本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種植物花粉特異表達的啟動子p-ppp1及其應用。

背景技術：

啟動子是位于結構基因5’上游區(qū)直接與轉錄因子及rna聚合酶結合的dna序列，決定基因表達的起始時間、表達部位以及表達程度。根據(jù)啟動子驅動基因表達的模式可將啟動子分為三類：組成型啟動子，組織特異性啟動子和誘導型啟動子。組成型啟動子能夠使基因在幾乎所有的組織中都啟動表達；在組織特異性啟動子調控下的基因一般只在某些特定組織中表達；誘導型啟動子只有在誘導因子的作用下才具有起始轉錄的活性。在轉基因操作過程中，可以根據(jù)不同的需要選擇不同類型的啟動子驅動基因的表達。

因為組織特異性啟動子只在某些特定的組織器官中表達，所以可以通過其實現(xiàn)在植物體內對外源基因表達進行定時定量的精確調控。

花粉作為植物的雄配子，在植物完成世代交替中起著十分重要的作用，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中花粉是否正常發(fā)育直接影響到農(nóng)作物的產(chǎn)量，另外對花粉發(fā)育過程的研究有助于了解細胞分化發(fā)育的機制。在對花粉進行分子生物學的研究過程中，可以通過花粉特異啟動子驅動的基因過表達或是基因沉默，有針對性的研究基因在花粉發(fā)育過程中的作用。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的是提供一種dna片段。

本發(fā)明提供的dna片段為如下1)-3)中任一所述的dna分子：

1)序列表的序列1所示的dna分子；

2)在嚴格條件下與1)所述dna序列雜交且具有啟動子功能的dna分子；

3)與1)中所述dna序列具有90％以上同源性，且具有啟動子功能的dna分子。

本發(fā)明的第二個目的是提供與上述dna片段相關的生物材料。

本發(fā)明提供的與上述dna片段相關的生物材料為下述a1)至a11)中的任一種：

a1)含有上述dna分子的表達盒；

a2)含有上述dna分子的重組載體；

a3)含有a1)所述表達盒的重組載體；

a4)含有上述dna分子的重組微生物；

a5)含有a1)所述表達盒的重組微生物；

a6)含有a2)所述重組載體的重組微生物；

a7)含有a3)所述重組載體的重組微生物；

a8)含有上述dna分子的轉基因植物細胞系；

a9)含有a1)所述表達盒的轉基因植物細胞系；

a10)含有a2)所述重組載體的轉基因植物細胞系；

a11)含有a3)所述重組載體的轉基因植物細胞系。

本發(fā)明的第三個目的是提供擴增上述dna片段的引物對。

本發(fā)明提供的擴增上述dna片段的引物對中的一條引物的序列為序列2，另一條引物的序列為序列3。

本發(fā)明的第四個目的是提供上述dna片段的新用途。

本發(fā)明提供了上述dna片段在使目的基因在植物組織中的表達中的應用。

上述應用中，所述植物組織為植物生殖器官。

上述應用中，所述植物生殖器官為花粉，所述花粉為成熟花粉和/或萌發(fā)花粉。

上述應用中，所述基因為gus基因。

本發(fā)明還提供了上述dna片段在植物的遺傳育種中的應用。

上述應用中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述雙子葉植物具體為擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)。

本發(fā)明從擬南芥中克隆得到花粉特異表達的啟動子p-ppp1，構建了p-ppp1驅動的gus基因轉基因植物，并且通過rt-qpcr檢測其表達模式。通過實驗證明：p-ppp1可以驅動gus在花粉中特異性高表達，且rt-qpcr檢測其在花粉中有高的表達量，在其他組織中基本無表達，說明p-ppp1是一個花粉特異性的啟動子。因此在研究特定基因在花粉發(fā)育過程中的功能時，可以通過p-ppp1驅動其在花粉中特異性表達或沉默，進而研究該基因在花粉發(fā)育中的具體作用。

附圖說明

圖1為ppp1表達模式。

圖2為gus染色結果。圖2a:雙核期花粉；圖2b:成熟花粉；圖2c:萌發(fā)花粉；圖2d:花)。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中的pbi101載體是clontech公司的產(chǎn)品。

實施例1、ppp1啟動子的獲得

一、rt-qpcr檢測ppp1的表達特異性

通過rt-qpcr檢測ppp1在野生型擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)的不同組織部位(種子、根、莖、蓮座葉、莖生葉、花芽、花、雌蕊、雄蕊、角果)的表達情況。具體步驟如下：

分別提取野生型擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)的種子、根、莖、蓮座葉、莖生葉、花芽、花、雌蕊、雄蕊、角果的rna，反轉錄成cdna。以獲得的cdna為模板，采用agatgggaaccgaaattatcagg和aaactttagccggagaagtctcc進行rt-qpcr，檢測不同組織部位的ppp1的表達情況。

ppp1在擬南芥的不同組織部位(種子、根、莖、蓮座葉、莖生葉、花芽、花、雌蕊、雄蕊、角果)的表達情況如圖1所示：從圖中可以看出，ppp1在雄蕊中表達量最高，其他組織部位中表達量非常低?？梢姡琾pp1具有花藥中特異表達的性質。

二、啟動子的獲得

以野生型擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)的基因組dna為模板，采用引物：5’-aagcttggtcctttgcaattcacaagg-3’(序列2)和5’-ggatccaggcctgataatttcggttcc-3’(序列3)進行pcr擴增，得到pcr擴增產(chǎn)物，即為ppp1啟動子。

對pcr擴增產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化pcr擴增產(chǎn)物。并對其進行測序。

測序結果表明：pcr擴增得到大小為2194bp的ppp1的啟動子區(qū)域，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，將序列1所示的基因命名為p-ppp1。

實施例2、轉p-ppp1擬南芥的獲得及其gus染色分析

一、轉p-ppp1啟動子擬南芥的獲得

1、重組載體pbi101-ppp1:gus的構建

(1)p-ppp1的獲得

以野生型擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)的基因組dna為模板，采用引物：5’–aagcttggtcctttgcaattcacaagg-3’(序列2)和5’–ggatccaggcctgataatttcggttcc-3’(序列3)進行pcr擴增，得到pcr擴增產(chǎn)物，即為p-ppp1。

(2)回收步驟(1)獲得的pcr擴增產(chǎn)物，連接至peasy-blunt(transgene)，得到含有p-ppp1的peasy-blunt載體。

(3)用hindⅲ和bamhⅰ雙酶切含有p-ppp1的peasy-blunt載體，回收p-ppp1，用hindⅲ和bamhⅰ雙酶切pbi101-gus載體，回收載體大片段，連接，得到重組載 體pbi101-ppp1:gus。

對重組載體pbi101-ppp1:gus進行測序驗證，結果表明：重組載體pbi101-ppp1:gus為將序列表中序列1所示的p-ppp1替換pbi101-gus載體的hindⅲ和bamhⅰ的酶切位點間的dna片段，且保持pbi101-gus載體的其他序列不變得到的載體。

2、重組菌的獲得

將重組載體pbi101-ppp1:gus通過電擊轉化法，轉入農(nóng)桿菌gv3101，得到重組菌pbi101-ppp1:gus/gv3101。

將pbi101-gus載體轉入農(nóng)桿菌gv3101，得到重組菌pbi101-gus/gv3101。

3、轉基因植株的獲得

采用浸花法分別將步驟2獲得的重組菌pbi101-ppp1:gus/gv3101和重組菌pbi101-gus/gv3101轉化擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)，并在含有25mg/l卡那霉素的ms培養(yǎng)基上篩選，分別得到轉p-ppp1擬南芥和轉空載體擬南芥。

二、轉p-ppp1擬南芥的gus染色分析

1、gus染色

對步驟一獲得的轉p-ppp1擬南芥植株和轉空載體擬南芥植株的雙核期花粉、成熟花粉、萌發(fā)花粉和花進行gus染色。具體步驟如下：分別將新鮮的轉p-ppp1擬南芥植株和轉空載體擬南芥植株的雙核期花粉、成熟花粉、萌發(fā)花粉和花置于離心管中，然后加入x-gluc染色液，抽真空15min，置于37℃過夜染色，分別得到染色后的材料，并將染色后將材料分別依次置于70％，80％，90％的乙醇溶液中進行梯度脫色。

2、染色結果

染色結果如圖2所示：通過gus染色發(fā)現(xiàn)，gus在花藥中有很強的表達，柱頭上也有微弱的表達；就單個花粉而言，早期僅在花粉壁中有較弱的表達(圖2a)，而整個成熟花粉中表達加強(圖2b)，并且一直持續(xù)到花粉萌發(fā)(圖2c)，而在花粉發(fā)育早期沒有啟動表達，轉空載體擬南芥植株的gus基因在任何時期均無表達。

以上結果均表明，p-ppp1(ppp1啟動子)可以驅動目的基因如gus報告基因在植物花粉中特異表達。