本發(fā)明屬于生物細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)所用的保護(hù)劑，一種常溫生物體液核酸穩(wěn)定及組織保護(hù)劑。
背景技術(shù)：
：：核酸(nucleicacid)是存在于生物細(xì)胞的遺傳信息載體，包括脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid，dna)和以dna鏈為模板轉(zhuǎn)錄而形成的核糖核酸(ribonucleicacid，rna)。核酸檢測(cè)越來(lái)越成為現(xiàn)代個(gè)體化醫(yī)學(xué)(personalizedmedicine)和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)(precisionmedicine)的基礎(chǔ)。高質(zhì)量的核酸精準(zhǔn)檢測(cè)顯著依賴(lài)于待檢樣本中核酸的質(zhì)量。尤其是rna酶的廣泛存在與難以滅活，待測(cè)樣本一旦從生物體中分離后，細(xì)胞內(nèi)的rna非常容易被降解，rna的提取純化和后續(xù)檢測(cè)工作變得非常困難。所以如何保證生物樣本取樣前后基因的遺傳信息保持不變，就變得非常重要。傳統(tǒng)方法是超低溫冷凍保存。目前發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)外類(lèi)似產(chǎn)品兩種，比如：美國(guó)thermo-fisher公司的穩(wěn)定劑(tempustmbloodrnatubes,https://www.thermofisher.com/us/en/home/brands/product-brand/rnalater.html)就是立即溶解細(xì)胞，其中的保護(hù)劑起到穩(wěn)定rna的作用。所以這種穩(wěn)定劑必須依賴(lài)低溫保存。生物樣本低溫保存的缺陷是：諸如運(yùn)輸和操作不便、能源消耗大、空間利用率低等。目前生物樣本中的核酸保存樣本的常溫保存技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，是本領(lǐng)域競(jìng)相研究的課題。中國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)的常溫下的生物保護(hù)劑，申請(qǐng)人：上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，申請(qǐng)?zhí)枺?01510290482.3申請(qǐng)日：2015-05-29，一種唾液保護(hù)劑，每1000ml所述唾液保護(hù)劑中含有：三羥甲基氨基甲烷10～50mmol；乙二胺四乙酸和/或乙二胺四乙酸鈉0.5～20mmol；硫酸銨200～1000mmol；葡萄糖1～50mmol。用量：該唾液保護(hù)劑與唾液樣品1：1。將唾液保存到本唾液保護(hù)劑中，室溫下前60天dna幾乎沒(méi)有變化，仍然完整，沒(méi)有明顯的降解；6個(gè)月后仍然如此，12個(gè)月后，dna完整性依然如故。該唾液保護(hù)劑極為有效的保存了唾液樣品，保證了樣品的完整性和長(zhǎng)期的穩(wěn)定性。然而，該生物保護(hù)劑只限于保存唾液，用途單一。目前銷(xiāo)售的采血管，國(guó)產(chǎn)的或者美國(guó)streck公司bcttube無(wú)創(chuàng)管，是用于血液樣品采樣、同時(shí)可以在常溫下保存cell-freedna和rna(cfdna/rna)并實(shí)現(xiàn)常溫下運(yùn)輸?shù)囊环N采血管。其試管內(nèi)含有特殊化學(xué)配方的溶液可以支持常溫下最多達(dá)14天的保存和運(yùn)輸。所述保護(hù)劑或穩(wěn)定劑都無(wú)法滿(mǎn)足更長(zhǎng)時(shí)間保存期的要求。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種生物體液及組織保護(hù)劑，能夠在常溫下保存的核酸穩(wěn)定劑，穩(wěn)定生物體液及組織樣本的dna，rna,蛋白質(zhì)，保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，降低了儲(chǔ)藏、運(yùn)輸和使用的成本。本發(fā)明的這種生物體液及組織保護(hù)劑，呈液態(tài)狀，保存容器為采集管streckbcttube，總?cè)莘e為15ml，其特征為：理化性狀是無(wú)味、紅色透明液體，常溫15～25℃下無(wú)結(jié)晶、無(wú)沉淀物，保存的生物體液及組織樣品在室溫下有效期為半年至一年；所述生物保護(hù)劑的組份，按重量百分比計(jì)：依地酸edta8-12％，金精三羧酸aurintricarboxylicacid1-2％，聚乙氧基乙醇igepalca-6300.2-0.5％，甘油醛l-(-)glyceraldehyde4-8％，氟化鈉sodiumfluoride0.5-1.5％，葡萄糖0.5～2％，其余重量為純凈水。本發(fā)明生物體液及組織保護(hù)劑的使用方法：保護(hù)劑用量比例：該保護(hù)劑與生物體液體樣品的使用按體積百分比計(jì)：本發(fā)明生物穩(wěn)定劑先裝入采集管中，按體積百分比2％-4％。血液、尿液、唾液、汗液、腹水、胸水、關(guān)節(jié)液、腦脊液、皮下組織液及病理狀況下胸腹水或膿液，均分別加保護(hù)劑2％-4％；特別的，對(duì)于眼前房的房水，其總量雖少，仍按同樣的比例使用，譬如，房水100微升加入2微升。本發(fā)明顯著優(yōu)越性在于：這種生物穩(wěn)定劑能夠在常溫下長(zhǎng)期穩(wěn)定生物體液及組織樣本的dna，rna,蛋白質(zhì)，以及細(xì)胞膜的完整性，可以廣泛用于保存人類(lèi)和動(dòng)物生物體液樣本中的cfdna和cfrna。體液包括血液、尿液、唾液、汗液、腹水、胸水、關(guān)節(jié)液、腦脊液、皮下組織液或眼前房的房水，及病理狀況下胸腹水、膿液，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)卣f(shuō)是保護(hù)液體及組織(固體)中的細(xì)胞及其中的核酸和蛋白質(zhì)不被破壞降解。一般而言，保護(hù)液體中的細(xì)胞及生物大分子比較容易，但保護(hù)組織中的細(xì)胞及生物大分子比較困難，主要是保護(hù)劑中的活性成分要能穿透固體介質(zhì)，才能有效保護(hù)其中的生物大分子。與現(xiàn)有同類(lèi)的技術(shù)產(chǎn)品streck管比較：一是顯而易見(jiàn)的配方不同；二是保存時(shí)間長(zhǎng)短：streck是2周，本發(fā)明保存時(shí)間半年至一年；三是適用范圍，streck聲稱(chēng)是保護(hù)血液，本發(fā)明產(chǎn)品適用于所有生物體液及組織；四是用量，上述
背景技術(shù)：
：中介紹的唾液保護(hù)劑，用量是保護(hù)劑與保存樣品的比例是1：1，而本發(fā)明保護(hù)劑只用體積比2～4％。裝有本發(fā)明穩(wěn)定劑的試管支持更長(zhǎng)時(shí)間在常溫下的保存和運(yùn)輸并且，最重要的是支持cfrna的保存。1.創(chuàng)新點(diǎn)本發(fā)明的保護(hù)劑能夠穩(wěn)定人類(lèi)和動(dòng)物所有生物體液中的cfdna和cfrna。本發(fā)明的試管可以應(yīng)用于血液、體液及組織的保存，并且支持更長(zhǎng)時(shí)間在常溫下的保存和運(yùn)輸。2.原理本發(fā)明是通過(guò)維持細(xì)胞形態(tài)，不讓細(xì)胞裂解，保證細(xì)胞的完整性，抑制體液中的核酸酶的釋放來(lái)達(dá)到保存cfrna的目的。如果細(xì)胞裂解就會(huì)釋放細(xì)胞內(nèi)的核糖核酸rna，顯然會(huì)影響后續(xù)的檢測(cè)，導(dǎo)致錯(cuò)誤的信息。該保護(hù)劑主要保護(hù)細(xì)胞外核酸(cellfree-dna和cf-rna)，所以至關(guān)重要的就是穩(wěn)定血液中的細(xì)胞不讓它破裂，這樣就不會(huì)有基因組(genomic)dna(gdna)從血細(xì)胞中釋放出來(lái)污染cfdna和cfrna。這個(gè)很重要,因?yàn)閏fdna和cfrna本身量就少,如果混入gdna就測(cè)不出來(lái)原來(lái)的信息。本保護(hù)劑同時(shí)會(huì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),抑制細(xì)胞內(nèi)核酸酶和蛋白酶的活性。本發(fā)明保護(hù)劑產(chǎn)品的機(jī)理和保護(hù)細(xì)胞外核酸的效率比現(xiàn)有的同類(lèi)產(chǎn)品要高出很多。總之，本發(fā)明保護(hù)劑與市面類(lèi)似產(chǎn)品最大的不同之處:可以穩(wěn)定cfrna,并且常溫保持期能夠長(zhǎng)達(dá)一年.而thermo-fisher公司(tempustmbloodrnatubes)，qiagen公司(paxgene○rbloodccfdnatube)以及bd公司穩(wěn)定劑(rnalater,whitetop)則仍然需低溫保存。附圖說(shuō)明圖1為本保護(hù)劑處理后的測(cè)試管與streck標(biāo)準(zhǔn)管靶位點(diǎn)讀數(shù)的柱標(biāo)顯示；圖2為圖1柱標(biāo)數(shù)值基礎(chǔ)的dna目標(biāo)位點(diǎn)讀數(shù)值；圖3為經(jīng)本發(fā)明生物保護(hù)劑處理后抵御核酸酶降解的實(shí)驗(yàn)效果；圖4為新鮮組織經(jīng)本保護(hù)劑處理后低溫儲(chǔ)存核酸的完整性驗(yàn)證。具體實(shí)施方式本發(fā)明所述生物保護(hù)劑，按所述組份及重量百分比稱(chēng)重，混合、加純凈水?dāng)嚢铻樗芤海浜眉纯墒褂?。保存該生物保護(hù)劑產(chǎn)品條件：保存容器為采集管streckbcttube及相同標(biāo)準(zhǔn)市售無(wú)創(chuàng)管，總?cè)莘e為15ml，將本發(fā)明生物體液及組織保護(hù)劑無(wú)菌封裝入采集管，占體積百分比計(jì)2％-4％，并在管外壁標(biāo)示出該保護(hù)劑比例。還可以按細(xì)分比例裝入采集管，用于房水或其它少量樣品的保存。采集管儲(chǔ)存于避光、室溫內(nèi)即可。生物保護(hù)劑適用范圍：本發(fā)明生物保護(hù)劑能夠保護(hù)生物體液及組織中的核酸。所述生物樣品包括人和動(dòng)物體液，包括生物體內(nèi)所有液態(tài)成分，包括血液、尿液、唾液、汗液、腹水、胸水、關(guān)節(jié)液、腦脊液或皮下組織液及病理狀況下胸腹水或膿液等。本生物保護(hù)劑適用保存新鮮生物組織，除蠟狀組織和骨組織外，它可能無(wú)法有效地滲透。本發(fā)明生物體液及組織保護(hù)劑的使用方法，本保護(hù)劑用量體積比例對(duì)所有體液保存都適用，該保護(hù)劑與生物體液按體積百分比計(jì)：體液5-10ml：2％-4％保護(hù)劑；無(wú)論什么體液加入后應(yīng)在采集管上刻線(xiàn)以下為準(zhǔn)，都不能超過(guò)采集管上面的總量刻線(xiàn)。用法用量的實(shí)施例所用單位：1ml,毫升＝1，000μl,微升例1：按照用量比例：5-10ml血液加保護(hù)劑體積百分比計(jì)2％～4％；選擇本保護(hù)劑采集管外壁上標(biāo)示已存在保護(hù)劑200μl的容器，把8ml的全血與200μl的生物保護(hù)劑混合即可，1：2.5％，無(wú)需血漿分離。例2：5-10ml尿液加保護(hù)劑體積百分比計(jì)2.2％-3～4％，換算后220～300-400μl，選擇本保護(hù)劑采集管外壁上標(biāo)示已存在保護(hù)劑220～300-400μl的容器，把5-10ml尿液加入該容器內(nèi)混合即可。例3：5-10ml組織液加200μl保護(hù)劑。例4：眼前房的房水總量少，每100μl房水加2μl保護(hù)液。例5：在把新鮮組織置于1∶10稀釋的生物保護(hù)劑溶液浸泡之前，把大塊組織樣本切碎至任何單一維度≤0.5厘米，將新鮮組織置于5-10倍體積的本生物保護(hù)劑稀釋劑中，或靈活調(diào)整，只要保證浸泡即可，在-20℃或以下的溫度,組織可以無(wú)限期儲(chǔ)存在本生物保護(hù)劑稀釋溶液中，見(jiàn)圖4。例6：例5所述，對(duì)-20℃或以下的溫度下無(wú)限期儲(chǔ)存的新鮮組織樣品，不包括體液，浸泡后不要立即凍結(jié)，應(yīng)儲(chǔ)存于4℃下10～12小時(shí)過(guò)夜，以使該溶液徹底穿透組織，之后除去上清液，然后移動(dòng)至-20℃或-80℃下長(zhǎng)期貯存。生物保護(hù)劑溶液不會(huì)破壞組織的結(jié)構(gòu)，因此，已在生物保護(hù)劑溶液中平衡過(guò)的組織可以從溶液中取出，切成小片，并且重新放回生物保護(hù)劑溶液中。如果想保存小器官的完整性，如小鼠肝，腎和脾可以整體存儲(chǔ)在生物保護(hù)劑溶液中。生產(chǎn)條件：所述制備本發(fā)明保護(hù)劑的組分物質(zhì)均為市場(chǎng)銷(xiāo)售商品，有具備生物制品作業(yè)條件的環(huán)境和設(shè)施，按所述組份及重量百分比稱(chēng)重，混合、加純凈水?dāng)嚢铻樗芤?，?jīng)無(wú)菌處理后分裝保存。實(shí)驗(yàn)室必須具備生物分析的標(biāo)準(zhǔn)條件，用上述檢測(cè)方法，并將每批次產(chǎn)品處理血液樣本后提取的內(nèi)參照基因actinrna的豐度值標(biāo)示在產(chǎn)品合格簽上。產(chǎn)品銷(xiāo)售后買(mǎi)家驗(yàn)貨，目視溶液應(yīng)該沒(méi)有任何渾濁或沉淀。本產(chǎn)品檢驗(yàn)方法：檢驗(yàn)方法有多種方式，每一個(gè)實(shí)驗(yàn)都以市售同類(lèi)商品為參照組。將每批次產(chǎn)品處理血液樣本后提取的內(nèi)參照基因actinrna的豐度值，采用pcr的方法檢測(cè)后，對(duì)比參照組，有明顯的顯著性差異，即斷定其合格性；ngs法：從靶位點(diǎn)讀數(shù)的顯著性差異，如圖2所示；提取的rna變形膠與參照組比較觀(guān)察有無(wú)降解，以rna完整性斷定其合格性，只要所檢驗(yàn)抽樣提取的內(nèi)參照基因actinrna豐度值比參照組有明顯的顯著性差異，就可以斷定其合格性。各種檢驗(yàn)均將每批次產(chǎn)品提取的rna豐度值標(biāo)示在產(chǎn)品合格簽上。所述質(zhì)檢方式主要是功能檢測(cè)，用pcr方法直接檢測(cè)血液中有沒(méi)有g(shù)dna污染。生產(chǎn)廠(chǎng)家質(zhì)檢可以用下面的方法：同一批次產(chǎn)品抽檢3個(gè)試管，從三個(gè)健康捐獻(xiàn)者采集血液樣本。每個(gè)樣本采集一份立刻離心收集上清，另一管放入烘箱，以下面的一個(gè)溫度組合進(jìn)行循環(huán)5天:5個(gè)小時(shí)35℃，5個(gè)小時(shí)30℃，14個(gè)小時(shí)25℃。然后用pcr的方法比較actin基因的豐度值。剛剛采集的血樣和放入烘箱中經(jīng)歷5天的血樣的actin的豐度值應(yīng)該不相差2個(gè)ct。檢驗(yàn)例一：pcr法：以所提取的rna豐度值以及rna變形膠的完整性觀(guān)察：將采集的血液樣本混合，作為分析樣品，將8ml樣品和用法例1制備的穩(wěn)定劑200微升混合，貼標(biāo)簽，把收集管置于40℃一周的時(shí)間，提取樣本中的cf-dna/rna，ngs測(cè)定管中未被降解的組分，生產(chǎn)方質(zhì)檢合格指標(biāo)在產(chǎn)品包裝上注明。本發(fā)明生物保護(hù)劑的效果，從圖2靶位點(diǎn)讀數(shù)或圖1中柱標(biāo)都能夠看出本保護(hù)劑處理后的測(cè)試管中，能夠直觀(guān)看出本發(fā)明保護(hù)劑比較明顯差異，高出對(duì)照的streck標(biāo)準(zhǔn)管靶位點(diǎn)讀數(shù)的讀數(shù)。懷孕婦女的血液樣本經(jīng)收集后，置于本保護(hù)劑采血管和streck試管中，三種樣本用于實(shí)際的分析。操作如下：把收集管置于40℃一周的時(shí)間。cf-dna/rna經(jīng)提取后馬上進(jìn)行ngs分析，測(cè)定管中未被降解的殘留組分(靶位點(diǎn)讀數(shù))。如圖1、圖2中所示，本發(fā)明測(cè)試管黑柱的讀數(shù)(平均值為5，174，709)顯著高于標(biāo)準(zhǔn)管斜紋柱中的(平均值為1，504，214)。清楚地顯示本發(fā)明生物保護(hù)劑處理之后的左邊管中與streck管比較具有明顯的讀數(shù)差異。檢驗(yàn)例二抵御核酸酶的降解實(shí)驗(yàn)取5ml核糖核酸酶a，經(jīng)系列的稀釋?zhuān)菇K濃度達(dá)到(4.5×10-5–4.5×10-11單位/微升)，分別加入到兩只裝有自備的5毫克rna(水溶液)試管中，總體積為15ml，圖3中上方，一只含本發(fā)明生物保護(hù)劑biostabler，另一只含te緩沖液為對(duì)照，圖3中下方。在37℃孵育20分鐘,用qiagen試劑盒純化總的rna，然后用1％瓊脂膠分析rna的完整性。圖3表明加了本發(fā)明生物保護(hù)劑處理之后，可以有效地抵御核酸酶的降解，效果顯著得相差1000倍。檢驗(yàn)例三新鮮組織的保存實(shí)驗(yàn)：1.新鮮的大鼠的肺部組織經(jīng)分離后，立即切成0.5cm的小塊，置入1∶10稀釋的生物保護(hù)劑中；2.分別儲(chǔ)存于不同儲(chǔ)存溫度下的保護(hù)效果：新鮮的大鼠的肺部組織經(jīng)分離，立即存儲(chǔ)于本發(fā)明保護(hù)劑稀釋液中，并且置于不同的溫度下。三種條件：37℃24小時(shí)、室溫一周、4℃一個(gè)月。用qiagen試劑盒分離純化總的rna后，用1％瓊脂變性膠分析rna的完整性。見(jiàn)圖4，新鮮組織經(jīng)本發(fā)明生物保護(hù)劑處理之后，證明非常穩(wěn)定地儲(chǔ)存于低溫下非常穩(wěn)定地保持了核酸的完整性，可持續(xù)一個(gè)月。注：中文名te緩沖液外文名tris-edtabuffersolution，結(jié)構(gòu)由tris和edta配制而成，用于溶解dna，能穩(wěn)定儲(chǔ)存dna。streck堪稱(chēng)業(yè)內(nèi)金標(biāo)準(zhǔn)。主要參考文獻(xiàn)1.saumeta,lecellierch.micrornasandpersonalizedmedicine:evaluatingtheirpotentialascancerbiomarkers.advexpmedbiol.2015；888:5-15.2.roychowdhurys,chinnaiyanam.translatingcancergenomesandtranscriptomesforprecisiononcology.cacancerjclin.2016；66(1):75-88.3.https://www.thermofisher.com/us/en/home/brands/product-brand/rnalater.html4.http://oncologysolutions.qiagen.com/2016/08/05/qiagen-launches-novel-integrated-system-for-collection-stabilization-transport-storage-and-isolation-of-circulating-cell-free-dna/http://www.bd.com/vacutainer/pdfs/plus_plastic_tubes_wallchart_tubeguide_vs5229.pdf當(dāng)前第1頁(yè)12當(dāng)前第1頁(yè)12