本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及植物低溫誘導(dǎo)啟動(dòng)子及其應(yīng)用，特別涉及薺菜低溫誘導(dǎo)的、能調(diào)控冷誘導(dǎo)基因的啟動(dòng)子，以及該啟動(dòng)子在改良植物抗寒性中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
外界環(huán)境因素的如溫度、水分、光照、土壤離子濃度等大幅度變化都會(huì)對(duì)植物造成不利影響，不僅影響農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量，也會(huì)限制它們的時(shí)間和空間分布（Kasuga M, Liu Q, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. Improving plant drought, salt, and freezing tolerance by gene transfer of a single stress-inducible transcription factor. Nat.Biotechnol., 1999, 17:287-291）。而低溫地區(qū)的許多植物經(jīng)歷了長(zhǎng)期適應(yīng)過(guò)程提高了對(duì)較低的零上溫度的適應(yīng)能力，這種對(duì)低溫的適應(yīng)能力稱冷馴化，能夠引發(fā)植物體內(nèi)出現(xiàn)一系列生理生化反應(yīng)，如細(xì)胞膜的流動(dòng)性和穩(wěn)定性的變化，細(xì)胞內(nèi)滲透物質(zhì)的積累，細(xì)胞壁的抗壓能力的變化等等（Medina J. Luc-imaging the cold signal transduction pathway. Trends Plant Sci., 2001, 6(8):344）。低溫引起的這些生理變化多數(shù)是通過(guò)基因表達(dá)的變化造成的，這些基因包括感知低溫信號(hào)并傳遞低溫信號(hào)的轉(zhuǎn)錄因子和一些低溫誘導(dǎo)基因產(chǎn)生的低溫誘導(dǎo)蛋白。近些年從多種物種中克隆分離了一些冷誘導(dǎo)相關(guān)的基因，對(duì)于改良農(nóng)作物的抗冷性有著極大的意義（Zhou MQ, Shen C, Wu LH, Tang KX, Lin J. CBF-dependent signaling pathway: A key low temperature responder in plants. Crit. Rev.Biotechnol. 2011, 31(2):186-192）。但是在這些基因轉(zhuǎn)到植物中表達(dá)時(shí)，由于使用的是組成性的CaMV35S啟動(dòng)子，導(dǎo)致基因在植物體內(nèi)廣泛性的大量表達(dá)，雖然植物的抗冷性有了很大程度的提高，但植物在非低溫的正常環(huán)境下出現(xiàn)了矮化、生長(zhǎng)延遲、晚花等表型，同樣會(huì)影響農(nóng)作物的產(chǎn)量（Zhou MQ, Xu M, Wu LH, Shen C, Ma H, Lin J. CbCBF from Capsella bursa-pastorisenhances cold tolerance and restrains growth via antagonism with gibberellin and affecting cell cycle signaling in tobacco,PlantMol Biol,2014, 85:259-275）。為了在達(dá)到植物抗冷目的的同時(shí)，保證植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育，利用抗冷基因自身的啟動(dòng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物的培育已成為一種新的途徑。一些研究發(fā)現(xiàn)利用低溫調(diào)控基因自身的啟動(dòng)子能保證低溫響應(yīng)基因在正常溫度下維持較低的表達(dá)量，只在低溫寒害來(lái)臨時(shí)增加目的基因的表達(dá)，這樣不僅能提高植物的抗冷性，也大大減輕植物生長(zhǎng)發(fā)育遲緩的表型（Kasuga M, Miura S, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. A combination of the Arabidopsis DREB1A gene and stress-inducible RD29A promoter improved drought and low-temperature stress tolerance in tobacco by gene transfer. Plant Cell Physiol., 2004, 45(3):346-350）。利用特異性的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子降低外源基因在宿主植物中非特異性的持續(xù)、高效表達(dá)，避免出現(xiàn)不需要的表型，已經(jīng)得到普遍認(rèn)可，但實(shí)際上有效應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的特異性啟動(dòng)子卻屈指可數(shù)，冷誘導(dǎo)型的特異啟動(dòng)子則更是少之又少。克隆基因的特異啟動(dòng)子并研究其結(jié)構(gòu)功能早已是轉(zhuǎn)基因植物研究中的一個(gè)熱點(diǎn)，而這一熱點(diǎn)所催發(fā)的一系列應(yīng)用也會(huì)大力推動(dòng)轉(zhuǎn)基因植物的研究發(fā)展，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。
植物在遭受冷害時(shí)，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體中產(chǎn)生大量的活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS），過(guò)多的ROS積累會(huì)對(duì)植物細(xì)胞造成損傷，但是一定量的ROS的提升還可做為細(xì)胞信號(hào)傳遞途徑中的第二信使，如鈣離子的增加，從而激活植物細(xì)胞中一種抗氧化防御機(jī)制來(lái)消除ROS的不利作用，導(dǎo)致植的抗冷能力的提高。近幾年在模式植物擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)一類低豐度的低溫誘導(dǎo)基因，稱為RCI（Rare Cold Inducible）基因。其中一類基因編碼產(chǎn)物為一種陽(yáng)離子過(guò)氧化物酶（Llorente F, López-Cobollo RM, Catalá R, Martínez-Zapater JM, Salinas J. A novel cold-inducible gene from Arabidopsis, RCI3, encodes a peroxidase that constitutes a component for stress tolerance. Plant J.2002, 32(1):13），該基因受低溫誘導(dǎo)，在植物中的作用為在嚴(yán)寒脅迫下可增強(qiáng)植物細(xì)胞中活性氧的解毒功能從而抗寒（Kim MJ, Ciani S, Schachtman DP. A peroxidase contributes to ROS production during Arabidopsis root response to potassium deficiency. Mol. Plant. 2010, 3(2):420-427）。本發(fā)明的薺菜過(guò)氧化物酶基因啟動(dòng)子是從較抗冷植物薺菜葉片的總基因組中克隆得到。目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)薺菜過(guò)氧化物酶基因啟動(dòng)子在培育耐寒植物中的報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的第一目的就是提供一種新的薺菜過(guò)氧化物酶基因啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子是能夠在低溫下強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)的植物內(nèi)源性啟動(dòng)子。
本發(fā)明的的第二目的是提供所述薺菜過(guò)氧化物酶基因啟動(dòng)子在利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良植物抗逆（耐低溫）上的應(yīng)用。
首先，通過(guò)基因組步移技術(shù)，從薺菜總DNA中克隆過(guò)氧化物酶基因的啟動(dòng)子。過(guò)氧化物酶基因?yàn)橹参镏惺芾湔T導(dǎo)表達(dá)，能夠通過(guò)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的活性氧而調(diào)控植物產(chǎn)生抗冷性的一類稀有的冷誘導(dǎo)上調(diào)基因（RCI），將該基因的啟動(dòng)子命名為pCbRCI。所述啟動(dòng)子序列是序列表SEQ ID No: 1中的堿基第1-1021位堿基序列。
本發(fā)明所提供的薺菜過(guò)氧化物酶基因啟動(dòng)子區(qū)域含有4種與冷誘導(dǎo)以及非生物誘導(dǎo)相關(guān)的順式作用元件，分別是：
一個(gè)GGTCCAT-motif（auxin-responsive element），可以和生長(zhǎng)素反應(yīng)因子（ARF）相結(jié)合；
一個(gè)CGTCA-motif和一個(gè)TGACG-motif（MeJA-responsiveness），說(shuō)明此基因可能能夠被甲基茉莉酸所誘導(dǎo)；
一個(gè)TATCCCA-motif（auxin-responsive element），說(shuō)明此基因可能可以被赤霉素誘導(dǎo)激活；
一個(gè)GAGAAGAATA-motif和一個(gè)TCAGAAGAGG-motif，表明此基因可能可以被水楊酸誘導(dǎo)激活。
此外還發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子區(qū)域除了這些與啟動(dòng)子核心功能和非生物誘導(dǎo)相關(guān)的順式作用元件外，還有一組與逆境誘導(dǎo)相關(guān)的元件，如與干旱誘導(dǎo)相關(guān)的MBS元件（MYB binding site involved in drought-inducibility），說(shuō)明此基因在干旱情況下也可能會(huì)強(qiáng)烈表達(dá)。
將利用所述啟動(dòng)子構(gòu)建的誘導(dǎo)性表達(dá)載體轉(zhuǎn)入植物中時(shí)，發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子能夠強(qiáng)烈誘導(dǎo)報(bào)告基因在植株中的表達(dá)，尤其是在植物根中的表達(dá)。
利用本發(fā)明所提供的啟動(dòng)子構(gòu)建的帶有抗寒基因的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化煙草后，在低溫誘導(dǎo)條件下，該啟動(dòng)子可驅(qū)動(dòng)抗寒基因在抗冷性較差的模式植物煙草中誘導(dǎo)表達(dá)，可通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草的表型和抗寒的生理指標(biāo)，顯示植株耐寒性能有了顯著提高。
本發(fā)明詳細(xì)技術(shù)方案如下：
本發(fā)明首先提供一種分離出的薺菜DNA分子，即薺菜過(guò)氧化物酶基因,它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No: 1所示；其中薺菜過(guò)氧化物酶基因啟動(dòng)子包含序列表SEQ ID No: 1所示序列中的1-1021位堿基的核苷酸序列，之后連接的基因編碼一個(gè)受低溫誘導(dǎo)的、通過(guò)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的活性氧而調(diào)控植物產(chǎn)生抗冷性的基因。
所述的一種分離的DNA分子，其啟動(dòng)子區(qū)（SEQ ID No: 1序列中1-1021位）包含有一個(gè)響應(yīng)生長(zhǎng)素順式作用元件GGTCCAT，兩個(gè)響應(yīng)甲基茉莉酸的順式作用元件CGTCA和TGACG，一個(gè)響應(yīng)赤霉素的元件TATCCCA，兩個(gè)水楊酸誘導(dǎo)的元件GAGAAGAATA和TCAGAAGAGG，還有兩個(gè)與干旱誘導(dǎo)相關(guān)的MBS元件CAACTG。
此外還有甲基茉莉酸、水楊酸、生長(zhǎng)素、赤霉素等4種激素的順式響應(yīng)元件。
本發(fā)明還提供一種植物表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有權(quán)利要求1所述的薺菜過(guò)氧化物酶基因啟動(dòng)子。
本發(fā)明還提供所述的薺菜過(guò)氧化物酶基因啟動(dòng)子的制備方法，具體步驟為：
（1）將薺菜種子經(jīng)過(guò)70%酒精消毒后，播種于MS培養(yǎng)基上；
（2）待所述薺菜種子長(zhǎng)出葉片后，提取所述葉片的基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳分析其質(zhì)量；以及
（3）采用基因克隆技術(shù)得到薺菜過(guò)氧化物酶基因的啟動(dòng)子序列，使用的引物對(duì)為：上游引物為CbRCIF：5-TCACAAAACTAGTTGTTCTTTAGTT-3（SEQ ID No：2），下游引物為CbRCIR: 5-CTTTAAAGTTGTGGGGGTTTTTTTT-3（SEQ ID No：3）。
本發(fā)明還提供所述植物表達(dá)載體的制備方法，具體步驟為：
（1）擴(kuò)增出上述薺菜過(guò)氧化物酶基因啟動(dòng)子的DNA片段，所用引物對(duì)為：上游引物為CbRCIF：5-TCACAAAACTAGTTGTTCTTTAGTT-3（SEQ ID No：2），下游引物為CbRCIR: 5-CTTTAAAGTTGTGGGGGTTTTTTTT-3（SEQ ID No：3）；
（2）將所述DNA片段克隆到中間載體pMD18-T，再進(jìn)一步克隆到植物表達(dá)載體p1304上，得到所述表達(dá)載體。
上述方法中，還包括向所述上游引物引入限制性酶切位點(diǎn)KpnI，以及向所述下游引物引入限制性酶切位點(diǎn)NcoI。
本發(fā)明還提供所述的薺菜過(guò)氧化物酶基因的啟動(dòng)子或所述的植物表達(dá)載體在植物的抗寒性改良中的應(yīng)用。
所述植物為具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的作物，優(yōu)選水稻、小麥、玉米、棉花、油菜、番茄或黃瓜。
附圖說(shuō)明
圖1薺菜過(guò)氧化物酶基因啟動(dòng)子的活性分析。其中，A. 帶有pCbRCI35::GUS的質(zhì)粒構(gòu)建模式圖；B.GUS基因表達(dá)量分析；C. 培養(yǎng)2周的擬南芥轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗全株冷處理前后GUS染色結(jié)果；D.培養(yǎng)5周的擬南芥轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗冷處理前后GUS染色后半薄切片分析（幼苗中bar為0.1cm，根、莖、葉中bar為 0.001cm）。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)室具體的實(shí)驗(yàn)方法和操作過(guò)程，進(jìn)一步闡述本發(fā)明所做的工作。這些實(shí)驗(yàn)方法僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如例如薩姆布魯克(著)，黃培堂(主譯). 分子克隆驗(yàn)指南 (精編版) ，化學(xué)工業(yè)出版社，2008）或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1 薺菜過(guò)氧化物酶基因啟動(dòng)子的分離和鑒定
在該實(shí)施例中，通過(guò)基因組步移技術(shù)獲得薺菜過(guò)氧化酶基因啟動(dòng)子序列。實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程按照Universal Genome Walker TM Kit（CLONTECH）的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
1. 薺菜幼苗的培養(yǎng)
所用播種的薺菜種子購(gòu)買(mǎi)于上海市種子公司，播種前先在4℃處理3-7d，即進(jìn)行春化處理，使種子萌發(fā)保持一致。春化過(guò)的種子用75%乙醇消毒5-10min，然后再到無(wú)菌操作臺(tái)進(jìn)行下一步操作。將75%乙醇中的種子換到少量的無(wú)水乙醇溶液中，然后將種子連同無(wú)水乙醇一起倒在滅菌的濾紙上。等無(wú)水乙醇揮發(fā)完濾紙上種子干燥后，將濾紙上的種子散播在含有1/2MS培養(yǎng)基（MS粉 4.41g/L，蔗糖30g/L，瓊脂粉8.5g/L）的培養(yǎng)皿中，然后放置到22℃光照培養(yǎng)箱（16h光/8h暗）中培養(yǎng)。
2. 薺菜基因組DNA提取
將1 g新鮮薺菜葉片用液氮研磨成粉末狀后加入500 μL 65℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液，65℃水浴保溫60 min（中間不時(shí)緩慢振搖）；加入等體積的氯仿-異戊醇，輕輕混勻后靜置10 min；8000 g離心10 min使其分層，取出上清液轉(zhuǎn)入另一離心管；加入等體積的預(yù)冷的異丙醇（加入一滴NaAc），混勻后置于-20℃過(guò)夜以沉淀DNA；第二天取出離心管4℃，8000 g 離心10 min，棄去上清；用70%乙醇洗滌沉淀，8000 g 離心10 min，棄去上清，在空氣中干燥；將DNA沉淀溶解在合適體積（50μL）的TE緩沖液或dd H2O水中，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量后放置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
3. 基因組步移文庫(kù)的構(gòu)建
將薺菜基因組DNA分別用限制性內(nèi)切酶DraI，StuI，Pvu，EcoR酶切后，與Genome Walker 接頭連接（試劑盒提供）。連接的產(chǎn)物即為制備的4個(gè)基因組步移文庫(kù)。
4. PCR擴(kuò)增
分為三個(gè)階段進(jìn)行：
（1）根據(jù)薺菜過(guò)氧化酶基因的（GenBankAccesion No., AY566573）cDNA序列的開(kāi)放閱讀框（ORF）設(shè)計(jì)2條引物：CbRCIF1：5-ATGAACTGCTTGAGAGCTATTGCCC-3（記為SEQ ID No. 2）和CbRCIF2：5-TTAACTATTTGCAACGGAACATTGCCT-3（記為SEQ ID No. 3），以基因組DNA序列為模板為，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer 5μL；MgCl2 (25mM) 10μL；dNTP Mix (10mM) 5μL；Taq DNA聚合酶(5U/μL) 1μL；Primer1 (10 μM) 1μL；Primer2 (10 μM) 1μL；DNA1 μL；dH2O 26 μL; 總體積 50μL。使用程序?yàn)椋?4℃ for 5 min，30 cycles (94℃ for 30 sec, 56℃ for 30 sec, 72℃ for 50 sec)。擴(kuò)增到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到一條特異性很強(qiáng)的片段，長(zhǎng)度為1500bp左右。回收該片段并連接到pMD-18T載體上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coil DH5a感受態(tài)細(xì)胞，測(cè)序得到序列長(zhǎng)度為1532bp。與薺菜過(guò)氧化酶的cDNA序列（AY566573）比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)除了多出的三段內(nèi)含子序列外，其余序列與AY566573均相同，說(shuō)明我們得到的序列為薺菜過(guò)氧化物酶基因組序列；
（2）根據(jù)步驟（1）獲得的序列分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增中間序列上游的引物，其中兩個(gè)上游引物分別記為CbRCI5-1（5-TCGCACGAAACAATCATGGAAATG-3（記為SEQ ID No.4））和CbRCI5-2（5-AGCACTGATCCATCGCATCC-3（記為SEQ ID No.5））。以步驟3構(gòu)建基因組步移文庫(kù)為模板，利用CIONTECH公司提供的Universal GenomeWalker Kit（Clontech）試劑盒中的接頭引物AP1和AP2分別與上游基因特異引物組合進(jìn)行巢式擴(kuò)增，所得目的條帶即包含有向中間序列的5’端外移了一定距離的序列。PCR的反應(yīng)體系和程序均按試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。上游序列的擴(kuò)增經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到一條特異性很強(qiáng)的片段，長(zhǎng)度為1300bp左右。回收這個(gè)片段并連接到pMD-18T載體上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coil DH5a感受態(tài)細(xì)胞，測(cè)序得到上游序列長(zhǎng)度為1312bp；
（3）根據(jù)步驟（2）擴(kuò)增片段進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)步驟（2）擴(kuò)增的片段與步驟（1）獲得的片段有213bp是重復(fù)的，說(shuō)明我們獲得的序列為薺菜過(guò)氧化物酶基因的啟動(dòng)子序列。根據(jù)步驟（2）擴(kuò)增片段，設(shè)計(jì)2條引物，上游引物為CbRCIF：5-TCACAAAACTAGTTGTTCTTTAGTT-3（記為SEQ ID No.6），下游引物為CbRCIR：5-CTTTAAAGTTGTGGGGGTTTTTTTT-3（記為SEQ ID No.7）。擴(kuò)增獲得全長(zhǎng)啟動(dòng)子序列。
5. 擴(kuò)增序列分析
測(cè)序結(jié)果顯示克隆到的薺菜過(guò)氧化酶基因的5端序列全長(zhǎng)1312bp記為SEQ ID No. 1。薺菜過(guò)氧化酶基因基因編碼框的第一個(gè)起始密碼子在1100個(gè)堿基處，第一個(gè)起始密碼子ATG前的1099個(gè)堿基為薺菜過(guò)氧化酶基因的5’側(cè)翼序列，為薺菜過(guò)氧化酶基因的啟動(dòng)子序列，命名為pCbRCI。
6. 啟動(dòng)子序列順式作用元件的預(yù)測(cè)
將測(cè)序得到的序列輸入Neural Network Promoter Prediction
(http://fruitfly.org:9005/seq_tools/promoter.html)預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。并將測(cè)序得到的序列輸入PLANTCARE網(wǎng)站進(jìn)行啟動(dòng)子順式作用元件的分析。
PLANTCARE網(wǎng)站地址為：http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/ html/。
實(shí)施例2 薺菜過(guò)氧化物酶基因在冷誘導(dǎo)和冷馴化處理下的表達(dá)特性
在該實(shí)施例中證實(shí)薺菜過(guò)氧化物酶基因具有低溫誘導(dǎo)特性。
1. 薺菜幼苗的處理
薺菜幼苗的培養(yǎng)與實(shí)施例1的程序相同。待薺菜幼苗生長(zhǎng)到4w后進(jìn)行冷馴化和冷誘導(dǎo)處理，冷馴化按溫度梯度12℃ (4d), 4℃ (4d), 0℃ (2h)連續(xù)處理，冷誘導(dǎo)在4℃條件下，分別按4h，8h，24h時(shí)間梯度處理，之后分別收集葉片、莖段和根等材料，放置到-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>
2. 薺菜幼苗的RNA抽提
采用植物RNA提取試劑盒（CW0588）（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）分別提取薺菜根、莖、葉三種組織的總RNA, 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量。
3. 熒光定量PCR擴(kuò)增
采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)各種處理?xiàng)l件下薺菜過(guò)氧化物酶基因表達(dá)量的變化，實(shí)驗(yàn)設(shè)置三組重復(fù)，以薺菜18s rRNA基因（GenBank Accession No.：AY662285）為內(nèi)參。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用SYBR? Green qPCR試劑盒進(jìn)行操作，操作步驟按試劑盒操作程序反應(yīng)液配制在冰上進(jìn)行，將各項(xiàng)組分輕柔混勻后立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。然后使用TaKaRa生物公司的熒光定量試劑，在ABI step one plus 機(jī)器上進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。SYBR?Green I與雙鏈DNA結(jié)合后發(fā)出熒光，通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)體系中的SYBR?Green I熒光強(qiáng)度，檢測(cè)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量。
4. 擴(kuò)增結(jié)果分析
當(dāng)薺菜生長(zhǎng)在22℃條件下時(shí)，其體內(nèi)的過(guò)氧化酶基因在根、莖和葉中的表達(dá)有些差別，在根中有少許微量表達(dá)，相對(duì)根中的表達(dá)，在莖和葉中表達(dá)量相對(duì)較低，幾乎無(wú)表達(dá)。在4℃冷誘導(dǎo)處理后薺菜根、莖、葉中過(guò)氧化酶基因的表達(dá)均有不同程度的提高，在0到8h內(nèi)表現(xiàn)出持續(xù)上調(diào)，且在8h達(dá)到最高，之后表達(dá)量下降，24h時(shí)下降到比較低的量。冷馴化處理后，薺菜根中過(guò)氧化酶基因的表達(dá)量也有一定的上調(diào)，12℃處理時(shí)表達(dá)有少量增加，4℃處理后表達(dá)量的上調(diào)明顯進(jìn)一步增加，0℃增加最為明顯。但在莖和葉中，冷馴化處理后過(guò)氧化酶表達(dá)量增加不明顯。
實(shí)施例3 薺菜過(guò)氧化物酶基因啟動(dòng)子低溫誘導(dǎo)活性的GUS分析
在該實(shí)施例中，將克隆到的薺菜過(guò)氧化物酶基因的啟動(dòng)子序列加上酶切位點(diǎn)BglⅡ和PstⅠ，通過(guò)取代CaMV35S啟動(dòng)子的位置而連到pCAMBA1301載體上（由澳大利亞 CAMBIA [the Center of the Application of MolecularBiology to International Agriculture, Australia]提供），構(gòu)建出一個(gè)驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)的植物轉(zhuǎn)化載體。轉(zhuǎn)化擬南芥實(shí)驗(yàn)表明，薺菜過(guò)氧化物酶基因啟動(dòng)子在低溫誘導(dǎo)下能增強(qiáng)GUS基因的表達(dá)。因此，薺菜過(guò)氧化物酶基因啟動(dòng)子在利用基因工程手段培育抗寒作物中具有潛在的應(yīng)用前景。
1. 表達(dá)載體的構(gòu)建
在本實(shí)施方案中，構(gòu)建的表達(dá)載體pCAMBA1301-GUS通過(guò)酶切連接的方法切除了商品化的植物表達(dá)載體pCAMBA1301上自帶的CaMV35S啟動(dòng)子，連入薺菜過(guò)氧化物酶基因的啟動(dòng)子，調(diào)控GUS基因的表達(dá)，構(gòu)建的模式圖見(jiàn)圖1A所示。
2. 將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入GV3101農(nóng)桿菌
取出存于-80℃的農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，放在冰上融化后，加入1μl上述構(gòu)建好的表達(dá)載體混勻，冰上放置30min后，加入液氮，5min后移入37℃水浴鍋中熱激5min，取出后再在冰上放5min，然后加入0.8mlLB培養(yǎng)液。放在28℃恢復(fù)培養(yǎng)2~3h后，5500rpm離心5min，留下約100μl上清，吹打底部沉淀混勻后，在超凈工作臺(tái)中將菌液涂到帶有三抗培養(yǎng)基（LB+50 mg/mL鏈霉素＋30 mg/mL利福平＋25 mg/mL卡那霉素）的培養(yǎng)皿中，晾干后倒置在28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2d。
3. 農(nóng)桿菌菌液的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化液配制
挑取培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)的單個(gè)菌斑，接種到裝有10ml的三抗培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中活化培養(yǎng)，并采用PCR方法鑒定菌中是否帶有潮霉素和目的基因片段。轉(zhuǎn)化前一天，取確定的陽(yáng)性菌按照1:100擴(kuò)大培養(yǎng)轉(zhuǎn)入大瓶培養(yǎng)過(guò)夜，第二天取出使用時(shí)，農(nóng)桿菌液OD600當(dāng)在1.2到1.6之間。室溫5000rpm離心10min。棄上清，將農(nóng)桿菌沉淀懸浮于相應(yīng)體積的滲透培養(yǎng)基里，使OD600在0.8左右。
4. 浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥
轉(zhuǎn)基因之前將已經(jīng)長(zhǎng)出的果莢和花序上已經(jīng)開(kāi)放和露白的花去掉，將花序浸泡在轉(zhuǎn)化液中約3~5min，然后將擬南芥水平放置在托盤(pán)上，將幼嫩的花序浸入相應(yīng)的農(nóng)桿菌菌液中浸泡1 min后，用保鮮膜覆蓋住植株，移入黑暗中恒溫過(guò)夜培養(yǎng)，第二天將擬南芥取出光照培養(yǎng)，7d后相同操作步驟再轉(zhuǎn)化一次。培養(yǎng)3到4w待種子成熟后，收種子并放在干燥環(huán)境存放2w，該種子被稱為T(mén)0代種子。
5. 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的獲得和純系篩選
將T0代的種子先進(jìn)行消毒，消毒程序?yàn)椋?0%乙醇浸泡8min，處理時(shí)不停地懸浮種子，最后用無(wú)水乙醇懸浮三次，置于無(wú)菌濾紙上待種子干燥后。然后均勻播撒在含有20mg/L潮霉素的平板上，2-3w后將生根的抗性苗移到營(yíng)養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)，待苗長(zhǎng)到4-5片葉時(shí)，取一小片葉提取DNA，PCR鑒定擬南芥抗性小苗中是否帶有潮霉素基因或者GUS基因。留下PCR鑒定的陽(yáng)性苗，繼續(xù)培養(yǎng)，單株收種子，得到T1代種子。繼續(xù)種植，觀察T1代植株有沒(méi)有發(fā)生性狀分離，若發(fā)生分離則為雜合，若不分離則為純合；如果沒(méi)有純合植株，則繼續(xù)種植T2代，最終獲得不發(fā)生性狀分離的轉(zhuǎn)基因純合陽(yáng)性株系。
6. GUS染色
將獲得的轉(zhuǎn)GUS基因的擬南芥純合株系的種子播撒在1/2MS 固體培養(yǎng)基上，待幼苗長(zhǎng)到2w左右時(shí)，將一部分幼苗移入培養(yǎng)箱中4°C冷處理1 d后進(jìn)行GUS 染色分析。GUS染色步驟如下：先將X-gluc用 N,N-二甲基甲酰胺預(yù)溶后加入GUS染色液儲(chǔ)存液（配方：100ml 溶液中含有0.2M NaH2PO4、0.2M Na2HPO4、100mM K3Fe(CN)6、100mM K4Fe(CN)6）中。然后將材料用預(yù)冷的90%丙酮處理10min，再用GUS 染色液儲(chǔ)存液（未添加 X-gluc）沖洗干凈。加入冷的GUS染色液，用真空抽氣泵抽氣1 h后， 37°C溫育過(guò)夜。逐步加入100%-90%-80%-75%一系列乙醇脫去葉綠素，65°C溫育，每隔1 h換一次乙醇，直至葉綠素脫干凈，染色后的材料在體視鏡下進(jìn)行觀察和拍照。
另一部分?jǐn)M南芥幼苗移栽植到營(yíng)養(yǎng)土中，培養(yǎng)6w左右，對(duì)擬南芥苗進(jìn)行4°C冷處理1d，分別取根、莖和葉進(jìn)行 GUS 染色。GUS基因的表達(dá)產(chǎn)物，可將反應(yīng)液中的X-Gluc水解成藍(lán)色物質(zhì)，使組織呈現(xiàn)藍(lán)色，藍(lán)色的深淺及斑點(diǎn)數(shù)量，一定程度上反應(yīng)GUS基因的表達(dá)水平。
7. 結(jié)果分析
將冷處理前后的純合轉(zhuǎn)基因幼苗進(jìn)行組織染色分析，并通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)冷處理前后GUS基因的表達(dá)量變化。通過(guò)染色分析發(fā)現(xiàn)在正常溫度下，轉(zhuǎn)化pCbRCI35-GUS質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因煙草小苗根莖葉組織幾乎沒(méi)有藍(lán)色，但在低溫條件下，擬南芥小苗根莖葉組織均顯現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，由此說(shuō)明，薺菜過(guò)氧化物酶基因的啟動(dòng)子低溫誘導(dǎo)后在擬南芥中能啟動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)（圖1C），同時(shí)發(fā)現(xiàn)在幼苗的根莖葉組織中，GUS的表達(dá)量在冷處理8 h后明顯上升，在冷處理8h后上調(diào)了18倍左右（圖1B）。
實(shí)施例4 薺菜過(guò)氧化物酶基因啟動(dòng)子低溫誘導(dǎo)活性的半薄切片觀察
1、薺菜轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗
轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗獲得與實(shí)施例3相同。
2、GUS染色
轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗的GUS染色與實(shí)施例3相同。
3、半薄切片
取已經(jīng)進(jìn)行GUS染色的葉片、根、莖等組織，用FAA固定液固定材料，然后分別用70%-85%-95%的乙醇連續(xù)脫水30min，更換無(wú)水乙醇后繼續(xù)脫水兩次，每次2h。接著將無(wú)水乙醇與Base Liquid Technovit 7100等體積混勻后預(yù)滲透材料約1~2h。將1g硬化劑1溶于100ml Base Liquid Technovit 7100后用于滲透材料過(guò)夜。隨后將1ml硬化劑2加入15ml預(yù)滲透液中，混勻后，立即包埋樣品，然后于65℃烘箱烘烤2-3d。半薄切片切片機(jī)切片，厚度約4~5um。最后在顯微鏡下觀察、拍照。
4、結(jié)果分析
轉(zhuǎn)基因幼苗長(zhǎng)到5w大小時(shí)，利用半薄切片技術(shù)觀察組織的染色情況，如圖所示（圖1C）發(fā)現(xiàn)冷處理之前根莖葉中的表達(dá)量都非常低，葉和莖中幾乎沒(méi)有，根中也只能看到一點(diǎn)點(diǎn)隱隱約約的淡藍(lán)色。但是冷處理之后組織中表達(dá)量都有明顯上升，根中上升尤其明顯而且根中表達(dá)量的上調(diào)主要集中在根組織中細(xì)胞特別集中的形成層部位，這說(shuō)明此基因可能參與冷害中植物具有分化能力部位組織的保護(hù)，莖和葉片中可以看出淡淡的藍(lán)色出現(xiàn)在細(xì)胞邊緣。
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