本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種用于敲除人CYP2E1基因的gRNA序列、CYP2E1基因缺失細胞株的構(gòu)建方法及其應用。
背景技術(shù)：
：CYP2E1是細胞色素P450家族里非常重要的成員之一，CYP2E1基因位于第10號染色體上，有11413bp，含有9個外顯子和8個內(nèi)含子，編碼含有493個氨基酸的蛋白。CYP2E1主要存在于肝臟和腎臟細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體內(nèi)，主要參與外來化學物的體內(nèi)代謝和生物轉(zhuǎn)化，還參與了機體的氧化應激、脂質(zhì)過氧化、細胞凋亡與自噬、炎癥反應等過程，會對機體造成損傷及產(chǎn)生毒性。因此，急需要構(gòu)建一種CYP2E1基因缺陷型人胚胎腎臟細胞株，用于CYP2E1相關(guān)的藥物和毒物代謝研究、外源性化學物毒性研究、致癌性研究以及藥物-藥物交互作用研究，為進一步進行腫瘤相關(guān)藥物研究和外源化學物代謝研究提供良好的工具和平臺。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一種后天免疫防御系統(tǒng)，用以保護細菌或古細菌免受外來質(zhì)粒或噬菌體的侵入，這類細菌或古細菌基因組的CRISPR序列能表達與入侵者基因組序列相識別的RNA，在CRISPR相關(guān)酶(CAS9)的作用下切割外源基因組DNA，達到抵制入侵的目的，經(jīng)過人為改造后，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以實現(xiàn)在真核細胞中高度靈活且特異的基因組編輯，是目前基因組編輯領(lǐng)域最受歡迎的新一代基因組編輯技術(shù)，目前該技術(shù)已被用于構(gòu)建各類基因敲除細胞系和基因敲除動物模型?，F(xiàn)有實驗技術(shù)中，與CRISPR/Cas9系統(tǒng)最為相似的是siRNA靶向的基因沉默技術(shù)，siRNA靶向的基因沉默是在轉(zhuǎn)錄或者轉(zhuǎn)錄后水平實現(xiàn)基因沉默，其對基因表達的沉默作用往往并不徹底，達不到預期的沉默效果?，F(xiàn)有報道的siRNA(例：siCYP2E1)在mRNA或蛋白水平的沉默不徹底，無法完全沉默基因的表達，不能構(gòu)建真正的CYP2E1基因缺陷細胞株。目前，有必要提供一種不僅能實現(xiàn)沉默徹底、且能長期穩(wěn)定體外培養(yǎng)的CYP2E1基因缺陷型人胚胎腎臟細胞株。技術(shù)實現(xiàn)要素：為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種用于敲除人CYP2E1基因的sgRNA序列、CYP2E1基因缺失細胞株的構(gòu)建方法及其應用。第一方面，本發(fā)明提供了一種用于敲除人CYP2E1基因的sgRNA序列，所述sgRNA的靶DNA序列為SEQIDNO:1、SEQIDNO:2所示序列中的至少一條。第二方面，本發(fā)明提供了一種敲除人胚胎腎臟細胞CYP2E1基因的方法，為利用CRISPR/Cas系統(tǒng)在人胚胎腎臟細胞中對CYP2E1基因進行改造，具體包括如下步驟：(1)人工合成如第一方面所述靶DNA序列及其互補鏈；(2)將所合成的核酸片段插入到sgRNA骨架表達質(zhì)粒載體的多克隆位點并轉(zhuǎn)化，挑單克隆菌株，提取sgRNA重組質(zhì)粒，測序鑒定獲得測序正確的sgRNA重組質(zhì)粒；其中，sgRNA骨架表達質(zhì)粒載體還表達Cas9核酸酶；(3)將sgRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚胎腎臟細胞，即得敲除CYP2E1基因的人胚胎腎臟細胞。優(yōu)選地，所述步驟(2)具體包括：將所合成的SEQIDNO:1及SEQIDNO:2所示序列的核酸對分別插入到sgRNA骨架表達質(zhì)粒載體的多克隆位點并轉(zhuǎn)化，挑單克隆菌株，提取sgRNA重組質(zhì)粒，測序鑒定獲得測序正確的sgRNA重組質(zhì)粒；其中，sgRNA骨架表達質(zhì)粒載體還表達Cas9核酸酶；所述步驟(3)具體包括：將步驟(2)所得的兩種sgRNA重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人胚胎腎臟細胞，即得敲除CYP2E1基因的人胚胎腎臟細胞。第三方面，本發(fā)明提供了一種CYP2E1基因缺失細胞株的構(gòu)建方法，為采用有限稀釋法對第二方面所得的敲除CYP2E1基因的人胚胎腎臟細胞進行傳代篩選，獲得穩(wěn)定敲除CYP2E1的人胚胎腎臟細胞。第四方面，本發(fā)明提供了一種CYP2E1基因缺失細胞株，為如采用第三方面所述的CYP2E1基因缺失細胞株的構(gòu)建方法所制得。第五方面，本發(fā)明提供了一種如第一方面所述的用于敲除人CYP2E1基因的sgRNA序列在敲除CYP2E1基因中的應用。第六方面，一種用于在人基因組中進行CYP2E基因定點敲入試劑盒，包括如下(1)-(3)中的任一種：(1)如第一方面所述的用于敲除人CYP2E1基因的sgRNA序列；(2)如第二方面所述的sgRNA重組質(zhì)粒；(3)如第四方面所述的CYP2E1基因缺失細胞株。本發(fā)明提供了的技術(shù)方案具有如下有益效果：本發(fā)明提供的技術(shù)方案利用CRISPR/Cas9技術(shù)對CYP2E1基因敲除，實現(xiàn)了在基因組水平對基因的沉默作用，有效改進了siRNA(例：siCYP2E1)在mRNA或蛋白水平的沉默不徹底或者無法沉默基因表達的缺點。附圖說明圖1為本發(fā)明實施例提供的SgRNA重組質(zhì)粒構(gòu)建模式圖；圖2為本發(fā)明實施例提供的倒置熒光顯微鏡觀察細胞熒光結(jié)果；圖3為本發(fā)明實施例提供的SURVEYOR核酸酶消化后PCR片段結(jié)果；圖4為本發(fā)明實施例提供的293FT-ko-45#、293FT-ko-46#在靶點位置的缺失突變序列示意；圖5為本發(fā)明實施例提供的CYP2E1-Knockout細胞株mRNA表達量檢測結(jié)果；圖6為本發(fā)明實施例提供的CYP2E1-Knockout細胞株P(guān)rotein表達量檢測結(jié)果。具體實施方式以下所述是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明實施例中無特別說明外，所用試劑及耗材均為市售商品。本發(fā)明技術(shù)方案可通過如下實施例實現(xiàn)：(1)sgRNA設計：分別針對CYP2E1的第二、第三和第七外顯子(Exon2,Exon3,Exon7)設計sgRNA序列。設計、合成的三組分別針對CYP2E1第二、第三和第七外顯子的sgRNA序列具體分組與命名見表1：表1CYP2E1sgRNAoligo序列(Tab.1ThesequencesofCYP2E1sgRNAoligo)分別在sgRNA兩端加酶切位點，在每條sgRNA序列的正義鏈的5’端添加CACC，反義鏈的5’端添加AAAC，從而形成與PX461質(zhì)粒經(jīng)FastDigestBbsI酶切后互補的粘性末端。如果正義鏈的5’端第一個堿基不是G，則在5’端CACC后面增加一個G，相應的反義鏈3’端再增加一個C。設計完成后的sgRNA送上海杰瑞公司進行引物合成。(畫橫線為sgRNA)本發(fā)明SEQIDNO:1、SEQIDNO:2所示序列分別對應表格1中SEQIDNO:8、SEQIDNO:9畫橫線部分，具體地，SEQIDNO:1、SEQIDNO:2所示序列分別為GGAAGGACATCCGGCGGTTT和ACCCTCCGGAACTATGGGAT。重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定，構(gòu)建流程模式如圖1所示①PX461為含有U6啟動子的sgRNA骨架表達載體，表達具有Cas9D10A切口酶突變的Cas9n，帶有GFP綠色熒光蛋白基因和氨芐青霉素抗性。用FastDigestBbsI對PX461進行酶切，DNA凝膠電泳后回收線性化的載體。②用T4PNK分別對表1中的三組sgRNAoligo序列進行磷酸化和退火；用T4ligase將線性的PX461質(zhì)粒載體分別與退火后的三組sgRNA雙鏈序列室溫連接1h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌Trans109，冰浴30min,42℃45s，冰上2min。在氨芐抗性的LB平板上篩選克隆。挑取陽性克隆搖菌，送測序。測序引物為U6啟動子的正向引物序列，5’-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3’(SEQIDNO:15)。測序正確的克隆提取重組質(zhì)粒。③所得重組質(zhì)粒共有三組(6種)，針對第二外顯子的一組質(zhì)粒命名為PX461-E2-1和PX461-E2-2(分別對應Exon2的SgRNA-E2-1、SgRNA-E2-2構(gòu)建的質(zhì)粒)，針對第三外顯子的一組質(zhì)粒命名為PX461-E3-1和PX461-E3-2(分別對應Exon3的SgRNA-E3-1、SgRNA-E3-2構(gòu)建的質(zhì)粒)，針對第七外顯子的一組質(zhì)粒命名為PX461-E7-1和PX461-E7-2(分別對應Exon7的SgRNA-E7-1、SgRNA-E7-2構(gòu)建的質(zhì)粒)。(2)細胞培養(yǎng)和細胞轉(zhuǎn)染①293FT細胞培養(yǎng)條件：DMEM培養(yǎng)基(含10％胎牛血清)、5％CO2、37℃恒溫培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24h，將293FT細胞以5×105/孔接種至6孔板中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染時細胞融合度達到60％-70％。使用lipo2000轉(zhuǎn)染試劑分別將上述每組(Exon2、3、7)對應的2種質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染一孔293FT細胞，等量的PX461質(zhì)粒作為陰性對照，6孔板質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量一般為2ug/孔,質(zhì)粒預轉(zhuǎn)染試劑之比為1:2-2.5。②轉(zhuǎn)染后24h觀察轉(zhuǎn)染效率。利用倒置熒光顯微鏡觀察熒光細胞百分比，以確定轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果如圖2所示。(4)提取細胞基因組DNA細胞轉(zhuǎn)染后48h，將293FT細胞進行消化，取一部分(一般為消化后細胞重懸液體積1/3)進行傳代保種。一部分(一般為消化后細胞重懸液體積2/3)用GeneJETTMGenomicDNAPurificationKit提取基因組DNA。①將細胞收集于離心管，每管5X106個細胞，用移液器緩慢吹打，250g離心5min，棄上清，加PBS重懸細胞，再次重復離心，已去除細胞中殘留培養(yǎng)基。②用200ulPBS重懸細胞，每管加入200ul裂解液和20ul蛋白酶K,充分震蕩、混合均勻。③56℃搖床孵育10min，期間每3-4分鐘震蕩混勻一次，以保證細胞裂解充分。④加入20ulRNAaseA，震蕩混勻，室溫孵育10min。⑤加入400ul50％ethanol，用槍震蕩混勻或者震蕩混勻。⑥將上述MiX加入試劑盒提供的Column柱中，6000g離心，1min，將DNA收集柱轉(zhuǎn)移至新的2ml收集管中。⑦加入500ulwashbufferⅠ，8000g離心1min，棄廢液。再加入500ulwashbufferⅡ,12000g,離心3min。⑧加入200ulElutionBuffer至收集柱濾膜中央，室溫孵育2min，8000g離心，1min，即可得所需DNA樣品。(5)PCR反應條件和SURVEYOR分析檢測①SURVEYORPCR反應：只有能被sgRNA識別，Cas9切割的DNA序列存在，SURVEYOR結(jié)果呈現(xiàn)陽性(3條帶)，因此需要首先針對CYP2E1基因上三個不同的外顯子進行分析檢測，分別設計3對跨Cas9蛋白切割位點的SURVEYORPCR引物對，并進行引物特異性檢測,引物序列見表2。表2SURVEYORPCR反應引物序列Tab.2PCRprimer②用Phusion超保真DNA聚合酶進行PCR擴增，參照說明書50ul體系，基因組DNA100ng，50ul反應體系如下表所示。組分數(shù)量(uL)H2Oto50PhusionHFbuffer,5X10dNTPs,2.5mM4Phusionpolymerase0.5Forwardprimer2.5Reverseprimer2.5templateDNA100ngTotal50程序如下：取反應后PCR產(chǎn)物5ul進行瓊脂糖凝膠電泳檢測其特異性。③SURVEYOR分析步驟如下：③.1用QIAquickPCRpurificationKit試劑盒進行PCR產(chǎn)物純化，將回收產(chǎn)物稀釋至40ng/ul，按照SURVEYOR分析試劑盒說明書步驟進行檢測.③.2DNA雜化雙鏈形成(退火反應)體系：組分數(shù)量(μl)TaqPCRbuffer,10×2NormalizedPCRproduct,20ngμl-118Totalvolume20反應條件：循環(huán)次數(shù)條件195℃,10min295-85℃,-2℃s-1385℃,1min485-75℃,-0.3℃s-1575℃,1min675-65℃,-0.3℃s-1765℃,1min865-55℃,-0.3℃s-1955℃,1min1055-45℃,-0.3℃s-11145℃,1min1245-35℃,-0.3℃s-11335℃,1min1435-25℃,-0.3℃s-11525℃,1min1625-4℃,-0.3℃s-1174℃,hold③.3SURVEYOR核酸酶消化(在冰上操作)：反應體系：組分用量(μl)終濃度Annealedheteroduplex20MgCl2stocksolutionsuppliedwithkit,0.15M2.515mMddH2O0.5SURVEYORnucleaseS11×SURVEYORenhancerS11×Total25反應條件：充分震蕩、混勻上述mixture,42℃30min.③.4取10ul樣品，用2％瓊脂糖凝膠進行分析。用凝膠定量軟件計算切割效率，公式為fcut＝(b+c)/(a+b+c)，其中Indel為缺失比率，fcut為切割比率，a為未被切割條帶的灰度值，b和c表示切割產(chǎn)生的新條帶的灰度值。選擇Indel(％)最高的那一組轉(zhuǎn)染的293FT細胞做下一步的接種和篩選。SURVEYOR核酸酶消化部分結(jié)果如圖3所示，實驗結(jié)果表明僅有針對Exon3設計的sgRNA構(gòu)建的PX461-E3-1和PX461-E3-2質(zhì)粒組有效，SURVEYOR結(jié)果為陽性。(6)篩選穩(wěn)定敲除CYP2E1的293FT細胞株為進一步獲得穩(wěn)定敲除CYP2E1的293FT細胞株，我們采用有限稀釋法，將傳代保種的經(jīng)過轉(zhuǎn)染的293FT單細胞接種至96孔板中。操作步驟如下：①用胰蛋白酶消化細胞并計數(shù)，采用有限稀釋法稀釋至100ul培養(yǎng)基0.5個細胞，按每孔100ul細胞稀釋液加至96孔板中。②接種后第5至7天用顯微鏡觀察細胞生長狀況并初步篩選出單克隆細胞，待細胞長滿96孔板底時，再用胰蛋白酶消化細胞并轉(zhuǎn)移至24孔板中。③待細胞長滿24孔板底時，一部分細胞用于傳代留種，一部分細胞提取其基因組DNA，經(jīng)PCR擴增后測序，測序結(jié)果與原基因組進行比對，檢測靶向敲除CYP2E1基因是否成功。測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，293FT-ko-45#在靶點位置造成了35bp的缺失突變，293FT-ko-46#在靶點位置也造成了37bp的缺失突變，如圖4所示。④挑選經(jīng)測序驗證的成功敲除CYP2E1基因的單克隆細胞，培養(yǎng)擴增至6孔板，一部分細胞用于傳代留種，一部分細胞用M-PERMammalianProteinExtractionReagent提取蛋白，用于Westernblot檢測CYP2E1的蛋白表達水平，另一部分細胞用Trizol法提取RNA，用于RT-qPCR檢測CYP2E1的mRNA表達水平。結(jié)果如圖5、6所示。圖5為CYP2E1-Knockout細胞株mRNA表達量檢測結(jié)果；圖6為CYP2E1-Knockout細胞株P(guān)rotein表達量檢測結(jié)果。相對于傳統(tǒng)的基因敲除方法不僅流程繁瑣，對技術(shù)要求高，而且費用昂貴，成功率相對較低。本發(fā)明采用的CRISPR-Cas9技術(shù)是第四代基因編輯方法，其易于操作，效率更高，費用低廉。本發(fā)明利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建的CYP2E1基因敲除細胞模型為CY2E1代謝相關(guān)的研究提供了有效平臺。具體有益效果如下：(1)利用CRISPR/Cas9技術(shù)對CYP2E1基因敲除，實現(xiàn)了在基因組水平對基因的沉默作用，有效改進了siRNA(例：siCYP2E1)在mRNA或蛋白水平的沉默不徹底或者無法沉默基因表達的缺點。(2)CYP2E1參與機體重要的代謝功能，CYP2E1基因敲出細胞株的建立為外源性化學物或者外源性毒物在體內(nèi)的代謝研究提供了有效的平臺。(3)CYP2E1基因敲除細胞株對于慢性疾病(如酒精性肝臟疾病及糖尿病)及腫瘤相關(guān)疾病的研究提供了有力工具。(4)CYP2E1基因敲除細胞株可用于CYP2E1代謝相關(guān)外源性化學物毒性、致癌性的研究以及藥物之間的交互作用研究。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁1 2 3