長鏈非編碼rna afap1-as1在制備乳腺癌輔助診斷及預(yù)后判斷制劑上的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及長鏈非編碼RNA AFAP1-AS1的原位雜 交探針、檢測試劑及其應(yīng)用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人類基因組計劃及其后續(xù)的DNA元件百科全書計劃（The Encyclopedia of DNA Elements Pr〇ject，ENC0DE)研宄成果表明，蛋白編碼基因序列僅占人類基因組序 列的1-3%，而人基因組中絕大部分可轉(zhuǎn)錄的序列為長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，IncRNA)。LncRNA廣泛地存在于各種生物中，且隨著生物復(fù)雜程度的升高，基因組中 IncRNA序列的比例也相應(yīng)地增大，提示IncRNA在生物進化過程中有重要意義。隨著IncRNA 不斷被發(fā)現(xiàn)，它們的功能逐漸被詮釋，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)IncRNA廣泛而活躍地參與到生命活動 不同層面的功能調(diào)控中，作為一個嶄新的領(lǐng)域，已經(jīng)成為國際生命科學(xué)研宄領(lǐng)域新的前沿 與熱點。
[0003] LncRNA可作為功能蛋白質(zhì)的信號（signal)、誘導(dǎo)（guide)、誘館（decoy)或支架 (scaffold)分子等多種方式，在染色質(zhì)重構(gòu)、基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及蛋白修飾等多重水平調(diào)控基 因的表達(dá)，并在包括發(fā)育、免疫、生殖等基本生理過程中扮演了不可替代的角色，更重要的 是，IncRNA的表達(dá)與功能失調(diào)已經(jīng)與包括惡性腫瘤在內(nèi)的人類多種疾病緊密聯(lián)系在了一 起。因此，深入研宄IncRNA的功能，揭示由IncRNA介導(dǎo)的遺傳信息傳遞方式和表達(dá)調(diào)控網(wǎng) 絡(luò)，不僅可以從蛋白編碼基因以外的角度重新注釋和闡明基因組的結(jié)構(gòu)與功能，深入發(fā)現(xiàn) 生命活動的本質(zhì)和規(guī)律，還有望從一個新的視角認(rèn)識包括腫瘤在內(nèi)的多種人類常見疾病的 發(fā)病機理，并為這些疾病的診斷與治療提供新的分子標(biāo)志物與治療靶點。
[0004] 乳腺癌的發(fā)病率居女性惡性腫瘤的第一位，自20世紀(jì)70年代末開始其發(fā)病率一 直呈上升趨勢，美國8名婦女一生中就會有1人患乳腺癌，而我國乳腺癌發(fā)病率近年來也一 直持續(xù)增長，已成為當(dāng)前社會的重大公共衛(wèi)生問題，乳腺癌容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，晚期患者預(yù)后較 差。研宄表明，這種腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多基因參與、多步驟、多階段的復(fù)雜過程，LncRNA在 乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能也起到了重要的作用。最近我們利用IncRNA芯片，構(gòu)建了乳 腺癌活檢組織及正常對照樣品中IncRNA的表達(dá)譜，從中篩選了一些在乳腺癌中差異表達(dá) 的IncRNAs，經(jīng)擴大樣本實時熒光定量PCR驗證，證實IncRNA AFAP1-AS1 (NCBI accession number:NR_026892)在乳腺癌中表達(dá)顯著上調(diào)，針對該IncRNA的檢測制劑可以用于乳腺癌 的輔助診斷。隨后，我們進一步增加樣本，在77例有臨床隨訪資料的乳腺癌石蠟存檔標(biāo)本 中，通過原位雜交（in situ hybridization)的方法檢測了 AFAP1-AS1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn) AFAP1-AS1表達(dá)高的患者更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，其生存時間短于該IncRNA表達(dá)低的患者，因此 針對該IncRNA的檢測制劑也可以用于乳腺癌的預(yù)后判斷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供長鏈非編碼RNA AFAP1-AS1的原位雜交探針、試劑及其應(yīng)用 方法，利用長鏈非編碼RNA AFAP1-AS1序列可以制備用于乳腺癌輔助診斷及預(yù)后判斷的制 劑。
[0006] LncRNA AFAP1-AS1的應(yīng)用方法，用于制備乳腺癌療效預(yù)測的制劑，該長鏈非編碼 RNA AFAPI-ASl 的序列如 SEQ NO: 1 所示。
[0007] 所述的乳腺癌療效預(yù)測的制劑為原位雜交檢測試劑。
[0008] 所述的原位雜交檢測試劑中包括用于原位雜交檢測AFAP1-AS1表達(dá)的寡核苷酸 探針，序列如下：
[0009] AFAP1-AS1 探針 1 :5' -ATTCCTTTATTTTATGGGATGTTCTGTAGGGAGTT-3'，SEQ N0:2，
[0010] AFAP1-AS1 探針 2 :5' -TAGAAATGAGAAAAGAATCACCAAGAGAGTAAGCA-3'，SEQ N0:3，
[0011] AFAP1-AS1 探針 3 :5' -TCCCTACAGCTAGTTTCCTCTTCATTTATTCATTT-3'，SEQ N0:4。
[0012] 所述的原位雜交檢測試劑為試劑盒。
[0013] 試劑盒中含有上述用于原位雜交檢測AFAP1-AS1表達(dá)的寡核苷酸探針：
[0014] AFAP1-AS1 探針 1 :5' -ATTCCTTTATTTTATGGGATGTTCTGTAGGGAGTT-3'
[0015] AFAP1-AS1 探針 2 :5' -TAGAAATGAGAAAAGAATCACCAAGAGAGTAAGCA-3，
[0016] AFAP1-AS1 探針 3 :5' -TCCCTACAGCTAGTTTCCTCTTCATTTATTCATTT-3'
[0017] 陽性對照探針（檢測看家基因 GAPDH):
[0018] GAPDH 探針 1 :5, -CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3,，SEQ N0:5
[0019] GAPDH 探針 2 :5' -CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3'，SEQ NO: 6
[0020] GAPDH 探針 3 :5, -GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3,，SEQ NO: 7。
[0021] 試劑盒中還含有：地高辛寡核苷酸加尾試劑、抗地高辛-辣根過氧化物酶復(fù)合物 檢測試劑、DAB染色試劑；
[0022] 其它常規(guī)生物化學(xué)試劑，包括20x檸檬酸鈉緩沖溶液（saline sodium citrate, SSC)，硫酸葡聚糖（Dextran sulphate)，去離子甲酰胺（Deionized Formamide)， 多聚腺苷酸（polyadenylic acid，Poly A)，多聚脫氧腺苷酸（polydeoxyadenylic acid， Poly dA)，變性剪切的娃精 DNA(denatured and sheared salmon sperm DNA，ssDNA)， 酵母轉(zhuǎn)運 RNA(yeast t-RNA，tRNA)，二硫蘇糖醇（DTT)，50x 鄧罕氏緩沖液（Denhardts' s solution)，磷酸緩沖液（PBS buffer)，胃蛋白酶K，牛血清白蛋白（BSA)，三乙醇胺 (TEA)，醋酸酐，阻斷試劑（Blocking reagent agent)，TNB 緩沖液（即：ρΗ7· 5 的 0· IM Tris-Cl+0. 15Μ NaCl+0. 5 % 阻斷試劑），TNT 緩沖液（即：ρΗ7· 5 的 0· IM Tris-Cl+0. 15Μ NaCl+0. 05% Tween 20) 〇
[0023] 我們通過原位雜交在存檔的乳腺癌石蠟組織標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)AFAP1-AS1的表達(dá)與乳 腺癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，AFAP1-AS1表達(dá)高的患者生存時間更短，提示AFAP1-AS1可作為 乳腺癌預(yù)后預(yù)測的分子標(biāo)志。本發(fā)明為乳腺癌的輔助診斷和預(yù)后預(yù)測提供了強有力的分子 生物學(xué)工具，具有深遠(yuǎn)的臨床意義和重要的推廣應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0024] 圖1為實時熒光定量PCR技術(shù)驗證IncRNA AFAP1-AS1在乳腺癌和正常乳腺組織 中的表達(dá)情況，AFAP1-AS1在乳腺癌（T)中的