本發(fā)明涉及煙用添加劑領(lǐng)域，具體涉及利用固定化酵母菌制備煙用玫瑰花提取物的制備方法。

背景技術(shù)：

加香加料是卷煙工藝中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是完善產(chǎn)品風(fēng)格的決定因素和提高卷煙香氣質(zhì)量的有效手段之一。目前煙用香精香料主要還是通過(guò)對(duì)天然動(dòng)植物的提取、化學(xué)合成制備。由于受到天然植物資源有限以及化學(xué)合成條件較苛刻限制。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，近年來(lái)，利用微生物發(fā)酵法制備煙用香原料，為煙用香原料的生產(chǎn)提供一條經(jīng)濟(jì)、高效的途徑，開(kāi)發(fā)一些傳統(tǒng)方法無(wú)法生產(chǎn)的新型煙用香原料。

微生物固定化技術(shù)，是將特選的微生物固定在選證的載體上，使其高度密集并保持生物活性，在適應(yīng)條件下能夠快速、大量增殖的生物技術(shù)，能夠彌補(bǔ)懸浮微生物發(fā)酵處理效率低、固液分離困難、抗毒性差等缺點(diǎn)。因此，近年來(lái)，微生物固定化技術(shù)的研究非常活躍，發(fā)展較快，已應(yīng)用到許多工業(yè)部門如食品發(fā)酵工業(yè)，環(huán)境保護(hù)，新能源開(kāi)發(fā)以及生物傳感器等，并取得了深入發(fā)展，顯示出了強(qiáng)大的優(yōu)越性。主要涉及到以下幾個(gè)方面：在食品發(fā)酵工業(yè)中用于生產(chǎn)乙醇、啤酒、酸奶等；在環(huán)境保護(hù)中用于環(huán)境監(jiān)測(cè)和工業(yè)廢水的處理；在新能源開(kāi)發(fā)中用于生產(chǎn)氫氣、甲烷、生化電池、微生物電池等；固定化微生物還可作為分子識(shí)別元件，用于制作各種生物傳感器。而隨著固定微生物技術(shù)的不斷成熟、完善，逐漸向高效低能耗、低成本、簡(jiǎn)單化、安全自動(dòng)化、無(wú)污染等方向發(fā)展，在能源危機(jī)、資源短缺、環(huán)境污染日趨嚴(yán)重的情況下，由此將推動(dòng)其在廢水處理方面更加深入和廣泛的應(yīng)用，具有更加深遠(yuǎn)的意義。尤其在廢水處理方面，具有很大的應(yīng)用前景。但在利用微生物固定化技術(shù)制備煙用玫瑰花提取物卻未見(jiàn)報(bào)道。

玫瑰原產(chǎn)地中國(guó)，屬薔薇目，薔薇科落葉灌木。玫瑰作為農(nóng)作物時(shí)，其花朵主要用于食品及提煉香精玫瑰油，玫瑰油應(yīng)用于化妝品、食品、精細(xì)化工等工業(yè)。以玫瑰為原料的香料玫瑰提取物、玫瑰浸膏、玫瑰精油和玫瑰凈油是卷煙中常用的煙用添加劑，在卷煙中具有豐富煙香，增加清甜和花香香韻，透發(fā)香氣等作用。

酵母菌是一些單細(xì)胞真菌，是子囊菌、擔(dān)子菌等幾科單細(xì)胞真菌的通稱，一般泛指能發(fā)酵糖類的真菌，可用于釀造生產(chǎn)，該菌在發(fā)酵過(guò)程中能產(chǎn)生乙酸乙酯、苯乙醇等香氣物質(zhì)，這些香氣物質(zhì)能夠賦予卷煙特征的甜香香氣，是一種生產(chǎn)煙用香料的優(yōu)質(zhì)產(chǎn)香菌。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種固定化酵母菌制備煙用玫瑰花提取物的方法，結(jié)合微生物固定化發(fā)酵、冷凍干燥和分子蒸餾等技術(shù)，開(kāi)發(fā)了一種新型煙用玫瑰花提取物。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案：所述一種固定化酵母菌制備煙用玫瑰花提取物的方法，其特征在于具體包括以下步驟：

(1)取玫瑰花，加入其重量3～8倍的水，在50～65℃下微波提取2～3次，每次提取時(shí)間為2～3小時(shí)，提取完后冷卻至室溫，并過(guò)濾得到提取液，合并多次提取液，得到玫瑰花提取物a；

(2)將酵母菌接種到肉湯培養(yǎng)基中，在溫度37℃、攪拌轉(zhuǎn)速為50rpm的條件下培養(yǎng)48小時(shí)，取培養(yǎng)液于8000rpm下離心，離心后的濕菌體備用；

(3)酵母菌的聚乙烯醇—海藻酸鈉固定化：采用聚乙烯醇水溶液與海藻酸鈉水溶液配制含質(zhì)量百分比6％～10％的聚乙烯醇和質(zhì)量百分比1％～3％的海藻酸鈉的混合溶液，然后向混合溶液中加入總?cè)芤后w積的1～3％的步驟(2)中制備的酵母菌濕菌體，配制成混合液，用蠕動(dòng)泵經(jīng)過(guò)1～5mm孔徑的針頭將配制好的混合液逐滴加入到cacl2的質(zhì)量百分比為1～3％的硼酸飽和溶液中，交聯(lián)1h，然后在飽和na2so4溶液中交聯(lián)3-5h，得pva-sa固定化酵母菌小球，然后采用無(wú)菌水沖洗，烘干備用；

(4)將步驟(1)中制備的玫瑰花提取物a與步驟(3)中制備的固定化酵母菌小球按照質(zhì)量比5～10:1混合，在溫度為20～25℃，攪拌轉(zhuǎn)速為1～5rpm的條件下發(fā)酵2～4d，然后置于4℃冷柜中保存7～14d；

(5)將步驟(4)發(fā)酵后發(fā)酵液過(guò)濾，得澄清發(fā)酵液，發(fā)酵液進(jìn)行冷凍干燥，料液厚度為1～2厘米，真空度為10pa，干燥時(shí)間為6～12h；

(6)取步驟(5)冷凍干燥后的發(fā)酵液，加入其質(zhì)量2～4倍的質(zhì)量濃度80～95％酒精溶液，沉淀24～48小時(shí)，過(guò)濾取上清液在壓力為0.1mpa，溫度為45℃的條件下濃縮至相對(duì)密度為1.25～1.35，然后在濃縮物中加入丙二醇，得玫瑰花提取物b，所述丙二醇的加入量為總質(zhì)量的20％；

(7)將步驟(6)的玫瑰花提取物b，在壓力1～10pa，進(jìn)料溫度為55℃～70℃，進(jìn)料速度為20～50ml/min，刮板轉(zhuǎn)速為80～150rpm的條件下進(jìn)行分子蒸餾，取輕組分為玫瑰花提取物。

本發(fā)明中采用的酵母菌為釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)hhl-1，于2009年11月17日保藏于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctccno:m209272。

本發(fā)明采用的微生物固定化技術(shù)具有發(fā)酵處理效率高、固液分離容易、抗毒性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)生物工藝的不足。

本發(fā)明以玫瑰花為原料，利用固定化酵母菌發(fā)酵玫瑰花提取物，獲得了一種品質(zhì)優(yōu)良的煙用玫瑰花提取物，該提取物在卷煙中具有豐富煙香，增加甜香和花香香韻、增加卷煙香氣透發(fā)性，口腔余味較舒適。與現(xiàn)有玫瑰花浸膏和玫瑰花提取物相比，該玫瑰花提取物在卷煙中香氣更加豐富，清甜香韻和花香韻更加明顯，卷煙香氣透發(fā)性更好；與懸浮酵母菌發(fā)酵相比，該方法制備的玫瑰花提取物中酯類香氣物質(zhì)含量增加了10.58％～14.96％，苯乙醇含量增加了20.58％～28.42％，卷煙效果評(píng)價(jià)中，香氣更加豐富，清甜香和花香韻更加明顯，口腔余味更加舒適。該方法替代了玫瑰花提取物傳統(tǒng)的提取技術(shù)，更新了生物發(fā)酵制備工藝，使得其能夠在卷煙中適用性增加，對(duì)煙用玫瑰花提取物的制備提供了一條新途徑。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)的描述。

本發(fā)明以下實(shí)施例中的pva-sa(聚乙烯醇-海藻酸鈉)固定化酵母菌小球是按照以下方法采用聚乙烯醇(pva)和海藻酸鈉(sa)對(duì)酵母菌進(jìn)行固定化得到的：

(1)將酵母菌接種到肉湯培養(yǎng)基中，在溫度37℃、攪拌轉(zhuǎn)速為50rpm的條件下培養(yǎng)48小時(shí)，取培養(yǎng)液于8000rpm下離心，離心后的濕菌體備用；上述方法中養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)為常用的普通肉湯培養(yǎng)基，其具體配方為(每升)：蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g，最終ph7.3±0.1；

(2)酵母菌的聚乙烯醇—海藻酸鈉固定化：采用聚乙烯醇水溶液與海藻酸鈉水溶液配制含質(zhì)量百分比6％～10％的聚乙烯醇和質(zhì)量百分比1％～3％的海藻酸鈉的混合溶液，然后向混合溶液中加入總?cè)芤后w積的1～3％的步驟(2)中制備的酵母菌濕菌體，配制成混合液，用蠕動(dòng)泵經(jīng)過(guò)1～5mm孔徑的針頭將配制好的混合液逐滴加入到cacl2的質(zhì)量百分比為1～3％的硼酸飽和溶液中，交聯(lián)1h形成小球，然后將小球取出再加入到飽和na2so4溶液中交聯(lián)3-5h，得pva-sa固定化酵母菌小球，然后采用無(wú)菌水沖洗，烘干備用；所述含有1-3％cacl2的硼酸飽和溶液的量和飽和na2so4溶液的量并無(wú)特殊要求，含有1-3％cacl2的硼酸飽和溶液只需要能夠使混合液產(chǎn)生沉淀，滿足乳酸菌的固定化要求即可，na2so4溶液的只需要將小球完全浸泡便可；所述硼酸飽和溶液、飽和na2so4溶液均為飽和水溶液。

本發(fā)明中采用的酵母菌為釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)hhl-1，于2009年11月17日保藏于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctccno:m209272。

實(shí)施例1，一種固定化酵母菌制備煙用玫瑰花提取物的方法，包括以下步驟：

(1)取玫瑰花，加入其重量3倍的水，在50℃下回流提取2次，每次提取時(shí)間為2小時(shí)，提取完后冷卻至室溫，并過(guò)濾得到提取液，合并兩次提取液，得到玫瑰花提取物a，兩次提取的條件完全相同；

(2)將步驟(1)中制備的玫瑰花提取物a與上述方法制備的固定化酵母菌小球按照質(zhì)量比5:1混合，在溫度為20℃，攪拌轉(zhuǎn)速為5rpm的條件下發(fā)酵4d，然后置于4℃的冷柜中保存8d；

(3)將步驟(2)發(fā)酵后發(fā)酵液過(guò)濾，得澄清發(fā)酵液，過(guò)濾后的發(fā)酵液進(jìn)行冷凍干燥，冷凍干燥的料液厚度為1～2厘米，真空度為10pa，干燥時(shí)間為10h；

(4)將步驟(3)冷凍干燥后的發(fā)酵液，加入其質(zhì)量2倍的80％酒精溶液，沉淀24小時(shí)，過(guò)濾取上清液在壓力為0.1mpa，溫度為45℃的條件下濃縮至相對(duì)密度為1.25，然后在濃縮物中加入丙二醇，得玫瑰花提取物b，所述丙二醇的加入量為總質(zhì)量的20％；

(5)將步驟(4)的玫瑰花提取物b，在壓力2pa，進(jìn)料溫度為55℃，進(jìn)料速度為20ml/min，刮板轉(zhuǎn)速為80rpm，進(jìn)行分子蒸餾，取輕組分為玫瑰花提取物。

實(shí)施例1中制備的玫瑰花提取物添加到卷煙中具有豐富煙香，清甜香韻和花香韻更加明顯，煙香透發(fā)性更好。

實(shí)施例2，一種固定化酵母菌制備煙用玫瑰花提取物的方法，包括以下步驟：

(1)取玫瑰花，加入其重量5倍的水，在60℃下回流提取2次，每次提取時(shí)間為2.5小時(shí)，提取完后冷卻至室溫，并過(guò)濾得到提取液，合并兩次提取液，得到玫瑰花提取物a，兩次提取的條件完全相同；

(2)將步驟(1)中制備的玫瑰花提取物a與上述方法制備的固定化酵母菌小球按照質(zhì)量比7:1混合，在溫度為23℃，攪拌轉(zhuǎn)速為4rpm的條件下發(fā)酵3d，然后置于4℃冷柜中保存12d；

(3)將步驟(2)發(fā)酵后發(fā)酵液過(guò)濾，得澄清發(fā)酵液，過(guò)濾后的發(fā)酵液進(jìn)行冷凍干燥，料液厚度為1～2厘米，真空度為10pa，干燥時(shí)間為8h；

(4)將步驟(3)冷凍干燥后的發(fā)酵液，加入其質(zhì)量3倍的濃度為85％酒精溶液，沉淀24小時(shí)，過(guò)濾取上清液在壓力為0.1mpa，溫度為45℃的條件下濃縮至相對(duì)密度為1.25，然后在濃縮物中加入丙二醇，得玫瑰花提取物b，所述丙二醇的加入量為總質(zhì)量的20％；

(5)將步驟(4)的玫瑰花提取物b，在壓力為5pa，進(jìn)料溫度為65℃，進(jìn)料速度為30ml/min，刮板轉(zhuǎn)速為110rpm的條件下進(jìn)行分子蒸餾，取輕組分為玫瑰花提取物。

實(shí)施例2中制備的玫瑰花提取物添加到卷煙中具有豐富煙香，清甜香韻和花香韻更加明顯，煙香透發(fā)性更好。

實(shí)施例3，一種固定化酵母菌制備煙用玫瑰花提取物的方法，包括以下步驟：

(1)取玫瑰花，加入其重量8倍的水，在65℃下回流提取3次，每次提取時(shí)間為3小時(shí)，提取完后冷卻至室溫，并過(guò)濾得到提取液，合并三次提取液，得到玫瑰花提取物a，三次提取的條件完全相同；

(2)將步驟(1)中制備的玫瑰花提取物a與上述方法制備的固定化酵母菌小球按照質(zhì)量比10:1混合，在溫度為25℃，攪拌轉(zhuǎn)速為1rpm的條件下發(fā)酵2d，然后置于4℃冷柜中保存7d；

(4)將步驟(3)發(fā)酵后發(fā)酵液過(guò)濾，得澄清發(fā)酵液，過(guò)濾后的發(fā)酵液進(jìn)行冷凍干燥，料液厚度為1～2厘米，真空度為10pa，干燥時(shí)間為6h；

(5)將步驟(4)冷凍干燥后的發(fā)酵液，加入其質(zhì)量4倍的濃度95％酒精溶液，沉淀48小時(shí)，過(guò)濾取上清液在壓力為0.1mpa，溫度為45℃的條件下濃縮至相對(duì)密度為1.35，然后在濃縮物中加入丙二醇，得玫瑰花提取物b，所述丙二醇的加入量為總質(zhì)量的20％；

(6)將步驟(5)的提取物b，在壓力10pa，進(jìn)料溫度為70℃，進(jìn)料速度為50ml/min，刮板轉(zhuǎn)速為150rpm的條件下進(jìn)行分子蒸餾，取輕組分為玫瑰花提取物。

實(shí)施例3中制備的玫瑰花提取物添加到卷煙中具有豐富煙香，清甜香韻和花香韻更加明顯，煙香透發(fā)性更好。

對(duì)比實(shí)驗(yàn)，申請(qǐng)人將本發(fā)明制備的玫瑰花提取物與現(xiàn)有傳統(tǒng)提取方法制備的玫瑰花提取物、采用懸浮酵母菌發(fā)酵制備的玫瑰花提取物按照正常加香方式添加到煙絲中，制成卷煙，并進(jìn)行評(píng)吸，其評(píng)吸效果如下：

三種不同工藝制備的玫瑰花提取在卷煙中的感官評(píng)價(jià)效果比較

從上述對(duì)比實(shí)驗(yàn)可以看出來(lái)，本發(fā)明中制備的玫瑰花提取物添加到卷煙中效果更好，而且根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，與懸浮酵母菌發(fā)酵相比，該方法制備的玫瑰花提取物中酯類香氣物質(zhì)含量增加了10.58％～14.96％，苯乙醇含量增加了20.58％～28.42％，卷煙效果評(píng)價(jià)中，香氣更加豐富，清甜香和花香韻更加明顯，口腔余味更加舒適。