專利名稱：人類基因短串聯(lián)重復(fù)序列分型標(biāo)準(zhǔn)物的分子克隆制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于重組DNA應(yīng)用技術(shù)。具體地講，本發(fā)明涉及一種利用重組質(zhì)粒制備人類DNA短串聯(lián)重復(fù)序列基因座(short tandem repeat，簡(jiǎn)稱STR)的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物的方法，它可以解決STR在分型上長(zhǎng)期存在的準(zhǔn)確性和標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題。
人類DNA短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)廣泛存在于人類基因組中，每6-10 Kb堿基就有一個(gè)，由其核心序列由2-6bp構(gòu)成，其在個(gè)體間重復(fù)次數(shù)的差異形成豐富的片段長(zhǎng)度多態(tài)性。這種片段長(zhǎng)度的大小按孟德?tīng)栠z傳規(guī)律遺傳。STR基因座的等位基因片段小，特異性高，極易通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chainreaction，簡(jiǎn)稱PCR)擴(kuò)增，電泳分型；在人類基因組中包含豐富的遺傳信息，是新一代DNA指紋中最重要的內(nèi)容，自90年代初開(kāi)始，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于遺傳學(xué)，臨床醫(yī)學(xué)，生物學(xué)，以及法科學(xué)中的個(gè)人識(shí)別、親子鑒定等領(lǐng)域中。但在這十多年的研究和應(yīng)用過(guò)程中，學(xué)者們也注意到唯有實(shí)行DNA分析的質(zhì)量控制和質(zhì)量保證，建立標(biāo)準(zhǔn)化的DNA分析技術(shù)，才能確保法醫(yī)DNA檢測(cè)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性、公正性和可靠性。問(wèn)題的關(guān)鍵在于STR基因座的等位基因統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)命名和分型問(wèn)題，即對(duì)同一個(gè)STR基因座的檢測(cè)能夠在同一等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物(英文稱為L(zhǎng)adder，以下統(tǒng)稱為L(zhǎng)adder)的參照下進(jìn)行檢測(cè)，按照同一原則命名，使不同實(shí)驗(yàn)室之間，同一實(shí)驗(yàn)室在不同時(shí)間獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間能夠準(zhǔn)確比對(duì)。為此，學(xué)者們對(duì)于分型問(wèn)題采取的方法有兩個(gè)1．應(yīng)用從國(guó)外進(jìn)口而來(lái)的試劑盒，其中包括PCR擴(kuò)增和電泳分型的全部試劑，也有與之配套的相應(yīng)基因座Ladder。在一定程度上，其可解決標(biāo)準(zhǔn)問(wèn)題，卻同時(shí)存在如下嚴(yán)重不足(1)基因座被限定某個(gè)STR基因座的檢測(cè)是由它特定的引物所確定的，也就是說(shuō)，PCR反應(yīng)體系中存在那個(gè)STR基因座引物就確定了那個(gè)基因座所在的DNA片段被擴(kuò)增、放大。在進(jìn)口試劑盒中，STR基因座引物是與其它試劑配套存在，這就限定了所能檢測(cè)的STR基因座。盡管STR基因座在人群中均有較高的多態(tài)性，即較高個(gè)體識(shí)別能力(識(shí)別能力的高低由多態(tài)性的高低決定)。但同一STR基因座在不同的人種中，這種多態(tài)性有明顯的差異。進(jìn)口試劑盒能檢測(cè)的多數(shù)STR基因座雖然在國(guó)外的一些群體中有較理想的多態(tài)性，但在中國(guó)人群中卻不盡人意。對(duì)于試劑盒中的這些對(duì)不同個(gè)體不能進(jìn)行有效區(qū)分的基因座，補(bǔ)救辦法只有兩個(gè)選擇要么加做額外的基因座，要么用高識(shí)別能力的基因座代替它，隨之而來(lái)的就是下面將要提到的1-(3)和2-(2)中的問(wèn)題。
(2)浪費(fèi)不可控制，試劑盒的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便易行，但必須嚴(yán)格地按照它的說(shuō)明書所規(guī)定的條件和步驟進(jìn)行操作，對(duì)任何環(huán)節(jié)的改動(dòng)和不慎操作會(huì)影響整個(gè)檢驗(yàn)，甚至導(dǎo)致整個(gè)試驗(yàn)的失敗。一方面，試劑盒一般將各種試劑進(jìn)行整體包裝，操作者無(wú)從應(yīng)特殊要求對(duì)單個(gè)試劑進(jìn)行調(diào)整，導(dǎo)致本可成功的試驗(yàn)得到失敗的結(jié)果；另一方面，試劑盒一般是針對(duì)一些易于檢測(cè)的樣品而設(shè)計(jì)，其常常難以完成形形色色、保存條件不一樣品的檢測(cè)，對(duì)常常受一定程度腐敗影響的法醫(yī)學(xué)檢材更是如此。所以，利用試劑盒檢測(cè)會(huì)帶來(lái)不可預(yù)料的、難以控制的浪費(fèi)。
(3)檢測(cè)成本昂貴目前使用的試劑盒大多為從國(guó)外進(jìn)口而來(lái)，加之一次性使角的特性使得試劑盒檢測(cè)成本高居不下，若再加上為補(bǔ)救1-(1)中所述的低識(shí)別能力基因座加做額外基因座，或1-(2)中所述的因單個(gè)問(wèn)題導(dǎo)致全部試劑的浪費(fèi)?？梢韵胂?，常規(guī)地使用進(jìn)口試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，將為實(shí)際工作帶來(lái)一個(gè)巨大的經(jīng)濟(jì)壓力。
2．針對(duì)進(jìn)口試劑盒上述嚴(yán)重不足，國(guó)內(nèi)學(xué)者采取了另外一個(gè)方案來(lái)完成STR的檢測(cè)即PCR-聚丙烯凝膠電泳-銀染整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中的試劑都由實(shí)驗(yàn)室根據(jù)需要單個(gè)訂購(gòu)，基因座Ladder實(shí)驗(yàn)室自己制備，或采用進(jìn)口試劑盒中的相應(yīng)基因座的Ladder。
(1)此方案的優(yōu)點(diǎn)①可根據(jù)不同的需要選擇基因座及其數(shù)量。尤其在檢材有限，需選取在我國(guó)群體中識(shí)別能力較高的基因座時(shí)，這一點(diǎn)顯得極其重要。
②完成同一個(gè)檢測(cè)所消耗試劑的費(fèi)用大幅度下降?？蓮倪M(jìn)口試劑的每百人份三個(gè)基因座的4,000-5,000人民幣下降每百人份三個(gè)基因座的1,000-2000人民幣。
③可根據(jù)需要，對(duì)檢測(cè)過(guò)程中的任一環(huán)節(jié)進(jìn)行修改和優(yōu)化，而不影響整個(gè)檢測(cè)效率。如在對(duì)降解檢材，受過(guò)污染的檢材，輪奸案中的個(gè)人認(rèn)定等情況下，能否對(duì)個(gè)別環(huán)節(jié)的適當(dāng)調(diào)整常常決定著整個(gè)檢測(cè)能否成功。
(2)此方案存在的問(wèn)題這個(gè)方案的確解決了進(jìn)口試劑盒所存在的基因座被限定、浪費(fèi)不可控制和檢測(cè)成本昂貴等問(wèn)題，可是統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的問(wèn)題并未得到解決①盡管自己訂購(gòu)其他試劑，同時(shí)使用試劑盒中提供的基因座Ladder來(lái)完成PCR及整個(gè)檢測(cè)過(guò)程的方法既可以節(jié)約費(fèi)用，又可以兼顧統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的問(wèn)題，可遺憾的沒(méi)有商家會(huì)單獨(dú)提供STR-Ladder，它總是與其它試劑配套出售的，所以試劑盒中的Ladder是有限的。
②學(xué)者在不斷地探索著新的STR基因座，也的確發(fā)現(xiàn)了不少的在我國(guó)群體分析中表現(xiàn)出較高識(shí)別能力的STR基因座，對(duì)這些基因座的檢測(cè)，目前還沒(méi)有商家提供其相應(yīng)的試劑盒，當(dāng)然更無(wú)從獲得其商品化的Ladder。國(guó)內(nèi)學(xué)者們采取的辦法是自己構(gòu)建這些基因座的Ladder。方法及問(wèn)題如下③目前國(guó)內(nèi)學(xué)者制備STR基因座Ladder方法是A、混合不同基因型的基因組DNA，直接以它們?yōu)槟０澹琍CR擴(kuò)增，產(chǎn)物作Ladder用。
B、混合不同基因型PCR產(chǎn)物，作一定的處理，如稀釋、純化等，以之為模板，再次PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物混合后作Ladder用。
C、回收凝膠中的等位基因片段，以之為模板，再次PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物混合后作Ladder用。
以上方法制備STR基因座Ladder的方法存在如下問(wèn)題由于各實(shí)驗(yàn)室所遵循的命名方式不同，會(huì)出現(xiàn)同一基因座不同名稱，同一基因座的同一等位基因不同名稱的現(xiàn)象。這種沒(méi)有按照國(guó)際統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)原則進(jìn)行命名的一個(gè)重要原因是小于150堿基(bp)的小片段的等位基因片段不能用現(xiàn)有的DNA測(cè)序方法完成其序列結(jié)構(gòu)分析。而此原則要求按照核心序列的重復(fù)次數(shù)對(duì)等位基因片段命名。由此出現(xiàn)了多種沒(méi)有經(jīng)過(guò)測(cè)序并按國(guó)際統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行命名的不同命名結(jié)果，這個(gè)給實(shí)驗(yàn)室間的結(jié)果比較帶來(lái)麻煩。
這種自制的Ladder缺乏連續(xù)性，無(wú)論是以上述任何一種方式獲得的Ladder，其包含的等位基因片段的PCR擴(kuò)增獲得，要么以不同基因型的基因組DNA為模板，要么以一些小片段的等位基因片段為模板。然而，從幾個(gè)固定的個(gè)體那里獲得基因組DNA是有限的，難以滿足多個(gè)實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期的需要；小片段的等位基因不能長(zhǎng)期保存，容易降解，失去模板作用，也不能維持多個(gè)實(shí)驗(yàn)室的長(zhǎng)期需要。所以，用這些方法制備的Ladder會(huì)因?yàn)楂@得等位基因片段的PCR模板的變動(dòng)而失去其連續(xù)性。
由于受模板來(lái)源和量以及PCR擴(kuò)增效率的限制，應(yīng)用這種方法能夠獲得的Ladder的不但量很有限，且缺乏連續(xù)性，難以滿足多個(gè)實(shí)驗(yàn)室的長(zhǎng)期需要，也不能解決標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題。
本發(fā)明的目的是提供一種利用分子克隆技術(shù)制備人類DNA短串聯(lián)重復(fù)序列基因座(STR)的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物的方法，它可以解決STR在分型上長(zhǎng)期存在的準(zhǔn)確性和標(biāo)準(zhǔn)性問(wèn)題。
實(shí)現(xiàn)上述目的技術(shù)方案是，它包括下列步驟(1)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增獲得待克隆的人類DNA短串聯(lián)重復(fù)序列基因座(STR)長(zhǎng)度不同的各等位基因片段；(2)將上述PCR擴(kuò)增的等位基因片段與質(zhì)粒載體重組，將裝載有STR等位基因片段的重組質(zhì)粒再轉(zhuǎn)染至感受態(tài)細(xì)菌中培養(yǎng)和繁殖，然后選出已含有插入片段正確的克??；(3)DNA測(cè)序分析上述獲得的重組質(zhì)粒中的STR等位基因片段序列并按國(guó)際統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)命名；(4)用經(jīng)測(cè)序證實(shí)含有正確等位基因插入片段的重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物經(jīng)純化、混合后即獲得相應(yīng)STR等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物(即Ladder)。
上述第一步中獲取待克隆的STR等位基因片段的工藝可以是①、將提取的群體DNA樣本經(jīng)CHELEX-100等方法處理，取得裸露的DNA分子；②、上述取得的DNA分子經(jīng)PCR擴(kuò)增和凝膠電泳檢測(cè)，從凝膠中找到并回收STR基因座不同大小片段長(zhǎng)度的等位基因片段，制備成PCR的再擴(kuò)增模板；③、以上述STR等位基因片段為模板，再度進(jìn)行PCR擴(kuò)增放大，提高其不同大小片段長(zhǎng)度的等位基因各自的拷貝數(shù)。
前述第二步中，PCR擴(kuò)增的等位基因片段，可以通過(guò)T/A克隆法、平端插入法或粘性末端連接法實(shí)現(xiàn)與質(zhì)粒載體重組。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至感受態(tài)細(xì)菌培養(yǎng)后，采用PCR方法選擇出含有正確插入片段的克隆。
本發(fā)明的設(shè)計(jì)的制備STR的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物(Ladder)的技術(shù)方案有如下優(yōu)點(diǎn)和意義1．用分子克隆技術(shù)制備STR基因座等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)(參照)物，相對(duì)目前應(yīng)用較多的簡(jiǎn)單PCR擴(kuò)增法來(lái)說(shuō)，其特點(diǎn)是通過(guò)重組質(zhì)粒保存STR基因座的等位基因，等位基因片段的重組質(zhì)粒的建立實(shí)現(xiàn)了分型標(biāo)準(zhǔn)(參照)物永久的同一性。使得試驗(yàn)結(jié)果的比對(duì)不受時(shí)間和地域的限制。
2．用分子克隆技術(shù)制備的STR基因座等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)參照物可以通過(guò)重組質(zhì)粒永久保存。提純的環(huán)狀的質(zhì)粒DNA具有高度的穩(wěn)定性，在-20℃以下可長(zhǎng)期保存；同時(shí)其可通過(guò)轉(zhuǎn)染細(xì)菌，擴(kuò)大培養(yǎng)進(jìn)行繁殖，這種在細(xì)菌中的無(wú)性繁殖可保持其高度的連續(xù)性，最終實(shí)現(xiàn)Ladder的同一性。
3．裝載有STR等位基因片段的重組質(zhì)粒不但可以通過(guò)細(xì)菌進(jìn)行大量繁殖，也可以以極少量的重組質(zhì)粒為模板，通過(guò)PCR制備出大量的等位基因片段。因?yàn)橹亟M質(zhì)粒的DNA呈環(huán)狀，所以加載在質(zhì)粒上的等位基因在PCR擴(kuò)增過(guò)程中以“滾爬”的方式進(jìn)行復(fù)制，表現(xiàn)出極高的擴(kuò)增效率，即在同樣條件的PCR擴(kuò)增過(guò)程，可以產(chǎn)生比普通DNA模板多出數(shù)倍的PCR產(chǎn)物。這些高濃度的PCR擴(kuò)增獲得的STR等位基因片段通過(guò)簡(jiǎn)單的純化、混合便可獲得大量?jī)?yōu)質(zhì)的STR基因座的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)(參照)物。
4．小片段的等位基因片段被裝載于質(zhì)粒之上后，可以用質(zhì)粒測(cè)序的公共引物完成對(duì)其序列結(jié)構(gòu)的分析，免除小片段STR等位基因片段不能直接進(jìn)行序列分析的缺憾。所以此法制備的STR基因座等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)(參照)物中的等位基因片段均能夠按照國(guó)際統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)命名，適合于任何實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)相應(yīng)基因座的標(biāo)準(zhǔn)(參照)物。
5．本發(fā)明可建立裝載有高識(shí)別能力STR基因座的等位基因的重組質(zhì)粒庫(kù)。這不但可以大大降低檢測(cè)的成本費(fèi)用，同時(shí)可大大提高檢測(cè)的效率。一方面，不用為解決統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)問(wèn)題而采用試劑盒中的Ladder，但同時(shí)必須以高價(jià)購(gòu)置商品試劑盒中其他本可單獨(dú)低價(jià)訂購(gòu)的試劑；另一方面，有了具高識(shí)別能力的STR基因座及其相應(yīng)的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)參照物，在一次檢測(cè)中就達(dá)到個(gè)人識(shí)別目的的機(jī)會(huì)就因之上升，避免了加做額外基因座所產(chǎn)生的費(fèi)用。
6．用本方法獲得的STR基因座等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)(參照)物代替商品試劑盒中的分型Ladder，可同時(shí)完全免除使用進(jìn)口試劑盒以及其存在的重大不足，并充分體現(xiàn)由實(shí)驗(yàn)室根據(jù)需要單個(gè)訂購(gòu)檢測(cè)試劑的全部?jī)?yōu)點(diǎn)。
7．用分子克隆技術(shù)方案獲得的STR基因座等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)(參照)物因具有永久的同一性，無(wú)限的可繁殖性，可大量的生產(chǎn)性又按照國(guó)際統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)命名，所以其可以滿足眾多STR-DNA分析實(shí)驗(yàn)室對(duì)STR基因座Ladder的需要，可解決STR-DNA分型的標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題，且必將推進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)STR基因座檢測(cè)的國(guó)產(chǎn)化，最終擺脫對(duì)國(guó)外一些試劑公司的完全依賴。
總之，用本方案制備STR基因座的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)參照物可推進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)STR基因座檢測(cè)在我國(guó)法科學(xué)中應(yīng)用的普及，它們?yōu)檎_建立我國(guó)STR-DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，將為保證法醫(yī)DNA檢測(cè)分析技術(shù)準(zhǔn)確、公正和可靠地為案件的偵破提供線索、為法律審判提供證據(jù)發(fā)揮重要的意義。
下面結(jié)合附圖和實(shí)例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。


圖1為STR基因座標(biāo)準(zhǔn)分型物及不同片段大小的等位基因凝膠電泳分離結(jié)果圖。
圖中1-9為以重組質(zhì)粒為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得的各等位基因片段；M為DYS385基因座等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物。
本發(fā)明所設(shè)計(jì)的技術(shù)方案制備STR的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物的操作步驟如下1、用PCR擴(kuò)增獲得待克隆的STR等位基因片段，又稱待克隆的等位基因片段的準(zhǔn)備(1)提取DNA分子，即收集STR基因座的不同長(zhǎng)度的等位基因片段任何含有人體DNA的組織或細(xì)胞通過(guò)酶、高溫及CHELEX等多種因素下，DNA分子會(huì)與其在自然狀態(tài)下相結(jié)合的蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)分離，裸露地存在于水溶液中，為下一步的反應(yīng)創(chuàng)造良好的條件。
(2)第一次PCR擴(kuò)增、凝膠電泳檢測(cè)目的為找到不同長(zhǎng)度的等位基因片段，作為第二次PCR擴(kuò)增模板將提取的群體DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用7％非變性聚丙烯酰胺凝膠(交聯(lián)度為5％)電泳分離PCR擴(kuò)增片段，銀染顯色或基因凝膠掃描系統(tǒng)判定樣品基因型，選出包含不同大小片段長(zhǎng)度的等位基因的個(gè)體樣本及擴(kuò)增產(chǎn)物。
其基本原理如下
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，簡(jiǎn)稱PCR)a、PCR反應(yīng)混合PCR反應(yīng)所需的試劑包括目標(biāo)基因座引物(有熒光標(biāo)記或沒(méi)有)、dNTP、1X標(biāo)準(zhǔn)Taq緩沖液、MgCl2、TaqDNA聚合酶，最后加入樣本模板DNA 1μl，反應(yīng)體系20-100μl。
b、PCR反應(yīng)條件95℃3min，然后94℃ 30s,56-62℃ 30s,72℃ 1min，30個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)延伸7min。
c、PCR基本原理DNA在有上述試劑存在時(shí)，當(dāng)溫度在94℃-56-62℃-72℃之間不斷循環(huán)時(shí)，其雙鏈會(huì)跟隨溫度不斷重復(fù)打開(kāi)-聚合-形成新的拷貝的循環(huán)，最終倍增、放大基因座所在特定DNA片段的拷貝數(shù)，從而微小的DNA片段可以通過(guò)普通的檢測(cè)方法變得肉眼可見(jiàn)。
d、電泳分離DNA分子帶有負(fù)電荷，當(dāng)有電壓存在時(shí)，它會(huì)從凝膠的負(fù)極向正極泳動(dòng)，但由于DNA分子的片段大小不同，其泳動(dòng)速度不一致，當(dāng)穩(wěn)定的電壓保持一定時(shí)間后，不同大小的DNA分子將泳動(dòng)到凝膠的不同位置。具體操作為將適量(1-5μl)的樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物加載于聚丙烯酰胺凝膠上，同步穩(wěn)壓500-700V電泳60-100min。通過(guò)銀染顯色法或基因掃描軟件閱讀判定樣品基因型。
(3)第二次PCR擴(kuò)增目的為將第一次PCR擴(kuò)增、凝膠電泳檢測(cè)所發(fā)現(xiàn)的不同長(zhǎng)度的等位基因片段，進(jìn)行倍增，放大，即提高其不同大小片段長(zhǎng)度的等位基因各自的拷貝數(shù)。第二次PCR擴(kuò)增的模板可為以下三種A、不同等位基因的純合子個(gè)體的基因組DNA。純合子個(gè)體即他的基因型由兩個(gè)片段長(zhǎng)度相同的等位基因構(gòu)成。
B、不同等位基因的純合子的經(jīng)純化，稀釋5-1000倍的第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
C、從凝膠中回收的不同大小片段長(zhǎng)度的等位基因片段。方法為切割出含各等位基因片段的凝膠，將其中相應(yīng)的等位基因片段洗脫于消毒雙蒸水中，制備成PCR的再擴(kuò)增模板。
2、PCR擴(kuò)增的等位基因片段的克隆，即將不同片段大小的等位基因片段重組到質(zhì)粒載體上，然后轉(zhuǎn)染到感受態(tài)細(xì)菌中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和繁殖，并用PCR擴(kuò)增法，選擇出已含插入片段正確的克隆。
(1)質(zhì)粒重組可通過(guò)如下三種方式實(shí)現(xiàn)
A、平端插入法，足量的等位基因片段可在一定溫度和必要試劑存在的條件下，經(jīng)T4連接酶的催化，可與質(zhì)粒DNA的兩個(gè)末端連接。
B、粘性末端連接法，對(duì)STR基因座的引物進(jìn)行專門的設(shè)計(jì)，使PCR擴(kuò)增后的片段中包含某一內(nèi)切酶的作用點(diǎn)，經(jīng)此內(nèi)切酶作用后，釋放出帶有某個(gè)突出堿基(如C堿基)的等位基因片段，然后在T4連接酶的催化下，與帶有與等位基因片段所突出的堿基能夠互補(bǔ)的堿基(如G堿基)的質(zhì)粒載體發(fā)生反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)等位基因片段與質(zhì)粒DNA的兩個(gè)末端連接。
C、T/A克隆法，用加A試劑盒，給PCR擴(kuò)增后的等位基因片段加一個(gè)A堿基，然后在T4連接酶的催化下，與帶有與等位基因片段所突出的A堿基能夠互補(bǔ)的1堿基的質(zhì)粒載體(如pUC質(zhì)粒)發(fā)生反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)等位基因片段與質(zhì)粒DNA的兩個(gè)末端連接。
(2)將重組質(zhì)粒在42℃轉(zhuǎn)染到感受態(tài)細(xì)菌中，細(xì)菌在37℃恒溫中振蕩培養(yǎng)2小時(shí)左右；利用選擇性平板培養(yǎng)后，用PCR方法選擇出含有插入片段大小正確的細(xì)菌克隆，從中提取質(zhì)粒DNA。
3、重組質(zhì)粒的DNA測(cè)序及標(biāo)準(zhǔn)命名采用熒光標(biāo)記雙脫氧核苷酸(ddNTP)測(cè)序試劑盒，ABI310全自動(dòng)測(cè)序儀，以質(zhì)粒公用引物從插入片段的兩端對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析。按國(guó)際法庭血液遺傳學(xué)學(xué)會(huì)(International Society of Forensic Haemogenetics，簡(jiǎn)稱ISFH)規(guī)定的命名原則，對(duì)插入的等位基因片段進(jìn)行命名。此原則是用STR基因座的核心重復(fù)序列循環(huán)次數(shù)對(duì)相應(yīng)等位基因片段命名。例如DYS385基因座的核心重復(fù)序列為GAAA，當(dāng)某一片段中包含的GAAA循環(huán)11次時(shí)，此片段命名為11。如此類推。
4、以重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物經(jīng)純化、混合后即獲得相應(yīng)STR基因座的Ladder。
(1)以重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得高濃度的各等位基因片段的擴(kuò)增產(chǎn)物；(2)用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化各等位基因PCR擴(kuò)增片段；(3)將純化過(guò)的各等位基因片段混合，其混合物電泳后形成梯子狀標(biāo)準(zhǔn)分型物帶譜即Ladder，不同的標(biāo)準(zhǔn)等位基因片段在該帶譜中處于不同的位置。待測(cè)樣品基因型的判定即可根據(jù)其譜帶與該Ladder相對(duì)應(yīng)的位置及數(shù)目而得出。
下面結(jié)合DYS385 STR基因座的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物舉例說(shuō)明1、待克隆的等位基因片段的準(zhǔn)備(1)PCR擴(kuò)增，制備DYS385基因座的等位基因片段再擴(kuò)增模板制備標(biāo)準(zhǔn)分型參照物模板DNA將提取的群體DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用7％非變性聚丙烯酰胺凝膠(交聯(lián)度為5％)電泳分離PCR擴(kuò)增片段，銀染顯色。從群體樣本中選出9個(gè)不同大小片段長(zhǎng)度的等位基因，切割出含相應(yīng)片段的凝膠，回收洗脫于消毒雙蒸水中，制備成PCR的再擴(kuò)增模板。
(2)PCR再擴(kuò)增，產(chǎn)物鑒定及純化將制備好的9份模板DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系100μl，內(nèi)含0.2μmol/L DYS385引物，200μmol/L dNTP,50μmol/L KCl,10mmol/L Tris-HCl(pH8.3),1.5mmol/L MgCl2,1U Taq酶，模板DNA 1μl。PCR反應(yīng)條件為95℃3min，然后94℃ 30s,59℃ 30s,72℃ 1min，30個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)延伸7min。取1μl擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，銀染后，確定出其片段大小，用PCR純化試劑盒將大小正確的PCR擴(kuò)增片段產(chǎn)物純化。
2、PCR擴(kuò)增片段的克隆采用平端插入克隆試劑盒，將純化后的9個(gè)PCR片段直接插入pUC18/19質(zhì)粒的SmaⅠ酶切點(diǎn)位置。將重組后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到感受態(tài)細(xì)菌DH5αTM中，經(jīng)選擇培養(yǎng)篩選后，再用PCR方法選擇出含有插入片段正確的克隆。
3、重組質(zhì)粒的DNA測(cè)序采用熒光標(biāo)記雙脫氧核苷酸(ddNTP)測(cè)序試劑盒，ABI310全自動(dòng)測(cè)序儀，以pUC質(zhì)粒公用引物從插入片段的兩端對(duì)9個(gè)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果證明其插入的9個(gè)片段是一個(gè)分別由GAAA四核苷酸核心序列分別重復(fù)11-19次組成的不同長(zhǎng)度片段，其長(zhǎng)度為252bp-288bp。按國(guó)際法庭血液遺傳學(xué)學(xué)會(huì)(ISFH)規(guī)定的命名原則，插入的等位基因片段為DYS385等位基因11-19(參見(jiàn)
圖1中1-9泳道)。
4、以重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)純化、混合制備出所需Ladder。
(1)重組質(zhì)粒的擴(kuò)大培養(yǎng)及純化對(duì)經(jīng)測(cè)序證實(shí)含有正確等位基因插入片段的質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)質(zhì)粒純化試劑盒純化后，得到標(biāo)準(zhǔn)命名的DYS385等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)參照物重組質(zhì)粒。
(2)等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物階梯的制備用含有DYS385等位基因插入片段的重組質(zhì)粒DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化擴(kuò)增產(chǎn)物，最后將各DYS385等位基因的PCR純化物混合，電泳分離顯色后即可見(jiàn)DYS385基因座Ladder(參加
圖1中的M泳道)。
權(quán)利要求
1.一種人類基因短串聯(lián)重復(fù)序列分型標(biāo)準(zhǔn)物的分子克隆制備方法，其特征在于它包括下列步驟(1)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增獲取待克隆的人類DNA短串聯(lián)重復(fù)序列基因座的大小不同的各等位基因片段；(2)將上述擴(kuò)增的等位基因片段與質(zhì)粒載體重組，重組質(zhì)粒再轉(zhuǎn)染至感受態(tài)細(xì)菌中培養(yǎng)和繁殖，然后選出已含有插入片段正確的克??；(3)DNA測(cè)序分析上述獲得的重組質(zhì)粒中的等位基因片段的序列并按國(guó)際統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)命名；(4)用經(jīng)測(cè)序證實(shí)含有正確等位基因插入片段的重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，其產(chǎn)物經(jīng)純化、混合后即獲得相應(yīng)的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于獲取待克隆的等位基因片段的工藝是(1)將提取的群體DNA樣本經(jīng)CHELEX-100等方法處理，取得裸露的基因組DNA分子；(2)上述取得的DNA分子經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增和凝膠電泳檢測(cè)，從凝膠中找到并回收不同大小片段長(zhǎng)度的等位基因片段，制備成再擴(kuò)增模板；(3)以上述等位基因片段為模板，再度進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，以放大，提高各等位基因各自的拷貝數(shù)。
3.如權(quán)利要求1或2所述方法，其特征在于擴(kuò)增的等位基因片段可通過(guò)T/A克隆法實(shí)現(xiàn)與質(zhì)粒載體重組，即采用加A試劑盒，給擴(kuò)增的等位基因片段加一個(gè)A堿基，然后在T4連接酶的催化下與帶T突出堿基的質(zhì)粒載體反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)等位基因片段與質(zhì)粒DNA的兩個(gè)未端連接。
4.如權(quán)利要求1或2所述方法，其特征在于擴(kuò)增的等位基因片段可通過(guò)平端插入法實(shí)現(xiàn)與質(zhì)粒載體重組，即等位基因片段經(jīng)T4連接酶催化，與質(zhì)粒DNA的兩個(gè)末端連接。
5.如權(quán)利要求1或2所述方法，其特征在于擴(kuò)增的等位基因片段可通過(guò)粘性末端連接法實(shí)現(xiàn)與質(zhì)粒載體重組，即擴(kuò)增的等位基因片段經(jīng)內(nèi)切酶作用，使其釋放出帶有某個(gè)突出堿基的等位基因片段，然后通過(guò)堿基互補(bǔ)與帶有相應(yīng)互補(bǔ)堿基的質(zhì)粒載體反應(yīng)，在T4連接酶的催化下實(shí)現(xiàn)等位基因片段與質(zhì)粒DNA的兩個(gè)末端連接。
6.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至感受態(tài)細(xì)菌培養(yǎng)后，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法選擇出含有插入片段大小正確的克隆。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用分子克隆技術(shù)制備人類短串聯(lián)重復(fù)序列基因座(STR)等位分型標(biāo)準(zhǔn)物的方法。它的最大特點(diǎn)是將PCR擴(kuò)增獲得的STR等位基因片段與質(zhì)粒載體重組,裝載有STR等位基因片段的重組質(zhì)粒既可以通過(guò)細(xì)菌大量繁殖,也可以重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,制備出大量等位基因片段,最后通過(guò)簡(jiǎn)單的純化、混合便可獲得大量?jī)?yōu)質(zhì)STR等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物。本發(fā)明制備的STR等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物具永久的同一性和國(guó)際統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)命名,可以解決STR在分型上長(zhǎng)期存在準(zhǔn)確性和標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1312371SQ0110723
公開(kāi)日2001年9月12日 申請(qǐng)日期2001年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月5日
發(fā)明者張 林, 辛軍平, 陳國(guó)弟, 饒莉 申請(qǐng)人:四川大學(xué)