本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在水稻花藥早期發(fā)育階段特異性表達(dá)的高效啟動(dòng)子序列及該啟動(dòng)子在植物轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

水稻(Oryza sativa L.)是研究植物基因功能的單子葉模式作物，也是世界上最重要的糧食作物之一。然而，隨著人口數(shù)目的增長(zhǎng)、耕地面積減少等一系列問題的產(chǎn)生，如何在單位水平內(nèi)有效提高水稻的產(chǎn)量成為水稻育種中的一個(gè)長(zhǎng)期研究目標(biāo)。目前，雜種優(yōu)勢(shì)的應(yīng)用不僅能提高作物抵抗病蟲的能力，同時(shí)還能有效改善作物品質(zhì)、提高作物的產(chǎn)量。

在雜種優(yōu)勢(shì)的利用中，現(xiàn)有的人工創(chuàng)造的雄性不育的育性恢復(fù)和不育性的保持在方法上較繁瑣，而化學(xué)殺雄的方法則容易使植物受到毒害或造成環(huán)境破壞。為了克服這些方法的不足，利用基因工程構(gòu)建雄性不育系的方法越來越受到科學(xué)家的重視。通過基因工程技術(shù)構(gòu)建雄性不育依賴于調(diào)控植物雄蕊發(fā)育基因的發(fā)掘。被子植物的雄蕊主要包括花藥和花絲。花藥由二倍體的四層孢子體細(xì)胞(表皮、內(nèi)壁、中層以及絨氈層)和單倍體的配子體細(xì)胞組成。其中，最內(nèi)層絨氈層細(xì)胞的發(fā)育對(duì)于小孢子的發(fā)育至關(guān)重要。調(diào)控雄蕊發(fā)育尤其是花藥中調(diào)控絨氈層及小孢子發(fā)育的相關(guān)基因表達(dá)不正常時(shí)，往往會(huì)導(dǎo)致花粉敗育。因此，這些相關(guān)基因的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究，進(jìn)一步為基因工程創(chuàng)造雄性不育系提供了分子基礎(chǔ)。

基因在細(xì)胞中的表達(dá)首先取決于其自身啟動(dòng)子對(duì)其轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)。在組織特異性啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下，基因的表達(dá)往往會(huì)被限定于相應(yīng)的器官或組織中。利用這一特點(diǎn)，目的基因在花粉或花藥特異性啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下則能特定的在花粉或花藥組織中產(chǎn)生，從而調(diào)控基因的表達(dá)獲得雄性不育的植株。例如，早在90年代，科學(xué)家就通過將煙草花藥絨氈層特異表達(dá)啟動(dòng)子TA29與基因Barnase融合，并將此融合載體轉(zhuǎn)化植物，分別在煙草和油菜中成功獲得了花粉敗育的轉(zhuǎn)基因植株(Mariani C,Beuckcleer MD,Turettner J,Leemans J,Goldberh RB.Induction of male sterility in plants by a chimaeric ribonuclease gene.Nature,1990,347:737-741)。隨后，利用TA29啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)基因Barnase轉(zhuǎn)化苜蓿后，也成功在苜蓿中獲得了雄性不育的植物(Rosellini D.,Pezzott M.,Veronesi F.,Characterization of transgenic male sterility in alfalfa.Euphytica,2001,118:313-319)。水稻中的一個(gè)亞鐵血紅素折疊蛋白OsHFP在水稻的花藥中表達(dá)，將其啟動(dòng)子區(qū)域融合GUS報(bào)告基因?qū)煵葸M(jìn)行轉(zhuǎn)基因后發(fā)現(xiàn)，GUS報(bào)告基因能在煙草的花藥中表達(dá)(Chattopadhyay T.,Roy S.,Maiti M.K.Spatio-temporal regulation of the OsHFP gene promoter establishes the involvement of this protein in rice anther development.Biochem.Biophys.Res.Commun.2012,426:280-285)。另外，將控制玉米雄性不育的基因ZmMs45的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)RNA介導(dǎo)的沉默元件后，可以使植物出現(xiàn)育性降低的表型(Cigan A.M.,Haug-Collet K.,Clapp J.Transcriptional silencing of heterologous anther promoters in maize:a genetic method to replace detasseling for seed production.Plant Reprod.2014,27:109-120)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種能在花藥發(fā)育早期階段特異性表達(dá)的植物內(nèi)源啟動(dòng)子序列及其應(yīng)用。

本發(fā)明的另一目的是提供一種驅(qū)動(dòng)目的基因在花藥發(fā)育早期階段高效表達(dá)的新方法。

本發(fā)明提供的基因啟動(dòng)子，來源于水稻品種日本晴(Oryza sativa L.ssp.japonica cv.Nipponbare)，經(jīng)鑒定為水稻基因LOC_Os05g42240的啟動(dòng)子，命名為EASpro(early anther specific promoter)。該啟動(dòng)子能在花藥發(fā)育形成的早期特異性地表達(dá)。該啟動(dòng)子能驅(qū)動(dòng)目的基因特異的在花藥發(fā)育早期階段表達(dá)。

本發(fā)明提供的啟動(dòng)子EASpro是從水稻LOC_Os05g42240基因的ATG起始密碼子上游克隆到的一段3.0kb長(zhǎng)的DNA序列，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，或者是包含SEQ ID NO：1所示的全部或局部片段的核苷酸序列，且具有與SEQ ID NO：1所示核苷酸序列相同的啟動(dòng)子活性的序列。例如，在非應(yīng)答元件或作用元件中，替換一個(gè)或多個(gè)堿基。

含有啟動(dòng)子EASpro的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

在所述表達(dá)盒中，啟動(dòng)子EASpro的下游連接植物的內(nèi)源基因、外源基因或其他DNA片段，驅(qū)動(dòng)內(nèi)源基因、外源基因或其他DNA片段的表達(dá)。所述內(nèi)源基因和外源基因可以是結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因，或者結(jié)構(gòu)基因或調(diào)節(jié)基因的反義基因；所述其他DNA片段例如能夠干擾內(nèi)源基因表達(dá)的小RNA的基因。

所述重組載體是上述表達(dá)盒與質(zhì)粒、病毒或運(yùn)載體表達(dá)載體所構(gòu)建的重組載體。所述重組載體包括重組中間載體和重組植物表達(dá)載體。所述重組植物表達(dá)載體含有上述表達(dá)盒，并且能夠?qū)⑺霰磉_(dá)盒轉(zhuǎn)入植物宿主細(xì)胞、組織或器官中。

本發(fā)明所提供的啟動(dòng)子EASpro用于構(gòu)建組織特異表達(dá)的表達(dá)載體。將該啟動(dòng)子構(gòu)建在含有報(bào)告基因的載體中，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)現(xiàn)其所驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因在水稻花藥早期發(fā)育階段特異表達(dá)。因此，將目的基因連接到EASpro下游，構(gòu)建重組植物表達(dá)載體，利用啟動(dòng)子EASpro可以實(shí)現(xiàn)驅(qū)動(dòng)目的基因花藥早期發(fā)育階段特異性的表達(dá)。

本發(fā)明的啟動(dòng)子可以用于制備轉(zhuǎn)基因植物。比如，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)、基因槍法等方法將含有啟動(dòng)子EASpro的重組植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞、組織或器官中，再將該轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官培育成植株，獲得轉(zhuǎn)基因植物。用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體可為任意一種用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的雙元載體或可用于植物微彈轟擊的載體等，還可為在原核生物中復(fù)制的載體，如pUC系列載體或pBluescript系列載體等。

在本發(fā)明的實(shí)施例中，利用啟動(dòng)子EASpro構(gòu)建植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將所述載體轉(zhuǎn)化水稻品種，可以在水稻花藥的早期就觀察到報(bào)告基因GUS的表達(dá)；同時(shí)，原位雜交對(duì)該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的下游內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)后表明本發(fā)明提供的啟動(dòng)子EASpro可以控制其自身內(nèi)源基因在植物花藥早期階段表達(dá)，包括在絨氈層和小孢子母細(xì)胞中特異表達(dá)。

綜上所述，本發(fā)明提供了一種在花藥早期就具有高活性的水稻基因的啟動(dòng)子，可驅(qū)動(dòng)目的基因在花藥發(fā)育形成早期特異性表達(dá)，不僅可應(yīng)用于水稻育種，也可應(yīng)用于其他植物的育種。利用該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目的基因在花藥早期發(fā)育階段特異性表達(dá)可實(shí)現(xiàn)包括構(gòu)建水稻不育系和基因功能解析方面的應(yīng)用。

附圖說明

圖1顯示的是水稻啟動(dòng)子EASpro的GUS活性檢測(cè)。A～H為水稻不同時(shí)期的花藥中GUS染色結(jié)果，其中A、B的比例尺＝100微米；C、D、E的比例尺＝200微米；F、G、H的比例尺＝500微米。

圖2顯示的是EASpro驅(qū)動(dòng)的內(nèi)源基因LOC_Os05g42240在花藥不同發(fā)育階段的原位表達(dá)。其中A、B、E的比例尺＝10微米；C、D、F的比例尺＝20微米。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell,David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3^rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。

實(shí)施例1、LOC_Os05g42240基因啟動(dòng)子片段EASpro的克?。?/p>

選取水稻LOC_Os05g42240基因的起始密碼子ATG位點(diǎn)上游3kb的長(zhǎng)度作為候選啟動(dòng)子區(qū)域，以水稻品種日本晴的基因組DNA為模版，利用引物F1和R1(如下)進(jìn)行擴(kuò)增。隨后，將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物通過TOPO反應(yīng)構(gòu)建到pENTR中間載體中，然后與pHGWFS7終載體進(jìn)行LR反應(yīng)，構(gòu)建EASpro啟動(dòng)子融合GUS的分析載體EASpro-GUS。其中TOPO酶和LR酶購(gòu)自Invitrogen公司，pHGWFS7載體購(gòu)自根特大學(xué)。

F1:5’-CACCGAATTCGCTGCGTCTAATTTCCGG-3’(SEQ ID NO：2)

R1:5’-GGCGGAAGAAGCCGAGAGGTTAGTG-3’(SEQ ID NO：3)

實(shí)施例2、轉(zhuǎn)基因植株的獲得

(1)水稻愈傷誘導(dǎo)：

選取飽滿的日本晴水稻種子，剝?nèi)シN皮，滅菌洗滌后，均勻點(diǎn)入在帶有2毫克/升2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的滅菌MS固體培養(yǎng)基，32℃持續(xù)光照5天誘導(dǎo)愈傷形成。

(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化：

同時(shí)將帶有EASpro啟動(dòng)子片段的pHGWFS7載體用熱激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，涂布帶有50微克/升壯觀霉素的固體LB培養(yǎng)基，28℃黑暗培養(yǎng)2天后，篩選陽(yáng)性克隆。得到的陽(yáng)性克隆在含有50毫克/升壯觀霉素的固體AB培養(yǎng)基28℃黑暗培養(yǎng)3天，用于水稻轉(zhuǎn)化。

(3)水稻愈傷轉(zhuǎn)化：

取生長(zhǎng)狀況良好的愈傷組織，在菌液中浸泡2分鐘，之后在無(wú)菌濾紙上晾干，再將愈傷組織移至含有100微摩爾/升乙酰丁香酮的NB共培養(yǎng)培養(yǎng)基，25℃黑暗下共培養(yǎng)3天。

(4)篩選水稻愈傷：

共培養(yǎng)3天后，用無(wú)菌水洗滌愈傷5次，再用200毫升的含有500毫克/升羧芐青霉素鈉的無(wú)菌水洗一遍，小心倒去液體，用無(wú)菌鑷子將愈傷組織夾取至無(wú)菌濾紙上，晾干后轉(zhuǎn)移至NB篩選培養(yǎng)基上(含有2毫克/升的2,4-D、50毫克/升的潮霉素和400毫克/升的羧芐青霉素鈉)，32℃持續(xù)光照2周。

(5)陽(yáng)性愈傷的分化：

選取生長(zhǎng)良好呈嫩黃色的陽(yáng)性愈傷組織，用無(wú)菌鑷子移至NB預(yù)分化培養(yǎng)基(含有1毫克/升萘乙酸(NAA)、5毫克/升脫落酸(ABA)、2毫克/升激動(dòng)素(kinetin)、25毫克/升的潮酶素和200毫克/升的羧芐青霉素鈉)，32℃持續(xù)光照培養(yǎng)。2周后挑選生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織轉(zhuǎn)入MS分化培養(yǎng)基(含有0.02毫克/升NAA、2毫克/升kinetin、50毫克/升的潮酶素和200毫克/升的羧芐青霉素鈉)，32℃持續(xù)光照培養(yǎng)。待分化出來的幼苗長(zhǎng)至2至5毫米，轉(zhuǎn)入不含激素和抗生素的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)2到3周，之后移入土中置于溫室中生長(zhǎng)(溫度28-30℃，16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)。

實(shí)施例3、EASpro啟動(dòng)子在花藥組織中的活性分析

取陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因水稻生殖期不同階段的穎花，用預(yù)冷的90％丙酮處理20min；吸棄丙酮，加入50mM磷酸緩沖液(pH 7.2)潤(rùn)洗兩次；吸棄磷酸緩沖液，加入GUS染色液(pH 7.2的50mM磷酸緩沖液，鐵氰化鉀2mM，亞鐵氰化鉀2mM，X-gluc 1mM)適量，使植物材料完全浸沒在染色液中，抽真空1hr；將材料放入37℃溫箱中染色，待植物材料顯色完成后，吸棄GUS染色液，加入1mL 70％乙醇輕輕混勻脫色。在體視顯微鏡下觀察并拍照。

結(jié)果表明，在雄蕊原基分化的早期，雄蕊原基剛剛凸起，整個(gè)小花長(zhǎng)度約為0.1mm的時(shí)候，觀察不到GUS染色(見圖1中A)；而在稃片已經(jīng)開始伸長(zhǎng)，小花長(zhǎng)度約為0.2mm時(shí)，在雄蕊原基的部位能夠開始觀察到GUS染色(見圖1中B)；隨著小花的進(jìn)一步發(fā)育，雄蕊中GUS染色的程度逐漸加深(見圖中C和D)，直到雄蕊長(zhǎng)度達(dá)到0.7mm的時(shí)候仍可以觀察到雄蕊中明顯的GUS染色(見圖1中E和F)；此后，隨著雄蕊因花粉的成熟而顯現(xiàn)出黃色，雄蕊中的染色消失(見圖1中G和H)。

實(shí)施例4、原位雜交檢測(cè)EASpro啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的LOC_Os05g42240內(nèi)源基因的表達(dá)

(1)石蠟包埋及切片：

用50％FAA固定水稻幼嫩小穗，抽真空數(shù)小時(shí)，直至材料沉到固定液底部，再更換新的固定液，置于4℃冰箱過夜；隨后，經(jīng)過乙醇脫色、浸蠟以及包埋后，將材料切成8微米的蠟帶置于載玻片上，將載玻片置于37℃溫箱中干燥1-2d，放置于-20℃冰箱備用。

(2)探針制備：

以水稻基因組DNA為模板，根據(jù)引物anti-sense F/anti-sense R以及sense F/sense R(如下)進(jìn)行PCR反應(yīng)分別擴(kuò)增得到反義探針和正義探針的DNA鏈。隨后取13μL擴(kuò)增得到的DNA模板，進(jìn)行RNA探針的體外轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)結(jié)束后加入2μL DNase I，37℃水浴15min，電泳檢測(cè)轉(zhuǎn)錄情況；向體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中加入1/25體積的5M氯化鈉溶液，2.5倍體積的無(wú)水乙醇，沉淀過夜；離心棄上清，70％洗兩次，溶于50％去離子甲酰胺中，存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

anti-sense F：5’-AATTAATACGACTCACTATAGGGAGCTCCGGCGGCGCACGTTG-3’(SEQ ID NO：4)

anti-sense R：5’-GCGAAGCAGCAGCAGCAGCAGGTGGGGGGAGG-3’(SEQ ID NO：5)

sense F：5’-AATTAATACGACTCACTATAGGGGCGAAGCAGCAGCAGCAGCAG-3’(SEQ ID NO：6)

sense R：5’-AGCTCCGGCGGCGCCACGTTGTGGCCGGCGGC-3’(SEQ ID NO：7)

(3)原位雜交：

根據(jù)參考文獻(xiàn)(Brewer P.,Heisler M.G.,Hejátko J.,Friml J.,BenkováE.In situ hybridization for mRNA detection in Arabidopsis tissue sections.Nat.Protoc.2006,1,1462-1467)中描述的原位雜交方法，進(jìn)一步將石蠟切片進(jìn)行脫蠟復(fù)水、乙?；幚怼⒃俜忾]、脫水、雜交、洗片以及免疫檢測(cè)等。

原位雜交結(jié)果(見圖2)表明，EASpro啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的LOC_Os05g42240內(nèi)源基因從花藥原基開始就有表達(dá)。在早期，LOC_Os05g42240基因在花藥原基表皮及造孢細(xì)胞中染色較深(見圖2中A)；隨著花藥的發(fā)育，在花藥的表皮、壁細(xì)胞及造孢細(xì)胞中均有較深的染色(見圖2中B和C)，表明LOC_Os05g42240基因在這些部位高表達(dá)，說明EASpro啟動(dòng)子在這些部位具有高活性；在花藥發(fā)育后期，染色在表皮層中的信號(hào)降低，此時(shí)染色信號(hào)主要集中在中層、絨氈層以及小孢子母細(xì)胞中(見圖2中D)。EASpro啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的LOC_Os05g42240內(nèi)源基因原位雜交表達(dá)檢測(cè)結(jié)果再次驗(yàn)證了由啟動(dòng)子EASpro驅(qū)動(dòng)的基因能特異的在花藥發(fā)育早期階段表達(dá)。