本發(fā)明提供了一種受水楊酸和稻瘟病菌的雙誘導(dǎo)的水稻誘導(dǎo)抗病基因osaaa1啟動(dòng)子，同時(shí)還提供了以上啟動(dòng)子的載體構(gòu)建方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

啟動(dòng)子是一個(gè)順式作用dna序列，具有阻遏子及轉(zhuǎn)錄因子等調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，包含了一些重要的順式作用元件，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。啟動(dòng)子按照其作用方式及功能可分為組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子和特殊類型啟動(dòng)子。在某些物理或化學(xué)信號(hào)的刺激下，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以誘導(dǎo)相關(guān)基因特異表達(dá)并且能調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄水平。wisl8基因啟動(dòng)子活性可以被nacl、aba及干旱脅迫誘導(dǎo)增強(qiáng)。對小麥rbcs11基因啟動(dòng)子分析表明干旱、高鹽、脫落酸和黑暗能抑制該啟動(dòng)子的活性，在-1597～-1198bp區(qū)域存在響應(yīng)脫落酸的順式作用元件。

在植物抗病過程中，茉莉酸、水楊酸作為重要的抗病信號(hào)分子起著重要的作用。對orca3基因啟動(dòng)子研究發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子內(nèi)部存在一個(gè)茉莉酸應(yīng)答元件jre，并且該順式作用元件可以與擬南芥的atmyc2轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合從而激活orca3的表達(dá)。擬南芥atpnp-a基因啟動(dòng)子中含有受水楊酸間接調(diào)控的w-box元件，提高水楊酸的濃度可以提高植物的抗逆性。擬南芥霜霉病抗性基因rpp8啟動(dòng)子的w-box元件可能參與應(yīng)答病原菌和水楊酸的誘導(dǎo)反應(yīng)。對大麥β-1，3-葡聚糖酶同功酶基因(giii)啟動(dòng)子(pgiii)研究表明水楊酸和稻瘟病來源的激發(fā)子可以誘導(dǎo)高水平的pgiii活性，該啟動(dòng)子能響應(yīng)水楊酸的誘導(dǎo)。水稻稻瘟病抗性基因pib受水楊酸、茉莉酸和乙烯誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。

本申請的申請人通過前期研究，發(fā)現(xiàn)了一種水稻誘導(dǎo)抗病基因osaaa1，該基因可用于水稻抗稻瘟病和白葉枯病分子育種。目前該研究已經(jīng)申報(bào)國家發(fā)明專利并已獲得授權(quán)，專利號(hào)為：zl201410591365.6。為了進(jìn)一步研究該osaaa1基因的表達(dá)模式，也為進(jìn)一步闡釋該基因的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)，因此需要針對該基因的啟動(dòng)子進(jìn)行以及誘導(dǎo)表達(dá)機(jī)理進(jìn)行研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種水稻誘導(dǎo)抗病基因osaaa1啟動(dòng)子，并成功構(gòu)建了該啟動(dòng)子的雙元表達(dá)載體dx2181g。為后續(xù)的研究osaaa1啟動(dòng)子的表達(dá)模式和osaaa1基因的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明上述目的所采用的技術(shù)方案為：

一種水稻誘導(dǎo)抗病基因osaaa1啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子受水楊酸誘導(dǎo)表達(dá)，該啟動(dòng)子的核苷酸序列如seqidno:1所示，其長度為2893bp。

所述水稻誘導(dǎo)抗病基因osaaa1啟動(dòng)子的雙元表達(dá)載體dx2181g。

所述的雙元表達(dá)載體dx2181g的構(gòu)建方法，包括以下步驟：(1)、針對水稻誘導(dǎo)抗病基因osaaa1啟動(dòng)子設(shè)計(jì)引物，上游引物為aa2psalf，其核苷酸序列如seqidno:2所示，下游引物為aa2psalr1，其核苷酸序列如seqidno:3所示；

(2)、對osaaa1基因啟動(dòng)子進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr反應(yīng)體系為：ddh2o10.025μl，10×extaqbuffer1.5μl，extaq酶0.075μl，2.5mmol/μldntps1.2ul，10mmol/l的正反引物各0.6μl，100ng/μldna模板1μl；pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃3min；95℃變性30s，58.6℃退火30s，72℃延伸60s，34個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min；將檢測正確的pcr產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒回收；

(3)、將回收的pcr產(chǎn)物與dx2181質(zhì)粒進(jìn)行salⅰ酶酶切，反應(yīng)體系為：10×hbuffer5μl，salⅰ2μl，線性質(zhì)粒10μl，ddh2o補(bǔ)足至50μl；將目的片段酶切后進(jìn)行清潔回收，將酶切的dx2181質(zhì)粒進(jìn)行去磷酸化處理后與回收的目的片段進(jìn)行連接，反應(yīng)體系為：目的片段1.5μl，dx2181質(zhì)粒1.5μl，ligationhigh連接酶3μl，16℃連接90min；連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞，涂含50μg/ml的卡那霉素的lb平板，置于培養(yǎng)箱37℃倒置培養(yǎng)16h，挑取單克隆進(jìn)行菌液pcr鑒定，提取質(zhì)粒dna進(jìn)行酶切鑒定，對鑒定到的陽性克隆測序確認(rèn)。

本申請中成功構(gòu)建了該啟動(dòng)子的雙元表達(dá)載體dx2181g，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入水稻品種日本晴，轉(zhuǎn)基因植株陽性鑒定后，進(jìn)行g(shù)fp觀察分析來研究osaaa1啟動(dòng)子的表達(dá)模式和osaaa1基因的調(diào)控機(jī)制。

附圖說明

圖1為osaaa1基因啟動(dòng)子的pcr擴(kuò)增圖；

圖2為osaaa1基因啟動(dòng)子重組載體菌落pcr鑒定圖；

圖3為重組載體質(zhì)粒酶切電泳圖；

圖4為水稻稻瘟病誘導(dǎo)抗性基因osaaa1啟動(dòng)子在水稻葉脈中特異表達(dá)結(jié)果圖；

圖5為osaaa1基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)gfp基因在煙草下表皮保衛(wèi)細(xì)胞特異性表達(dá)圖；

圖6為不同處理方式下熒光強(qiáng)度的對比分析圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做詳細(xì)具體的說明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于以下實(shí)施例。

供試材料

大腸桿菌dh5α由中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供，植物雙元表達(dá)載體dx2181g由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，粳稻(oryzasativassp.japonica)品種日本晴由中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。

實(shí)驗(yàn)試劑

凝膠回收試劑盒、凝膠清潔試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒均購置axygen公司。限制性內(nèi)切酶salⅰ、quickcutbamhⅰ、quickcutspelⅰ、quickcuthindⅲ、extaq酶、kod酶、dna分子量marker均購置takara公司。kod酶和ligationhigh購置toyobo公司。引物合成和測序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

啟動(dòng)子序列分析

利用生物信息學(xué)軟件place分析osaaa1的啟動(dòng)子序列，其大小為2893bp，如seqidno:1所示。

啟動(dòng)子片段的pcr擴(kuò)增

以水稻osaaa1啟動(dòng)子序列為模板，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(見表1，引物1和引物2搭配擴(kuò)增檢測上述啟動(dòng)子片段下劃線為酶切位點(diǎn))，在引物前面加上sal酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，提取水稻葉片dna作為模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增的pcr反應(yīng)體系為：ddh2o10.025μl，10×extaqbuffer1.5μl，extaq酶0.075μl，2.5mmol/μldntps1.2ul，10mmol/l的正反引物各0.6μl，100ng/μldna模板1μl。pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃3min；95℃變性30s，58.6℃退火30s，72℃延伸60s，34個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。將檢測正確的pcr產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒回收。osaaa1基因啟動(dòng)子片段的pcr擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，圖1中m1為dnamarkerdl15000，泳道1為目的片斷。從圖1中可以看出，目的條帶大小與預(yù)期一致，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1本申請所使用的引物列表

啟動(dòng)子載體構(gòu)建

將回收的目的片段以及dx2181質(zhì)粒進(jìn)行salⅰ酶酶切，反應(yīng)體系為：10×hbuffer5μl，salⅰ2μl，線性質(zhì)粒10μl，ddh2o補(bǔ)足至50μl。將目的片段酶切后進(jìn)行清潔回收，將酶切的dx2181質(zhì)粒進(jìn)行去磷酸化處理后與回收的目的片段進(jìn)行連接，反應(yīng)體系為：目的片段1.5μl，dx2181質(zhì)粒1.5μl，ligationhigh連接酶3μl，16℃連接90min。連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞，涂含50μg/ml的卡那霉素的lb平板，置于培養(yǎng)箱37℃倒置培養(yǎng)16h，挑取單克隆進(jìn)行菌液pcr鑒定，鑒定結(jié)果如圖2所示，圖2中m1為dnamarkerdl15000，泳道1，2，3分別為陽性克隆菌落pcr擴(kuò)增。從圖2中可以看出擴(kuò)增得到的目的帶大小為2893bp。啟動(dòng)子片段重組載體3個(gè)單克隆均擴(kuò)出目的帶。

提取質(zhì)粒dna進(jìn)行酶切鑒定，對鑒定到的陽性克隆測序確認(rèn)。將菌落pcr檢測到的陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒dna，用salⅰ酶進(jìn)行酶切檢測，挑取了3個(gè)單克隆質(zhì)粒，結(jié)果如圖3所示，圖3中，m1為dnamarkerdl15000，泳道1，2，3分別為陽性克隆酶切鑒定。圖3中可以看出：以上3個(gè)單克隆質(zhì)粒均切出了載體帶和目的帶，為陽性質(zhì)粒。菌落pcr和質(zhì)粒酶切鑒定為陽性的克隆經(jīng)sanger測序正確后保存，綜合以上結(jié)果表明osaaa1啟動(dòng)子片段載體構(gòu)建成功。

為了研究水稻稻瘟病誘導(dǎo)抗性基因osaaa1啟動(dòng)子的表達(dá)模式，將水稻稻瘟病誘導(dǎo)抗性基因osaaa1啟動(dòng)子全長2893bp片段插入雙元表達(dá)載體dx2181g中，與gfp進(jìn)行融合表達(dá)，將重組載體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化水稻品種為日本晴，待轉(zhuǎn)基因水稻出苗后進(jìn)行移栽，水稻分蘗后，在15葉期左右，取水稻葉片，經(jīng)過水楊酸誘導(dǎo)2h后，并制片在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行熒光觀察。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：

(1)準(zhǔn)備市售的無色指甲油，將其均勻涂在載玻片上，剪取轉(zhuǎn)基因水稻葉片5cm左右，水稻下標(biāo)皮朝上，上表皮朝下粘于載玻片上。

(2)在水稻朝上的下表皮處均勻涂上無色指甲油，用透明膠帶粘貼在水稻表面，靜至2小時(shí)。

(3)待指甲油干后，將透明膠帶快速撕掉，如處理得當(dāng)，水稻下表皮細(xì)胞和部分葉脈會(huì)粘在透明膠帶中。

(4)將透明膠帶貼在新的載玻片上，至激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。

(5)按開機(jī)順序打開激光共聚焦顯微鏡，打開相應(yīng)軟件，將載玻片置于載物臺(tái)上，用10×干鏡頭觀察，調(diào)節(jié)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋，是視物清晰，換成40×干鏡頭觀察，找到目標(biāo)視野后進(jìn)行拍攝。

(6)打開ec-z1軟件，開488nm激光，將光圈選為”m”，調(diào)節(jié)激光強(qiáng)度和增益值，進(jìn)行拍攝保存。

圖4結(jié)果顯示在488nm激光條件下，水稻稻瘟病誘導(dǎo)抗性基因osaaa1啟動(dòng)子在葉脈中特異表達(dá)。gfp表示在488nm激光條件下觀察的綠色熒光，bright表示白光下觀察的結(jié)果，merge表示前述二者疊加顯示的結(jié)果。

為了進(jìn)一步的驗(yàn)證本發(fā)明所提供的osaaa1基因啟動(dòng)子的誘導(dǎo)表達(dá)效果，本發(fā)明還將載體轉(zhuǎn)化入煙草中，操作步驟與上述步驟相近似。并且在本實(shí)施例中設(shè)置了h20處理2h的對照組。圖5為osaaa1基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)gfp基因在煙草下表皮保衛(wèi)細(xì)胞特異性表達(dá)圖，從圖5中可以看出，與對照組相比，r3-62轉(zhuǎn)基因煙草在水楊酸處理2h后熒光強(qiáng)度明顯上升。圖6為水楊酸處理組與對照組的熒光強(qiáng)度對比圖，從圖6中可以看出，水楊酸處理2h后，r3-63轉(zhuǎn)基因煙草下表皮氣孔處的保衛(wèi)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度增加了7.35倍。

<110>：中南民族大學(xué)

<120>：一種水稻誘導(dǎo)抗病基因osaaa1啟動(dòng)子及其載體與構(gòu)建方法

<160>：3

<210>：1

<211>：2893

<212>：dna

<213>：水稻

<400>：1

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<210>：2

<211>：35

<212>：dna

<213>：人工合成

<400>：2

gcggtcgacttgtctcaaaaccaaattaatttccc35

<210>：3

<211>：29

<212>：dna

<213>：人工合成

<400>：3

caggtcgacctgctcgtcagtctaccctt29