新的短核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列位點及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新的短核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列位點及其應(yīng)用，短串聯(lián)重復(fù)序列基因座G11S0001，序列如SEQIDNO.:1所示，用于制備(a)用于遺傳關(guān)系分析的試劑或試劑盒；(b)用于個體識別的試劑或試劑盒；(c)用于親子鑒定或血緣分析的試劑或試劑盒；(d)用于檢測抽提羊水中是否存在母血污染的試劑或試劑盒；和/或(e)用于檢測骨髓移植后受體中的白細(xì)胞是否被供體細(xì)胞取代的試劑盒。短串聯(lián)重復(fù)序列基因座G11S0001區(qū)分度高，能夠有效地分析遺傳關(guān)系。
【專利說明】[0001] 新的短核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列位點及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及一種短核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列位點及其應(yīng)用。
[0003]

【背景技術(shù)】
[0004] 短串聯(lián)重復(fù)序列（Short Tandem Repeat. STR)，又稱微衛(wèi)星DNA (microsatellite DNA)，是一類重復(fù)單位2-6bp，重復(fù)次數(shù)10-60,片段長度在400bp以下的DNA串聯(lián)重復(fù) 序列；其產(chǎn)生原因是DNA復(fù)制過程中滑動，或在復(fù)制和修復(fù)時滑動鏈與互補鏈堿基錯配， 導(dǎo)致一個或幾個重復(fù)單位的缺失或插入。STR具有在基因組中分布廣泛、等位基因多、 雜合度高、分型結(jié)果穩(wěn)定，STR遺傳符合孟得爾遺傳定律（Koreth，J.，etal. 1996. Microsatellites and PCR ge-nomic analysis. J. Pathol. 178: 239-248.)等特點，并且 多個STR基因座聯(lián)合檢測時，個體識別力和非父排除率高。因而STR以其遺傳多態(tài)性等特 征，已被作為第二代遺傳標(biāo)記廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)個體識別、人類遺傳圖譜繪制、親子鑒定、法 醫(yī)物證檢驗等領(lǐng)域，有效地推動了法醫(yī)鑒定學(xué)從以往物證樣本的個體排除向個體識別全 面轉(zhuǎn)換。
[0005] 目前，個體識別的技術(shù)主要采用STR-PCR檢測，對多個STR基因座聯(lián)合分型，以確 定未權(quán)關(guān)系或個體識別等，在實驗方法都相對成熟，但在STR基因座的選擇上，沒有統(tǒng)一標(biāo) 準(zhǔn)。國內(nèi)外生產(chǎn)商提供的檢測試劑盒中所用的位點不盡相同。早期歐美選用10個STR基 因座加 1 個性別決定基因（E.A. Cotton, R.F. Allsop, J.F. Guest, R.R.E. Frazier, P. Koumi，I. P. Callow, A. Seager, R. L. Sparkes，Validation of the AmpFlSTR@SGM Plus ? system for use in forensic casework, Forensic Sci. Int. 112 (2000) 151 - 161.)。后來隨著技術(shù)發(fā)展、數(shù)據(jù)庫增多，比對信息難度加大，STR基因座的選擇也在 不斷改進?，F(xiàn)在比較有影響力的數(shù)據(jù)庫C0DIS(Combined DNA Index System)是由美國FBI 基于 13 個 STR 基因座（D3S1358, vWA，D16S539, D5S818, D7S820, CSF1P0, D13S317, ΤΡ0Χ， D8S1179，D21S11，D18S51，TH01，F(xiàn)GA.)構(gòu)建，因而現(xiàn)在大多數(shù)STR檢測試劑盒生產(chǎn)商也在 這13個核心基因座的基礎(chǔ)上增加或刪減一些位點以提高檢測效率及準(zhǔn)確率（D. J. French， R. L. Howard, N. Gale, T. Brown, D. G. McDowell, P. G. Debenhan, Interrogation of short tandem repeats using fluorescent probes and melting curve analysis:A step towards rapid DNA identity screening. Forensic Science. (2008)333-339)〇 例如Promega公司的PowerPlex?16 System試劑盒包括了 13個核心基因座，并增加 了 PentaD、PentaE 和 AMEL0 三個基因座；美國 ABI 公司的 AmpF/STR? Identifiler? PCR Amplification Kit則是13個核心基因座加上D2S1338、D19S433和AMEL0 ;其公司的另外 兩款試劑盒 AmpFlSTR?SGM Plus? PCR Amplification Kit 和 AmpFISTR? Sinofiler?PCR Amplification Kit也做了相應(yīng)基因座位點的增減。國內(nèi)生產(chǎn)類似檢測試劑盒的單位也有 很多，例如公安部二所推廣的DNA Typer ? 15,中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司的AG⑶EX22 STR熒光檢測試劑盒，所檢測基因座增至22個。
[0006] 以上試劑盒選擇的STR基因座的優(yōu)點在于，以13個得到公認(rèn)的核心基因座為基 礎(chǔ)，附加一些其它位點以豐富所檢測得到的信息量，能較全面的反應(yīng)出個體間的差異性，進 而完成個體識別、父權(quán)判定等工作。但是所用的這些基因座中并非都是最優(yōu)選擇，例如FGA 基因座存在序列長度過長、重復(fù)單元多但跨度不連續(xù)，從而影響了與其它位點的兼容性，不 利于與多個基因座聯(lián)合檢測的多重體系運用；D19S433基因座則位于基因組中高度重復(fù)序 列區(qū)，擴增引物設(shè)計存在較大麻煩，并且該位點的穩(wěn)定性不高，應(yīng)用于個體識別時所提供的 可用信息質(zhì)量和區(qū)分度都不高；再如D21S11基因座除了存在位于基因組中高度重復(fù)序列 區(qū)域的問題之外，還發(fā)現(xiàn)在該基因座所在區(qū)域中可能存在CNV(基因拷貝數(shù)變異的情況；在 遇到基因拷貝數(shù)非正常的樣本檢測時，會降低該位點STR分型的準(zhǔn)確度，在個人識別中采 用該基因座的效果也會大打折扣。隨著人類基因組圖譜的建立及測序技術(shù)的發(fā)展，以較低 的成本，在較快的時間內(nèi)對個人全基因組重測序成為可能，進而能在較大的信息量下篩選 出區(qū)分度更高的STR基因座，推動了應(yīng)用于個體識別等研究中的STR基因座的選擇與更新。
[0007] 因此，為克服兼容性差、存在CNV或位于高度重復(fù)序列區(qū)域等缺陷，本領(lǐng)域尚需一 種新型的具有高區(qū)分度的短串聯(lián)重復(fù)序列。
[0008]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種新型的短串聯(lián)重復(fù)序列基因座，不存在CNV，且不位于 高度重復(fù)序列區(qū)域，具有高區(qū)分度。
[0010] 本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的短串聯(lián)重復(fù)序列基因座G11S0001，序列如SEQ ID NO. : 1所示。
[0011] 本發(fā)明的第二方面，提供一種分離的核苷酸序列，所述核苷酸序列的結(jié)構(gòu)如下： X1-X2-X3 式中，XI 為 SEQ ID N0. : 2 中第 1-800 位； X2為含有> 2個重復(fù)單元tatc和aaat的遺傳多態(tài)區(qū)； X3 為 SEQ ID N0. : 2 中第 935-1640 位。
[0012] 本發(fā)明的第三方面，提供第一方面所述的短串聯(lián)重復(fù)序列基因座G11S0001的用途，用 于制備： (a) 用于遺傳關(guān)系分析的試劑或試劑盒； (b) 用于個體識別的試劑或試劑盒； (c) 用于親子鑒定或血緣分析的試劑或試劑盒； (d) 用于檢測抽提羊水中是否存在母血污染的試劑或試劑盒；和/或 (e) 用于檢測骨髓移植后受體中的白細(xì)胞是否被供體細(xì)胞取代的試劑盒。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑包括⑴引物或引物對；（ii)探針；（iii)核酸芯 片。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述的引物對的序列如SEQ ID NO. : 3和SEQ ID NO. :4所示。
[0015] 本發(fā)明的第四方面，提供一種特異性擴增短串聯(lián)重復(fù)序列基因座G11S0001的引物對， 所述的引物對的序列如SEQ ID N0. : 3和SEQ ID N0. :4所示。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述短串聯(lián)重復(fù)序列基因座G11S0001如第一方面所述。
[0017] 本發(fā)明的第五方面，提供一種試劑盒，包括： (a) 用于特異性擴增短串聯(lián)重復(fù)序列基因座G11S0001的引物對； (b) 使用說明書。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述短串聯(lián)重復(fù)序列基因座G11S0001如第一方面所述。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還包括（c)特異性擴增選自下組的一種或多種基因 座的引物對： D3S1358、vWA、D16S539、D5S818、D7S820、CSF1P0、D13S317、ΤΡ0Χ、D8S1179、D21S11、 D18S51、TH01、FGA、D2S1338、D19S433、AMEL0。
[0020] 本發(fā)明的第六方面，提供一種擴增體系，包括： (a) 用于特異性擴增短串聯(lián)重復(fù)序列基因座G11S0001的引物對；和 (b) 任選的、特異性擴增選自下組的一種或多種基因座的引物對： D3S1358、vWA、D16S539、D5S818、D7S820、CSF1P0、D13S317、ΤΡ0Χ、D8S1179、D21S11、 D18S51、TH01、FGA、D2S1338、D19S433、AMEL0 ; 并且所述引物對（a)和任選的引物對（b)位于同一擴增體系。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述短串聯(lián)重復(fù)序列基因座G11S0001如第一方面所述。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述的擴增體系為復(fù)合擴增體系，其中，所述的引物對（b)包括 1，2, 3,4, 5,6, 7,8,9,10,11，12,13,14,15,或 16 對特異性引物對；和 / 或 所述復(fù)合擴增體系為熒光標(biāo)記的復(fù)合擴增體系，其中，所述熒光標(biāo)記是指選用下組的 一種或多種熒光標(biāo)記試劑標(biāo)記所述基因座的引物：FAM、HEX、VIC、NED、PET、TAMRA、R0X、熒 光素、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3·5、CY5·5、TET、TAMRA、J0E、B0DIPYTMR、俄勒岡綠、 羅丹明綠、羅丹明紅、德克薩斯紅或雅基馬黃。
[0023] 本發(fā)明的第七方面，提供一種擴增方法，包括步驟： 在第六方面所述的擴增體系中，以待檢測樣本為模板，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進行基因 座的擴增，從而獲得基因座擴增產(chǎn)物。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括：對所述基因座擴增產(chǎn)物進行檢測的步驟。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述的檢測選自下組：毛細(xì)管電泳、測序、雜交。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述待測樣品選自下組：血液、唾液、精液、汗液、羊水、骨骼、或 毛發(fā)。
[0027] 本發(fā)明的第八方面，提供一種遺傳關(guān)系分析方法，包括步驟： 在第六方面所述的擴增體系中，以待檢測樣本為模板，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進行基因 座的擴增，從而獲得基因座擴增產(chǎn)物；和 其中，所述待檢測樣本包括分別來自不同個體的核酸樣本SI, S2,......，Si，式中i為 彡2的正整數(shù)； (2) 對來自不同核酸樣本Sl，S2,……，Si的基因座擴增產(chǎn)物進行檢測，從而獲得對應(yīng) 于不同核酸樣本的檢測結(jié)果； (3) 對步驟（2)獲得的檢測結(jié)果進行比較，從而確定不同個體之間的遺傳關(guān)系。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述遺傳關(guān)系分析包括個體識別分析、親子鑒定分析、血緣關(guān)系 分析。
[0029] 本發(fā)明提供了一種新型的STR基因座，不存在CNV，且不位于高度重復(fù)序列區(qū)域、雜合 度高，分辨率高、兼容性高，能與已有的大多數(shù)位點在同一體系內(nèi)使用，能夠有效區(qū)分隨機 人群的遺傳關(guān)系。
[0030] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實施例）中具體描 述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不 再一一累述。
[0031]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0032] 圖1為父本多個STR位點的檢測峰圖。
[0033] 圖2為母本多個STR位點的檢測峰圖。
[0034] 圖3為子代多個STR位點的檢測峰圖。
[0035] 圖4為無親緣關(guān)系樣本多個STR位點的檢測峰圖。
[0036]

【具體實施方式】
[0037] 本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，通過大量篩選，首次篩選出一種新型的短串聯(lián) 重復(fù)序列基因座G11S0001，含有> 2個重復(fù)單元tatc和aaat的遺傳多態(tài)區(qū)。該短串聯(lián)重 復(fù)序列基因座區(qū)分度達到0. 8156以上，與少量常規(guī)的STR基因座聯(lián)用，可有效區(qū)分遺傳關(guān) 系，區(qū)分度高達0.99以上。在此基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。
[0038] 短串聯(lián)重復(fù)序列基因座 本發(fā)明通過大量篩選，分離出一種新的短串聯(lián)重復(fù)序列基因座，STR位點信息如表1所 /_J、1 〇
[0039] 表1 STR的基本信息 _^^^^

【權(quán)利要求】
1. 一種分離的短串聯(lián)重復(fù)序列基因座G11S0001，其特征在于，所述基因座的序列如 SEQ ID NO. :1 所示。
2. -種分離的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列的結(jié)構(gòu)如下： X1-X2-X3 式中，XI 為 SEQ ID NO. : 2 中第 1-800 位； X2為含有> 2個重復(fù)單元tatc和aaat的遺傳多態(tài)區(qū)； X3 為 SEQ ID NO. : 2 中第 935-1640 位。
3. 如權(quán)利要求1所述的短串聯(lián)重復(fù)序列基因座G11S0001的用途，其特征在于，用于制 備： (a) 用于遺傳關(guān)系分析的試劑或試劑盒； (b) 用于個體識別的試劑或試劑盒； (c) 用于親子鑒定或血緣分析的試劑或試劑盒； (d) 用于檢測抽提羊水中是否存在母血污染的試劑或試劑盒；和/或 (e) 用于檢測骨髓移植后受體中的白細(xì)胞是否被供體細(xì)胞取代的試劑盒。
4. 如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述的試劑包括（i)引物或引物對；（ii) 探針；（iii)核酸芯片。
5. 如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述的引物對的序列如SEQ ID NO. : 3和 SEQ ID NO. :4 所示。
6. -種特異性擴增短串聯(lián)重復(fù)序列基因座G11S0001的引物對，其特征在于，所述的引 物對的序列如SEQ ID NO. : 3和SEQ ID NO. :4所示。
7. -種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括： (a) 用于特異性擴增短串聯(lián)重復(fù)序列基因座G11S0001的引物對； (b) 使用說明書。
8. 如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括（c)特異性擴增選自下 組的一種或多種基因座的引物對： D3S1358、vWA、D16S539、D5S818、D7S820、CSF1P0、D13S317、TPOX、D8S1179、D21S11、 D18S51、TH01、FGA、D2S1338、D19S433、AMEL0。
9. 一種擴增體系，其特征在于，所述擴增體系包括： (a) 用于特異性擴增短串聯(lián)重復(fù)序列基因座G11S0001的引物對；和 (b) 任選的、特異性擴增選自下組的一種或多種基因座的引物對： D3S1358、vWA、D16S539、D5S818、D7S820、CSF1P0、D13S317、TPOX、D8S1179、D21S11、 D18S51、TH01、FGA、D2S1338、D19S433、AMEL0 ; 并且所述引物對（a)和任選的引物對（b)位于同一擴增體系。
10. 如權(quán)利要求9所述的擴增體系，其特征在于，所述的擴增體系為復(fù)合擴增體系，其 中，所述的引物對（b)包括1，2, 3,4, 5,6, 7,8,9,10,11，12,13,14,15,或16對特異性引物 對；和/或 所述復(fù)合擴增體系為熒光標(biāo)記的復(fù)合擴增體系，其中，所述熒光標(biāo)記是指選用下組的 一種或多種熒光標(biāo)記試劑標(biāo)記所述基因座的引物：FAM、HEX、VIC、NED、PET、TAMRA、R0X、熒 光素、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3·5、CY5·5、TET、TAMRA、J0E、B0DIPYTMR、俄勒岡綠、 羅丹明綠、羅丹明紅、德克薩斯紅或雅基馬黃。
11. 一種擴增方法，其特征在于，包括步驟： 在權(quán)利要求9-10中任一所述的擴增體系中，以待檢測樣本為模板，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)進行基因座的擴增，從而獲得基因座擴增產(chǎn)物。
12. -種遺傳關(guān)系分析方法，其特征在于，包括步驟： (1) 在權(quán)利要求9-10中任一所述的擴增體系中，以待檢測樣本為模板，利用聚合酶鏈 式反應(yīng)進行基因座的擴增，從而獲得基因座擴增產(chǎn)物；和 其中，所述待檢測樣本包括分別來自不同個體的核酸樣本SI, S2,......，Si，式中i為 彡2的正整數(shù)； (2) 對來自不同核酸樣本Sl，S2,……，Si的基因座擴增產(chǎn)物進行檢測，從而獲得對應(yīng) 于不同核酸樣本的檢測結(jié)果； (3) 對步驟（2)獲得的檢測結(jié)果進行比較，從而確定不同個體之間的遺傳關(guān)系。
【文檔編號】C12N15/11GK104099325SQ201310111836
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2013年4月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月2日
【發(fā)明者】姜正文, 馬瑞曉, 張希 申請人:天昊生物醫(yī)藥科技（蘇州）有限公司