本發(fā)明涉及生物技術(shù)和植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種水稻胚乳特異性表達(dá)啟動子及其應(yīng)用，該啟動子能夠在水稻轉(zhuǎn)基因調(diào)控體系中驅(qū)動目標(biāo)基因在胚乳中表達(dá)。

背景技術(shù)：

植物種子胚乳不僅是貯存對人類和動物碳水化合物主要來源的主要場所，還可以作為生物反應(yīng)器，用來生產(chǎn)在醫(yī)療和工業(yè)領(lǐng)域中具有重要價值的蛋白質(zhì)。如維生素A，具有刺激胰島素分泌預(yù)防糖尿病發(fā)生功能的GLP，具有降血糖作用的大豆球蛋白，乙肝疫苗和花粉過敏癥疫苗等均成功的在水稻中表達(dá)并高水平積累(Goto et al.,Nature Biotech 1999,17:282-286；Ye et al.,Science 2000,287:303-305；Katsube et al.,Plant Physiol 1999,120:1063-1073；Zheng et al.,Plant Physiol 1995,109:777-786)。然而缺少控制外源基因理想表達(dá)(理想表達(dá)部位，表達(dá)方式，表達(dá)時期和表達(dá)水平)的啟動子成為生物技術(shù)應(yīng)用的限制因子。為了控制外源基因在轉(zhuǎn)基因植物種子中高效專一表達(dá)，尋找具有種子胚乳特異表達(dá)特性的啟動子或相關(guān)調(diào)控序列具有重要意義。

啟動子是指基因中一段能準(zhǔn)確有效起始轉(zhuǎn)錄的DNA序列，通常位于基因的上游。啟動子是基因表達(dá)調(diào)控的重要元件，高等植物啟動子一般由兩部分組成：一部分是形成普遍性轉(zhuǎn)錄結(jié)果所需要的，通常稱為核心轉(zhuǎn)錄區(qū)，包括轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)和鄰近的TATA框；另一部分是覺得基因轉(zhuǎn)錄特異性和活性的區(qū)域，由多個保守序列組成。啟動子參與調(diào)控目標(biāo)基因在特定組織，發(fā)育階段以及環(huán)境條件下的表達(dá)。組織特異性啟動子是指除具有一般啟動子的結(jié)構(gòu)以外，通常還有增強(qiáng)子和沉默子的一般特性，在該種啟動子的調(diào)控下，基因的表達(dá)常常只發(fā)生在特定的組織或器官部位，并表達(dá)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。近年來，隨著人們對特異性啟動子結(jié)構(gòu)和功能的深入研究，發(fā)現(xiàn)了一系列的種子特異性啟動子。如水稻醇溶蛋白4a基因啟動子；谷蛋白基因啟動子；26kDa的球蛋白啟動子；水稻醇溶谷蛋白基因Os12g16890；水稻胚乳pENP1啟動子；水稻糊粉層p-NF-YB1啟動子；擬南芥α-L-阿拉伯糖苷酶基因啟動子；過敏蛋白RA5基因Os07g11510等。

水稻是世界上最主要的糧食作物之一，胚乳是淀粉合成和積累的主要器官。胚乳的形成和發(fā)育直接影響著水稻的產(chǎn)量的品質(zhì)，同時胚乳也是一個優(yōu)良的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)。通過胚乳特異性表達(dá)啟動子將外源基因?qū)肱呷閷Ω纳频久灼焚|(zhì)具有重要的實(shí)際意義。

在利用基因工程技術(shù)改良稻米品質(zhì)的研究中，選用具有胚乳特異性、表達(dá)水平高的啟動子是使外源基因能在水稻種子尤其是胚乳中高效特異地表達(dá)并積累基因產(chǎn)物的重要決定因素。盡管到目前為止已經(jīng)發(fā)明了一些組織特異性啟動子，但這些啟動子還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足基因工程改良稻米品質(zhì)的需求，因此本發(fā)明分離到的胚乳特異性表達(dá)的啟動子對植物品質(zhì)的改良有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有可用于水稻基因工程研究的組織特異表達(dá)啟動子數(shù)目的不足，因此提供一種驅(qū)動外源基因在水稻胚乳中特異性表達(dá)的啟動子，獲得含有該啟動子轉(zhuǎn)化序列及該啟動子的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種水稻胚乳特異性表達(dá)啟動子pEnd1，序列為來源于日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)，可以是以下序列之一：

1)啟動子的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；

2)與SEQ ID No:1核苷酸序列具有70％以上同源性；

3)在SEQ ID No:1序列中添加、取代、插入或缺失一個或一個以上核苷酸生成的突變體或等位基因或衍生物。

本發(fā)明提供一種水稻胚乳特異性表達(dá)啟動子的重組載體，重組載體包含根據(jù)本發(fā)明提供的上述植物胚乳特異性表達(dá)啟動子。

進(jìn)一步的，重組載體為重組表達(dá)載體，在重組表達(dá)載體中本發(fā)明提供的上述植物胚乳特異性表達(dá)啟動子可操作地連接與待表達(dá)的基因序列的上游，重組表達(dá)載體為將SEQ ID No:1所示序列即pEnd1或啟動子pEnd1構(gòu)建到pCAMBIA1305.1中得到重組表達(dá)載體。

本發(fā)明還提供一種水稻胚乳特異性表達(dá)啟動子的表達(dá)盒。

本發(fā)明還提供一種水稻胚乳特異性表達(dá)啟動子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。

本發(fā)明還提供一種水稻胚乳特異性表達(dá)啟動子的重組菌。

本文提供一種轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子包含本發(fā)明提供的上述植物胚乳特異性表達(dá)啟動子、上述表達(dá)盒、上述重組載體或上述重組菌；

優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)化子為轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、愈傷組織或植株。

本發(fā)明還提供一種水稻胚乳特異性表達(dá)啟動子pEnd1在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，所述轉(zhuǎn)基因植物中的外源基因是在胚乳中特異性表達(dá)的。

進(jìn)一步的：所述培育轉(zhuǎn)基因植物，是將所述外源基因連接于所述植物胚乳特異性表達(dá)啟動子下游，通過植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入植物中，篩選得到在胚乳中特異性表達(dá)所述外源基因的轉(zhuǎn)基因植物。

進(jìn)一步的，所述胚乳特異性表達(dá)啟動子下游還連接有調(diào)控基因表達(dá)的調(diào)控元件；所述外源基因?yàn)榈鞍拙幋a基因和/或非蛋白編碼基因；所述蛋白編碼基因?yàn)槠焚|(zhì)改良基因；所述非蛋白編碼基因?yàn)檎xRNA基因和/或反義RNA基因。

本發(fā)明的有益技術(shù)效果是：本發(fā)明的植物胚乳特異性表達(dá)啟動子是通過設(shè)計引物，以水稻基因組DNA為模板，利用PCR方法從水稻中分離得到pEnd1啟動子。通過其在水稻中的表達(dá)特異性實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明的啟動子使β-葡糖苷酸酶(GUS)報告基因只在水稻種子胚乳中特異性表達(dá)。說明本發(fā)明的啟動子可以啟動外源基因在植物的胚乳中特異性的表達(dá)，適用于任何種子具有胚乳的植物，即單子葉植物或胚乳型雙子葉植物。

利用本發(fā)明的啟動子可提高外源基因在植物胚乳中的表達(dá)和累積水平，可改良種子品質(zhì)、將具有生理活性的蛋白或短肽導(dǎo)入種子中創(chuàng)制保健型功能新品種、利用種子作生物反應(yīng)器生產(chǎn)有用外源蛋白或可食性疫苗，增加農(nóng)產(chǎn)品科技附加值等。本發(fā)明的啟動子及其應(yīng)用為利用生物技術(shù)改良種子品質(zhì)、分子醫(yī)藥農(nóng)場等研究奠定了基礎(chǔ)，具有極大的應(yīng)用前景。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1：是本發(fā)明的技術(shù)路線圖；

圖2：利用qRT-PCR的方法來分析pEnd1在基因組中所驅(qū)動的基因(基因號：Os02g0202400)的時空表達(dá)模式，以玉米UBQ作為內(nèi)參基因；

圖3：表示雙元載體pCAMBIA1305.1結(jié)構(gòu)示意圖；

圖4：切掉35S啟動子后的pCAMBIA1305.1載體(35S-free-GUS)；LB、RB分別為pCAMBIA1305.1中T-DNA的左邊界和右邊界；hyg為潮霉素抗性篩選基因；gus為報告基因GUS；MCS表示多克隆位點(diǎn)；箭頭方向表示基因或啟動子表達(dá)的方向；

圖5：構(gòu)建好的以pCAMBIA1305.1為骨架的pEnd1-GUS表達(dá)載體簡圖；LB、RB分別為pCAMBIA1305.1中T-DNA的左邊界和右邊界；hyg為潮霉素抗性篩選基因；gus為報告基因GUS；pEnd1表示啟動子；箭頭方向表示基因或啟動子表達(dá)的方向；

圖6：35S-free-GUS轉(zhuǎn)化植株的各個組織的GUS染色；A為根；B為莖稈；C為葉片；D為葉鞘；E為幼穗；F為花；G為種子(含胚和胚乳)；

圖7：由pEnd1驅(qū)動GUS基因轉(zhuǎn)化植株的各個組織的GUS染色；A為根；B為莖稈；C為葉片；D為葉鞘；E為幼穗；F為花；G為種子(含胚和胚乳)。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1

如圖1所示，首先從華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室水稻全生育期表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)庫CREP(http://crep.ncpgr.cn)(Wang et al.,2010)上發(fā)現(xiàn)了一個可能是胚乳特異表達(dá)的候選基因，在美國國立生物研究所網(wǎng)站NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上獲得該基因的序列，如SEQ ID No:2所示，共1278bp，以這1278bp序列設(shè)計引物來做qRT-PCR反應(yīng)從而進(jìn)一步確定其表達(dá)譜，qRT-PCR結(jié)果顯示(圖2)：該基因僅在胚乳中表達(dá)。在此基礎(chǔ)上用特異性引物以PCR的方法從水稻日本晴基因組中擴(kuò)增得到一個被命名為pEnd1的啟動子候選片段，將該啟動子候選片段pEnd1裝載到雙元載體pCAMBIA1305.1(圖3)上，裝配成pEnd1-GUS載體(圖5)，將切掉35S啟動子后的pCAMBIA1305.1載體命名為35S-free-GUS，作為陰性對照(圖4)，再通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將pEnd1-GUS和35S-free-GUS轉(zhuǎn)入水稻受體Kitaake中。獲得轉(zhuǎn)基因植株后通過GUS組織化學(xué)染色分析，考察該啟動子在水稻各個組織中的表達(dá)變化，進(jìn)而驗(yàn)證和克隆該啟動子。檢測結(jié)果表明：在轉(zhuǎn)35S-free-GUS的陽性植株中水稻各個組織均無GUS表達(dá)(圖6)，而在轉(zhuǎn)pEnd1-GUS的陽性植株中GUS基因僅在轉(zhuǎn)化植株的胚乳中大量表達(dá)，在其他組織如葉片、葉鞘、莖稈、根、幼穗中均不表達(dá)(圖7)。

實(shí)施例2啟動子的獲得

(1)水稻種子胚乳特異性表達(dá)基因的篩選

熒光定量PCR篩選在水稻種子胚乳特異性表達(dá)的基因

選取日本晴水稻根、莖、葉片、葉鞘、幼穗及不同發(fā)育時期的水稻種子胚乳(6、9、12、15、18、21、24天)，分別提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，通過熒光定量PCR鑒定水稻胚乳特異性表達(dá)基因(基因號：Os02g0202400)在不同組織及發(fā)育時期的表達(dá)譜，確定該基因在水稻胚乳中特異性表達(dá)。

(2)水稻種子胚乳特異性表達(dá)啟動子片段的克隆

提取水稻日本晴(Oryza sativa L.公眾可從中國水稻研究所獲得)葉片基因組DNA作為模板，用引物1:5'-CCATGATTACGAATTCGACGATGAGCCGGTAACAAT-3'(下劃線部分為接頭)和引物2：5'-CTCAGATCTACCATGGCGATCACACCAAAATTAAAA-3'(下劃線部分為接頭)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到2141bp的PCR產(chǎn)物。

PCR擴(kuò)增的體系：KOD FX buffer 25μl、dNTP 6μl、基因組DNA(Nipponbare)4μl、Forward primer 2μl、Reverse primer 2μl、KOD FX 1μl、ddH₂O 10μl，PCR擴(kuò)增程序如下：95℃2min，98℃30s，58℃30s，68℃2.5min，35個循環(huán)，68℃5min。

產(chǎn)物經(jīng)過測序，該P(yáng)CR具有序列表中SEQ ID No:1所示的核苷酸，將其命名為pEnd1。

實(shí)施例3啟動子的功能驗(yàn)證

1、轉(zhuǎn)pEnd1水稻的獲得

(1)重組載體的獲得

將由實(shí)施例1得到的2141bp的PCR產(chǎn)物pEnd1與表達(dá)載體pCAMBIA1305.1(公眾可從中國水稻研究所獲得，在載體的結(jié)構(gòu)示意圖如圖3所示)的連接是依賴于In-fusion重組的方法：先用EcoR I和NcoI雙酶切載體pCAMBIA1305.1，將35S啟動子切掉，再用帶接頭的PCR產(chǎn)物和經(jīng)EcoR I和NcoI酶切過的載體在50℃進(jìn)行In-fusion重組即可獲得重組載體，將其命名為pEnd1-GUS(圖5)。用EcoR I和Spe I雙酶切表達(dá)載體pCAMBIA1305.1，將載體上的35S和catalase intron片段一起切掉，再用帶EcoR I和Spe I接頭的引物把catalase intron片段擴(kuò)增出來，重新和EcoR I和Spe I酶切后的載體在50℃進(jìn)行In-fusion重組即可獲得不含35S的重組載體，將其命名為35S-free-GUS(圖4)。

具體方法如下：

1)pCAMBIA1305.1載體用EcoR I和NcoI酶切

EcoR I和NcoI酶切體系(50μl)：pCAMBIA1305.1質(zhì)粒2μg、buffer 10μl、EcoR I 2μl、Nco I 2μl、ddH₂O補(bǔ)足到50μl，37℃酶切2小時，回收11846bp的線性化pCAMBIA1305.1。

2)帶接頭的啟動子pEnd1PCR產(chǎn)物擴(kuò)增

以葉片基因組DNA作為模板，用帶接頭的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增出帶EcoR I和NcoI接頭的啟動子pEnd1片段。

擴(kuò)增體系(50μl)及PCR程序同上所述。

3)In-fusion重組

重組體系如下(2.5μl)：線性化的pCAMBIA1305.1載體1μl、帶接頭的啟動子pEnd1PCR產(chǎn)物1μl、In-fusion酶0.5μl，50℃重組30min，得到重組產(chǎn)物。

4)pCAMBIA1305.1載體用EcoR I和Spe I酶切

EcoR I和Spe I酶切體系(50μl)：pCAMBIA1305.1質(zhì)粒2μg、Buffer 10μl、EcoR I 2μl、Spe I 2μl，ddH₂O補(bǔ)足到50μl，37℃酶切2h，回收線性化pCAMBIA1305.1。

5)帶接頭的catalase intron PCR產(chǎn)物擴(kuò)增

以空pCAMBIA1305.1作為模板，用帶接頭的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增出帶EcoR I和Spe I接頭的catalase intron片段。

擴(kuò)增體系(50μl)及PCR程序同上所述。

6)In-fusion重組

重組體系如下(2.5μl)：線性化的pCAMBIA1305.1載體1μl、帶接頭的catalase intron PCR產(chǎn)物1μl，In-fusion酶0.5μl，50℃重組30min，得到重組產(chǎn)物。

將上述測序正確的pEnd1-GUS及35S-free-GUS質(zhì)粒熱激轉(zhuǎn)化入Trans10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，得到克隆。

提取克隆質(zhì)粒，酶切檢測陽性克隆，結(jié)果表明pEnd1-GUS質(zhì)粒為序列表中的SEQ ID No:1所示的pEnd1插入表達(dá)載體pCAMBIA1305.1中得到的載體，且插入的位置為GUS基因的前面(替換原來GUS基因前面的35S啟動子)，即為重組載體。

(2)、重組菌的獲得

將重組載體pEnd1-GUS和35S-free-GUS熱激轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株，得到重組菌。

提取重組菌的質(zhì)粒，經(jīng)過測序，該質(zhì)粒分別為pEnd1-GUS和35S-free-GUS，說明含有該質(zhì)粒的重組菌為陽性，命名為EHA105/pEnd1-GUS和EHA105/35S-free-GUS。

農(nóng)桿菌熱激轉(zhuǎn)化法的具體方法如下：

1)將從-80℃冰箱中取出的農(nóng)桿菌感受態(tài)放置于冰上，待其自然融化；

2)加入2μl質(zhì)粒，輕輕彈勻，冰上放置30min；

3)放入液氮中5min；

4)37℃熱激5min；

5)取出迅速插入冰上2min，加入無抗YEP液體培養(yǎng)基，28℃，150rpm搖4h；

6)吸取100μl菌液均勻涂布在含有卡納霉素，利福平的YEP平板上，28℃倒置培養(yǎng)3-4天。

7)挑取單克隆于加入卡納霉素，利福平的YEP液體培養(yǎng)基中，28℃，200rpm搖床中培養(yǎng)1天。

8)從中取0.2ml轉(zhuǎn)接到20ml(1/100比例稀釋)同樣YEP抗性培養(yǎng)基中，同樣條件下培養(yǎng)到OD₆₀₀＝0.5便可進(jìn)行轉(zhuǎn)化愈傷組織。

(3)、轉(zhuǎn)pEnd1-GUS和35S-free-GUS水稻的獲得及分子鑒定

1)轉(zhuǎn)化

a)轉(zhuǎn)化受體的選擇

將成熟的水稻品種“Kitaake”種子去殼，經(jīng)過一系列消毒后進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)，挑選生長旺盛的愈傷用作轉(zhuǎn)化的受體。

b)遺傳轉(zhuǎn)化

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(Hiei Y,Ohta S,Komari T,Kumashiro(1994),Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.The plant Journal,6:271-282)，將含35S-free-GUS和重組載體pEnd1-GUS的EHA105菌株侵染水稻愈傷，在黑暗，25℃條件下共培養(yǎng)3天，在含有120mg/L G418的篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選抗性愈傷。將篩選到的抗性愈傷在預(yù)分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)10天，再將預(yù)分化的愈傷轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基上在光照條件下培養(yǎng)。1個月后得到抗性轉(zhuǎn)基因植株。

待根系生長良好，小苗長至8cm時打開蓋煉苗5天，取出轉(zhuǎn)基因苗并洗掉根上殘留的培養(yǎng)基，移栽到土壤中，放到無陽光直射的溫室中適當(dāng)培養(yǎng)，然后移入室外栽培。得到T₀代轉(zhuǎn)基因水稻。

2)轉(zhuǎn)基因陽性植株的鑒定

將T₀代轉(zhuǎn)基因水稻移入溫室后，待其返青，然后分單株取一小段幼嫩葉片，提取其基因組DNA為模板，用PCR的方法檢測轉(zhuǎn)基因陽性植株。擴(kuò)增片段為載體pCAMBIA1305.1上的部分片段加上啟動子pEnd1的部分片段，大小為1074bp。引物序列為pEnd1-F：CCCAGGCTTTACACTTTATGCT，pEnd1-R：TTCACGGCTAGTCAATGGTTTT。

PCR擴(kuò)增程序如下：95℃ 2min，98℃ 30s，58℃ 30s，68℃ 1min，35個循環(huán)，68℃ 5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8％瓊脂糖膠電泳檢測。通過此方法，可剔除假陽性植株。

實(shí)施例4

轉(zhuǎn)pEnd1-GUS和35S-free-GUS水稻GUS組織化學(xué)染色法驗(yàn)證啟動子功能

分別取陽性T₀代轉(zhuǎn)pEnd1-GUS和35S-free-GUS水稻的根、莖稈、葉片、葉鞘、幼穗、小花、以及灌漿中期(開花后10到15天)的種子，分別將以上各組織切成適當(dāng)大小并對種子進(jìn)行橫切或縱切。將切好的各個組織侵入GUS染液，抽真空10min，然后放入37℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)1h，觀察是否出現(xiàn)GUS信號并拍照。

以T₀代轉(zhuǎn)35S-free-GUS水稻為陰性對照。

T₀代轉(zhuǎn)35S-free-GUS水稻的GUS組織化學(xué)染色結(jié)果如圖6所示，可以看出，GUS基因在各個組織中均不表達(dá)。

T₀代轉(zhuǎn)pEnd1-GUS水稻的GUS組織化學(xué)染色結(jié)果如圖7所示，可以看出，T₀代轉(zhuǎn)pEnd1-GUS水稻的GUS基因在種子的胚乳中具有表達(dá)活性(藍(lán)色)，而在其他部位均不表達(dá)。

因此，pEnd1為啟動子，其可以啟動目標(biāo)基因如GUS在種子的胚乳中特異表達(dá)。

本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，除非另外定義，這里使用的所有術(shù)語(包括技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員的一般理解相同的意義。還應(yīng)該理解的是，諸如通用字典中定義的那些術(shù)語應(yīng)該被理解為具有與現(xiàn)有技術(shù)的上下文中的意義一致的意義，并且除非像這里一樣定義，不會用理想化或過于正式的含義來解釋。

最后所應(yīng)說明的是：以上實(shí)施例僅用以說明而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解：依然可以對本發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。