本發(fā)明涉及啟動(dòng)子3M1F及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

2,4,6-三硝基甲苯(英文名稱為2,4,6-Trinitrotoluene，簡(jiǎn)稱2,4,6-TNT或TNT)是一種無色或淡黃色晶體狀硝基苯爆炸物，是一種重要的化工原料，在國防工業(yè)、礦山開采、基礎(chǔ)建設(shè)等領(lǐng)域均有重要作用。在炸藥生產(chǎn)，使用企業(yè)區(qū)，以及許多戰(zhàn)場(chǎng)遺址、軍事訓(xùn)練區(qū)，TNT污染一直是主要的環(huán)境問題之一。TNT能夠滲入到土壤和水系統(tǒng)當(dāng)中，長期參與生態(tài)循環(huán)，甚至產(chǎn)生“粉紅水”，其清理十分困難和昂貴。已有報(bào)道表明TNT對(duì)微生物、綠藻類植物和動(dòng)物均有毒害作用，同時(shí)TNT及其降解物可以被引進(jìn)食物鏈中，進(jìn)而對(duì)人類健康造成嚴(yán)重的不良影響。短期內(nèi)接觸大量三硝基甲苯后，會(huì)引起急性中毒，嚴(yán)重者可引起呼吸衰竭而死亡。長期接觸三硝基甲苯后，可引起慢性中毒，其損害的靶器官主要是肝、眼睛、血液系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)，同時(shí)造成免疫功能降低，罹患貧血和癌癥的幾率也會(huì)大大增加。

由于TNT具有明顯的毒害作用，目前基于TNT的理化性質(zhì)，已經(jīng)開發(fā)了許多TNT的檢測(cè)技術(shù)，如高效液相色譜(HPLC)、紫外、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)、激光表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)、核磁共振、離子遷移譜等方法，然而它們都需要昂貴和復(fù)雜的儀器或繁復(fù)的樣品制備方法。生物傳感器作為現(xiàn)在工程技術(shù)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)，以生物活性單元(如酶、抗體、核酸、細(xì)胞等)作為生物敏感元件與待檢測(cè)的目標(biāo)物相互作用后產(chǎn)生響應(yīng)信號(hào)，信號(hào)處理元件對(duì)響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行接收、加工、轉(zhuǎn)換、輸出，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的定性、定量檢測(cè)。

目前，基于目標(biāo)物生物活性的生物傳感器技術(shù)已被廣泛研究以用于一些特殊的化合物、化學(xué)基團(tuán)以及一些可造成環(huán)境污染的有毒化合物的檢測(cè)。常用的感應(yīng)元件是參與了細(xì)胞應(yīng)答的啟動(dòng)子區(qū)域，而在眾多可選擇的響應(yīng)元件(通常為報(bào)告基因)中，化學(xué)發(fā)光(如luxCDABE of Photorhabdusluminescens)和熒光蛋白(如green fluorescent protein，GFP)是最為普遍的兩種。當(dāng)前,有大量針對(duì)重金屬毒害化合物的生物傳感元件的報(bào)道，例如，DNA酶(脫氧核糖酶)由于對(duì)重金屬離子如Pb(II)、Cu(II)和Zn(II)具有高的特異性和靈敏性而被應(yīng)用于重金屬離子傳感器。使用熒光基團(tuán)和淬光基團(tuán)標(biāo)記的DNA酶與Pb(II)、Hg(II)和Cu(II)絡(luò)合的功能化的DNA酶生物傳感器可以將檢出限降低到10nM。Liao等以鈣粘蛋白為調(diào)控基因，以綠色熒光蛋白為報(bào)告基因，成功構(gòu)建大腸桿菌DH5α細(xì)胞生物傳感器用于土壤和沉積物中重金屬的測(cè)定，可檢測(cè)到0.1nmol/L的Sb(III)、Cd(Ⅱ)和10nmol/L的Pb(Ⅱ)，靈敏度高且價(jià)格便宜，在實(shí) 際樣品中具有應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供啟動(dòng)子3M1F及其應(yīng)用。

本發(fā)明提供的啟動(dòng)子，來源于大腸桿菌K-12 MG1655，命名為3M1F，為序列表的序列1自5’末端第7至93位核苷酸所示的DNA分子。

本發(fā)明還保護(hù)序列表的序列1自5’末端第7至93位核苷酸所示的DNA分子在啟動(dòng)目的基因表達(dá)中的應(yīng)用。所述目的基因可為報(bào)告基因，具體可為熒光標(biāo)記基因，更具體可為GFP基因。GFP基因具體可如序列表的序列2所示。所述啟動(dòng)目的基因表達(dá)具體可為在2,4,6-三硝基甲苯和/或2,6-二硝基甲苯和/或甲苯和/或2,4-二硝基甲苯的誘導(dǎo)作用下啟動(dòng)目的基因表達(dá)。

本發(fā)明還保護(hù)一種DNA分子(融合基因)，自上游至下游依次包括序列表的序列1自5’末端第7至93位核苷酸所示的DNA分子和報(bào)告基因。所述DNA分子中，由序列表的序列1自5’末端第7至93位核苷酸所示的DNA分子啟動(dòng)所述報(bào)告基因的表達(dá)。所述報(bào)告基因具體可為熒光標(biāo)記基因，更具體可為GFP基因。GFP基因具體可如序列表的序列2所示。

本發(fā)明還保護(hù)含有所述融合DNA的重組質(zhì)粒。所述重組質(zhì)粒具體可為在pET-24(+)載體的多克隆位點(diǎn)插入序列表的序列1自5’末端第7至93位核苷酸所示的DNA分子和GFP基因得到的重組質(zhì)粒，所述重組質(zhì)粒中由序列表的序列1自5’末端第7至93位核苷酸所示的DNA分子啟動(dòng)所述GFP基因的表達(dá)。GFP基因具體可如序列表的序列2所示。所述重組質(zhì)粒具體可為在pET-24(+)載體的BglⅡ和Xba Ⅰ酶切位點(diǎn)之間插入序列表的序列1自5’末端第7至93位核苷酸所示的DNA分子、BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)之間插入GFP基因得到的重組質(zhì)粒。

本發(fā)明還保護(hù)將所述重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主菌得到的重組菌。所述宿主菌具體可為大腸桿菌，更具體可為大腸桿菌BL21(DE3)。所述重組菌即為用于檢測(cè)2,4,6-三硝基甲苯和/或2,6-二硝基甲苯和/或甲苯和/或2,4-二硝基甲苯的生物傳感器。

本發(fā)明還保護(hù)所述重組菌在檢測(cè)2,4,6-三硝基甲苯和/或2,6-二硝基甲苯和/或甲苯和/或2,4-二硝基甲苯中的應(yīng)用。

合成生物學(xué)是21世紀(jì)初提出的一門全新的交叉學(xué)科，2005年MIT的Endy發(fā)表了“工程生物學(xué)的基礎(chǔ)”綜述論文,明確提出在合成生物學(xué)中引入工程中常用的“標(biāo)準(zhǔn)化”、“復(fù)雜系統(tǒng)解藕”、“概念抽象化”做法,將合成生物學(xué)涉及的生物系統(tǒng)分成DNA、零件、裝置、系統(tǒng)這樣4個(gè)層次。合成生物學(xué)的研究目前主要朝兩個(gè)方向發(fā)展：一是設(shè)計(jì)、建造具有生物功能的元件如生物分子或反應(yīng)系統(tǒng)、生物裝置和基因網(wǎng)絡(luò)、多元件組成的功能單位及其更高級(jí)復(fù)雜系統(tǒng)的組裝等。二是開發(fā)建立生物制造所需要的技術(shù)，包 括如大分子基因組合成技術(shù)，生物功能元件的分析與測(cè)試技術(shù)，生物體信息的捕獲與處理技術(shù)，系統(tǒng)模擬與控制技術(shù)等。在此基礎(chǔ)上合成生物學(xué)界提出了Bio-Brick思想，既構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)，便于在活細(xì)胞體內(nèi)，使用現(xiàn)有生物元件組合搭建新的基因線路和生命系統(tǒng)。本發(fā)明提供了自然界不存在的全新啟動(dòng)元件，利用本發(fā)明提供的啟動(dòng)子，按照Bio-brick思想，作為生物傳感器中最為核心的檢測(cè)元件，其他生物學(xué)家可以組裝出各種裝地雷探測(cè)的傳感線路，并為新功能的基因線路和生命系統(tǒng)的搭建提供必備的貯備元件。

本發(fā)明的發(fā)明人首先從大腸桿菌中篩選應(yīng)答較為靈敏的啟動(dòng)元件，然后對(duì)啟動(dòng)元件進(jìn)行隨機(jī)突變并構(gòu)建隨機(jī)啟動(dòng)子文庫，獲得了一批可響應(yīng)靶標(biāo)分子TNT及其衍生物的全新啟動(dòng)子。本發(fā)明的發(fā)明人采用3M1F，以綠色熒光蛋白為報(bào)告基因，構(gòu)建了以大腸桿菌為底盤的全細(xì)胞生物傳感器，并在檢測(cè)中體現(xiàn)出了良好的特異性和靈敏度，為后期生物傳感器更深層次的開發(fā)提供了良好的元件儲(chǔ)備。本發(fā)明提供的生物傳感器不僅可應(yīng)用于戰(zhàn)時(shí)及戰(zhàn)后地雷等爆炸物位置的檢測(cè)鑒定，還為土壤及水環(huán)境中的TNT檢測(cè)提供新的方法。

附圖說明

圖1為實(shí)施例3的結(jié)果。

圖2為實(shí)施例4的結(jié)果。

圖3為實(shí)施例5中3M1F的EC₂₀₀值。

圖4為實(shí)施例5中對(duì)照片段的EC₂₀₀值。

圖5為實(shí)施例6的結(jié)果。

圖6為實(shí)施例7的結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。

pET24-GFP載體：將序列表的序列2所示的GFP基因插入pET-24(+)載體的BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)之間，得到pET24-GFP載體。pET-24(+)載體：EMD Biosciences(Novagen)，產(chǎn)品目錄號(hào)為69749-3。大腸桿菌BL21(DE3)：博邁德生物公司(北京，中國)。載體pMD18-T：Takara Biotechnology(Dalian,China)。

2,4,6-Trinitrotoluene(TNT)、2,4-Dinitrotoluene(2,4-DNT)、2,6-Dinitrotoluene(2,6-DNT)、1,3-Dinitrobenzene(1,3-DNB)、1,4-Dinitrobenzene(1,4-DNB)、2-Nitrotoluene(2-NT)、3-Nitrotoluene(3-NT)、 4-Nitrotoluene(4-NT)、苯(Benzene)、甲苯(Toluene)、硝基苯(Nitrobenzene)均購自Sigma-Aldrich公司。TNT的溶解采用超聲法，將TNT粉末加入蒸餾水中，800W超聲15分鐘。其它化合物均先溶于甲醇，然后在Tris緩沖液(200mM，pH7.0)中稀釋。

實(shí)施例1、啟動(dòng)子序列的發(fā)現(xiàn)

1、提取大腸桿菌K-12 MG1655的染色體基因組。

2、將步驟1得到的染色體基因組作為模板，采用NEB Q5 MIX高保真PCR體系擴(kuò)增出啟動(dòng)元件。

3、將步驟2得到的所有擴(kuò)增產(chǎn)物分別經(jīng)過Taq酶聚合反應(yīng)添加dATP，形成polyA，再通過DNA連接操作連入載體pMD18-T，得到重組質(zhì)粒。

4、用限制性內(nèi)切酶Xba Ⅰ和BglⅡ雙酶切步驟3得到的重組質(zhì)粒，回收小片段。

5、用限制性內(nèi)切酶Xba Ⅰ和BglⅡ雙酶切pET24-GFP載體，回收載體骨架。

6、將步驟4得到的小片段與步驟5得到的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒。

7、將步驟6得到的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)，得到重組菌。

8、將步驟7得到的重組菌在不同的TNT濃度下進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)其中部分啟動(dòng)元件在不同濃度的TNT濃度之下可以不同程度的激發(fā)下游報(bào)告基因GFP的表達(dá)，并且在15mg/L的TNT濃度下應(yīng)答反應(yīng)最為明顯。

9、在步驟8的基礎(chǔ)上，提取各個(gè)啟動(dòng)元件在發(fā)揮功能中的一致序列，進(jìn)行隨機(jī)突變并構(gòu)建隨機(jī)啟動(dòng)子文庫，將新啟動(dòng)子文庫中的各個(gè)DNA分子依次進(jìn)行步驟3、4、5和6，得到庫容量為4500的promoter：：GFP文庫(即重組質(zhì)粒庫)。

10、將步驟9得到的重組質(zhì)粒分別導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)，得到各個(gè)重組菌。

11、取步驟10得到的重組菌，培養(yǎng)至OD_600nm＝0.2時(shí)加入TNT并使其濃度為15mg/L，然后30℃、200rpm振蕩培養(yǎng)8小時(shí)，吸取200μl菌液至黑色96孔板，在Pekin Elmer2300 Multilablel Reader進(jìn)行檢測(cè)(GFP檢測(cè)條件為excitation/emission,485/535nm)，數(shù)值在200000以上的定為陽性克隆，將陽性克隆轉(zhuǎn)接后再次進(jìn)行熒光值檢測(cè)，最終在15mg/L TNT濃度下篩選出了1個(gè)受到TNT調(diào)控應(yīng)答強(qiáng)烈的克隆，將相應(yīng)的啟動(dòng)子命名為3M1F。

3M1F的核苷酸序列如序列表的序列1自5’末端第7至93位核苷酸所示。

實(shí)施例2、重組菌和對(duì)照菌的獲得

一、重組菌的獲得

1、合成序列表的序列1所示的雙鏈DNA分子。

2、用限制性內(nèi)切酶BglⅡ和Xba Ⅰ雙酶切步驟1得到的雙鏈DNA分子，回收酶切 產(chǎn)物。

3、用限制性內(nèi)切酶BglⅡ和Xba Ⅰ雙酶切pET24-GFP載體，回收約6000bp的載體骨架。

4、將步驟2的酶切產(chǎn)物和步驟3的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒。

5、將步驟4得到的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)，得到重組菌。

二、對(duì)照菌的獲得

1、將T7啟動(dòng)子(序列表的序列3所示的雙鏈DNA分子)插入pET24-GFP載體的BglⅡ和Xba Ⅰ酶切位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒。

2、將步驟1得到的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)，得到對(duì)照菌甲。

3、將N1片段(序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子)插入pET24-GFP載體的Bgl Ⅱ和Xba Ⅰ酶切位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒。

4、將步驟3得到的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)，得到對(duì)照菌乙。

5、將N2片段(序列表的序列5所示的雙鏈DNA分子)插入pET24-GFP載體的Bgl Ⅱ和Xba Ⅰ酶切位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒。

6、將步驟5得到的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)，得到對(duì)照菌丙。

7、將recA片段(序列表的序列6所示的雙鏈DNA分子)插入pET24-GFP載體的BglⅡ和Xba Ⅰ酶切位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒。

8、將步驟7得到的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)，得到對(duì)照菌A。

9、將umuDC片段(序列表的序列7所示的雙鏈DNA分子)插入pET24-GFP載體的BglⅡ和Xba Ⅰ酶切位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒。

10、將步驟9得到的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)，得到對(duì)照菌B。

11、將SulA片段(序列表的序列8所示的雙鏈DNA分子)插入pET24-GFP載體的BglⅡ和Xba Ⅰ酶切位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒。

12、將步驟11得到的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)，得到對(duì)照菌C。

實(shí)施例3、啟動(dòng)子的功能驗(yàn)證

重組菌TNT組的處理方法：將實(shí)施例2的步驟一得到的重組菌接種至LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD_600nm＝0.6時(shí)加入TNT并使其濃度為15mg/L，然后30℃、200rpm振蕩培養(yǎng)12h，然后吸取200μl菌液至96孔聚苯乙烯檢測(cè)板(Bio-rad)，在Pekin Elmer 2300Multilablel Reader進(jìn)行檢測(cè)(GFP檢測(cè)條件為excitation/emission,485/535nm)。

重組菌對(duì)照組的處理方法：將實(shí)施例2的步驟一得到的重組菌接種至LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD_600nm＝0.6，然后30℃、200rpm振蕩培養(yǎng)12h，然后吸取200μl菌液至96孔聚苯乙烯檢測(cè)板(Bio-rad)，在Pekin Elmer 2300 Multilablel Reader進(jìn)行檢測(cè) (GFP檢測(cè)條件為excitation/emission,485/535nm)。

對(duì)照菌TNT組的處理方法：將實(shí)施例2的步驟二得到的對(duì)照菌甲接種至LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD_600nm＝0.6時(shí)加入TNT并使其濃度為15mg/L，然后30℃、200rpm振蕩培養(yǎng)12h，然后吸取200μl菌液至96孔聚苯乙烯檢測(cè)板(Bio-rad)，在Pekin Elmer 2300Multilablel Reader進(jìn)行檢測(cè)(GFP檢測(cè)條件為excitation/emission,485/535nm)。

對(duì)照菌IPTG組的處理方法：將實(shí)施例2的步驟二得到的對(duì)照菌甲接種至LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD_600nm＝0.6時(shí)加入IPTG并使其濃度為1mM，然后30℃、200rpm振蕩培養(yǎng)12h，然后吸取200μl菌液至96孔聚苯乙烯檢測(cè)板(Bio-rad)，在Pekin Elmer 2300Multilablel Reader進(jìn)行檢測(cè)(GFP檢測(cè)條件為excitation/emission,485/535nm)。

對(duì)照菌對(duì)照組的處理方法：將實(shí)施例2的步驟二得到的對(duì)照菌甲接種至LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD_600nm＝0.6，然后30℃、200rpm振蕩培養(yǎng)12h，然后吸取200μl菌液至96孔聚苯乙烯檢測(cè)板(Bio-rad)，在Pekin Elmer 2300 Multilablel Reader進(jìn)行檢測(cè)(GFP檢測(cè)條件為excitation/emission,485/535nm)。

用儀器所指示的熒光強(qiáng)度來指征啟動(dòng)子對(duì)靶標(biāo)化合的感應(yīng)強(qiáng)度，用在誘導(dǎo)物存在與不存在的情況下的熒光值差(ΔRFU)來體現(xiàn)誘導(dǎo)的強(qiáng)度(ΔRFU＝RFU_TNT或IPTG-RFU_對(duì)照)。

結(jié)果見圖1。在TNT的誘導(dǎo)下，3M1F可以啟動(dòng)GFP基因的表達(dá)，IPTG對(duì)3M1F沒有誘導(dǎo)作用。

實(shí)施例4、啟動(dòng)子的進(jìn)一步功能驗(yàn)證

取實(shí)施例2的步驟一得到的重組菌、實(shí)施例2的步驟二得到的對(duì)照菌甲、實(shí)施例2的步驟二得到的對(duì)照菌乙或?qū)嵤├?的步驟二得到的對(duì)照菌丙，接種至LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD_600nm＝2，然后用LB液體培養(yǎng)基稀釋至OD_600nm＝0.6，然后吸取1μl菌液滴加在培養(yǎng)基平板(含有1mM IPTG的LB培養(yǎng)基平板、含有15mg/L TNT的LB培養(yǎng)基平板或LB培養(yǎng)基平板)的孔內(nèi)(用直徑為3mm的打孔器在培養(yǎng)基平板上打孔)，30℃靜置培養(yǎng)8小時(shí)，然后在ClinX熒光呈像系統(tǒng)中進(jìn)行平板呈像。

照片見圖2(A：LB培養(yǎng)基平板；B：含有1mM IPTG的LB培養(yǎng)基平板；C：含有15mg/L TNT的LB培養(yǎng)基平板；D：各個(gè)平板中每個(gè)孔所對(duì)應(yīng)的菌的啟動(dòng)子)。在無誘導(dǎo)物的條件下，3M1F、T7、N1、N2所對(duì)應(yīng)的菌落沒有明顯的熒光反應(yīng)。在TNT誘導(dǎo)的情況下，3M1F、T7對(duì)應(yīng)的菌落均表現(xiàn)出了明顯的熒光，3M1F的啟動(dòng)活性高于T7。在IPTG誘導(dǎo)的情況下，只有T7對(duì)應(yīng)的菌落呈現(xiàn)出熒光。結(jié)果表明，3M1F對(duì)啟動(dòng)誘導(dǎo)物具有一定的選擇性，并且其誘導(dǎo)活性可以達(dá)到與強(qiáng)啟動(dòng)子T7相當(dāng)?shù)幕钚浴?/p>

實(shí)施例5、靈敏度

EC₂₀₀的值是目前傳感器構(gòu)建領(lǐng)域比較常用的敏感性檢測(cè)指標(biāo)，EC₂₀₀是指可引起兩倍指征指標(biāo)反應(yīng)時(shí)的誘導(dǎo)物的濃度，EC₂₀₀的值越小，則說明反應(yīng)的敏感性越強(qiáng)。

一、3M1F的EC₂₀₀值

取實(shí)施例2的步驟一得到的重組菌，接種至LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD_600nm＝0.6時(shí)加入TNT并使其濃度為梯度濃度(設(shè)置不加入TNT的對(duì)照處理)，然后30℃、200rpm振蕩培養(yǎng)8h，然后吸取200μl菌液至96孔聚苯乙烯檢測(cè)板(Bio-rad)，在Pekin Elmer2300 Multilablel Reader進(jìn)行檢測(cè)(GFP檢測(cè)條件為excitation/emission,485/535nm)。

結(jié)果見圖3(ΔRFU＝RFU_TNT-RFU_對(duì)照)。

記錄倍數(shù)變化達(dá)到對(duì)照的2倍時(shí)TNT的最低濃度。結(jié)果表明，3M1F的EC₂₀₀值達(dá)0.01mg/L。

二、對(duì)照片段的EC₂₀₀值

取實(shí)施例2的步驟二得到的對(duì)照菌A、對(duì)照菌B或?qū)φ站鶦，接種至LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD_600nm＝0.6時(shí)加入TNT并使其為梯度濃度(設(shè)置不加入TNT的對(duì)照處理)，然后30℃、200rpm振蕩培養(yǎng)8h，然后吸取200μl菌液至96孔聚苯乙烯檢測(cè)板(Bio-rad)，在Pekin Elmer 2300 Multilablel Reader進(jìn)行檢測(cè)(GFP檢測(cè)條件為excitation/emission,485/535nm)。

結(jié)果見圖4(ΔRFU＝RFU_TNT-RFU_對(duì)照)。結(jié)果表明，在TNT誘導(dǎo)的情況下，各對(duì)照片段作為啟動(dòng)子的活性都非常低。

實(shí)施例6、時(shí)效性

取實(shí)施例2的步驟一得到的重組菌，接種至LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD_600nm＝0.6時(shí)加入TNT并使其濃度為0.10mg/L(設(shè)置不加入TNT的對(duì)照處理)，然后30℃、200rpm振蕩培養(yǎng)一定時(shí)間，然后吸取200μl菌液至96孔聚苯乙烯檢測(cè)板(Bio-rad)，在Pekin Elmer 2300 Multilablel Reader進(jìn)行檢測(cè)(GFP檢測(cè)條件為excitation/emission,485/535nm)。

結(jié)果見圖5(ΔRFU＝RFU_TNT-RFU_對(duì)照)。TNT誘導(dǎo)50min左右3M1F開啟報(bào)告基因的表達(dá)，TNT誘導(dǎo)90min左右反應(yīng)達(dá)到一個(gè)比較明顯的對(duì)比強(qiáng)度、達(dá)到2倍以上的熒光變化，TNT誘導(dǎo)8小時(shí)后熒光反應(yīng)基本趨于穩(wěn)定。

實(shí)施例7、特異性

取實(shí)施例2的步驟一得到的重組菌，接種至LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD_600nm＝0.2時(shí)加入目標(biāo)化合物并使其濃度為66.04μm/L，然后30℃、200rpm振蕩培養(yǎng)8小時(shí)，然后 吸取200μl菌液至96孔聚苯乙烯檢測(cè)板(Bio-rad)，在Pekin Elmer 2300 Multilablel Reader進(jìn)行檢測(cè)(GFP檢測(cè)條件為excitation/emission,485/535nm)。

目標(biāo)化合物為2,4,6-TNT、2,4-DNT、2,6-DNT、1,3-DNB、1,4-DNB、2-NT、3-NT、4-NT、Toluene或硝基苯。

結(jié)果見圖6(ΔRFU＝RFU_TNT-RFU_對(duì)照)。3M1F對(duì)TNT、2,6-DNT、Toluene、2,4-DNT的反應(yīng)較其他化合物均有明顯差別。