1的方法定性檢測牛羊細粒棘球蚴病，具體方法為：

1)采用PetNAD核酸快速提取試劑盒從待檢測的標(biāo)本中提取DNA，用無菌去離子水調(diào)整DNA濃度為1.5ng/μl。

2)取1μL待檢樣本DNA作為模板加入到裝有49μL熒光定量PCR反應(yīng)液的PCR管中，對照PCR管中分別加入等體積的陽性對照品模板和陰性對照品模板，加樣時注意避光操作。將制備好的熒光定量PCR反應(yīng)管瞬時高速離心5s，避免出現(xiàn)氣泡。

3)將PCR管放置到置于POCKIT Micro熒光PCR儀內(nèi)，按運行鍵，即開始反應(yīng)。

4)檢測結(jié)果判定：“+”表示陽性，“-”表示陰性。

實施例3基于POCKIT Micro熒光PCR儀的細粒棘球蚴標(biāo)準(zhǔn)品的制備和靈敏性檢測

按照實施例1的方法制備陽性對照品；采用NanoDrop2000精確定量，然后根據(jù)質(zhì)粒分子量進行計算摩爾量，制備出10⁵、10⁴、10³和10²拷貝/μl的陽性標(biāo)準(zhǔn)品用于靈敏性檢測。

選擇牛羊細粒棘球蚴病上下游引物各3.5μL(終濃度400nM)、牛羊細粒棘球蚴病探針1.5μL(終濃度250nM)、Taq酶1.5μL(5U·μL^-1)、預(yù)混buffer25μL、細粒棘球絳蟲陽性對照品模板1μL(10⁵拷貝/50μl)、ddH₂O 14μL，共50μL，裝入PCR反應(yīng)管中，對照管中分別加入等體積的10⁴拷貝/50μl細粒棘球絳蟲陽性對照品模板、10³拷貝/50μl細粒棘球絳蟲陽性對照品模板和10²拷貝/50μl細粒棘球絳蟲陽性對照品模板；進行擴增反應(yīng)，各反應(yīng)管放入POCKIT Micro反應(yīng)孔，按“運行鍵”即可，42分鐘后反應(yīng)結(jié)束，結(jié)果如圖1所示：其中，1：10⁵；2：10⁴；3：10³；4：10²；說明本方法靈敏性最高為100個拷貝。

實施例4基于POCKIT Micro熒光PCR儀的細粒棘球蚴特異性檢測

按照實施例2的方法進行細粒棘球蚴特異性檢測，模板分別為細粒棘球絳蟲G1株、多房棘球絳蟲、前后盤吸蟲、肝片吸蟲、羊泡狀帶絳蟲和日本血吸蟲DNA，針對每個蟲體配制2個反應(yīng)體系，分別采用本發(fā)明POCKIT Micro和ABI 7300型PCR儀進行檢測，其中，ABI 7300型PCR儀進行的是Real time PCR反應(yīng)，實驗結(jié)果如表2所示。

表2基于POCKIT Micro熒光PCR儀的細粒棘球蚴特異性檢測

從表2可以看出，相對于ABI 7300型PCR儀的檢測方法而言，本方法特異性強，只能檢出細粒棘球絳蟲，其它無關(guān)寄生蟲均無法檢出。

實施例5基于POCKIT Micro熒光PCR儀的臨床樣本檢測

1.臨床樣本DNA提取

臨床樣本：36個牦牛內(nèi)臟上的包囊(其中8個來自肝臟，其余均來自肺臟)，同一個包囊分別采用通用基因組DNA提取試劑盒和PetNAD核酸快速提取試劑盒提取DNA，用無菌去離子水調(diào)整DNA濃度為1.5ng/μl；其中，采用通用基因組DNA提取試劑盒提取的DNA用于ABI 7300型PCR儀，采用PetNAD核酸快速提取試劑盒提取的DNA用于本發(fā)明POCKIT Micro熒光PCR儀。

PetNAD核酸快速提取試劑盒的提取過程如圖2所示：

1)在離心管中加入200微升均質(zhì)樣品及600微升PB1溶液(裂解液)，將離心管快速地上下混合1分鐘；

2)加入600微升PB2溶液(洗脫液)，快速地上下混合離心管10秒后，取出600微升混合液到純化管柱中；離心1分鐘，丟棄收集管中液體；

3)加入600微升PB3溶液(洗脫液)，離心1分鐘，丟棄收集管中液體；

4)加入600微升PB4溶液(洗脫液)，離心1分鐘，丟棄收集管中液體，再離心3分鐘；將純化管柱更換至新的離心管中；

5)加入50微升PB5溶液(洗脫液)，室溫下放置1分鐘后離心1分鐘，得到核酸萃取物。

2.樣本檢測

將采用PetNAD核酸快速提取試劑盒提取的DNA作為模板，采用實施例2中的檢測方法進行檢測，同時采用ABI 7300型PCR儀對通用基因組DNA提取試劑盒提取的DNA進行檢測，兩者所采用的的試劑盒除了DNA模板不同，DNA模板的用量以及其余的試劑盒用量均相同。

3.檢測結(jié)果

表3 36個臨床樣本檢測結(jié)果

檢測結(jié)果如表3所示，陽性代表感染細粒棘球蚴，本方法和采用Real time PCR檢測結(jié)果完全一致，效力相當(dāng)。

上述說明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識進行改動。而本領(lǐng)域人員所進行的改動和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 西南民族大學(xué)

<120> 基于POCKIT Micro熒光PCR平臺的牛羊細粒棘球蚴病的檢測試劑盒及應(yīng)用

<130> 2017

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aaacaagcct caaacctaac agat 24

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtattctttg ttgtgtactg gttggg 26

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cacatcgaac cgacctt 17

<210> 4

<211> 99

<212> DNA

<213> 細粒棘球絳蟲ND1基因

<400> 4

aaacaagcct caaacctaac agatccaaaa gcacaccgaa ccgaccttaa aaatgaataa 60

ttgttgtaac caccccaacc agtacacaac aaagaatac 99