本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域，具體涉及桑枝提取物或萃取物在制備抗真菌感染產(chǎn)品中的應用。

背景技術：

隨著生活水平的逐漸提高，人們的衛(wèi)生防病意識也在不斷的加強。真菌是細菌的一種，能引起動植物和人的各種疾病。不同真菌可以通過不同的方式致病，可以分為以下幾種：(1)致病性真菌感染：由外源性真菌引起，如皮膚癬病菌；(2)條件致病性真菌感染：由內(nèi)源性真菌引起，如白色念珠菌等；(3)真菌超敏反應性疾?。何牖蚴橙刖z或孢子引起蕁麻疹、哮喘等；(4)真菌性中毒癥：食用含真菌毒素的霉變糧食所致；(5)真菌毒素：與腫瘤發(fā)生有關。

人類感染的真菌主要來自外界環(huán)境，并通過接觸、吸入或食入而感染。少數(shù)致病真菌可直接致病，但多數(shù)真菌需要在一定條件下才能致病，后者稱為條件致病菌。其中，皮膚癬菌中的紅色毛癬菌通過接觸傳染，感染指(趾)甲形成足癬，還可以感染而引起頭癬、體癬、股癬、手癬等。而足癬，俗稱腳氣，具有傳染性，其難以治愈、容易交叉?zhèn)魅荆患皶r治療，久而久之會引發(fā)灰指甲的形成，同時抓撓后極易引發(fā)身體其他部位的真菌感染，嚴重影響人們的生活質(zhì)量。用于臨床的抗真菌藥皆因不能滲透角質(zhì)而對治療灰指(趾)甲無效。從前的主要治療方法為手術拔除指(趾)甲，多人畏其疼痛而為難，成為許多人特別是年輕人心頭之煩惱。目前，用于治療灰指甲的方法有口服藥和外用藥兩大類?？诜幹饕强拐婢幬镱?，如斯皮仁諾(別名：伊曲康唑、依康唑、伊康唑、依他康唑)，但口服藥往往會給人體帶來較大的傷害；久而久之，容易引起指(趾)甲對紅色毛癬菌的耐藥性等很多副作用，且安全性也不斷受到質(zhì)疑。外用藥物，如硝酸咪康唑、復方苯甲酸軟膏等西藥類，通過涂抹患處，殺滅真菌治療，但是此類藥物往往具有很大的刺激性，使用時還可能會帶來灼燒感和刺痛感，嚴重時難以忍受，且復發(fā)率較高。

同樣，白色念珠菌為條件致病性真菌，常寄生于人的皮膚、口腔、陰道和腸道粘膜處。隨著免疫功能低下或免疫缺陷的病人日益增多，其感染率不斷增加。其可侵犯人體許多部位，如皮膚皺褶處(腑窩、腹股溝，乳房下，肛門周圍及甲溝，指間)，引起皮膚潮紅、潮濕、發(fā)亮，有時病變周圍有小水泡等癥狀，同時還會引起鵝口瘡、口角炎、陰道炎、淺表潰瘍、肺炎、腸胃炎、心內(nèi)膜炎、腦膜炎、腦炎等，偶爾也可發(fā)生敗血癥。近年來，由于廣譜抗菌藥物、激素、免疫抑制劑等藥物的大量應用，介入手術的普及，惡性腫瘤、艾滋病等疾病發(fā)病率逐年上升等因素，使得念珠菌感染發(fā)病率逐年升高。目前，唑類藥物是臨床治療和預防白色念珠菌感染的首選藥物，唑類藥物的大量應用，在治療白色念珠菌感染的同時又使白色念珠菌的耐藥性提高。

因此，開發(fā)研究一種新型、高效、天然的抗真菌感染產(chǎn)品是目前所急需的，也是現(xiàn)代醫(yī)學研究的熱點。

技術實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供桑枝提取物或萃取物在制備抗真菌感染產(chǎn)品中的應用。

為達到上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：

1、桑枝提取物或萃取物在制備抗真菌感染產(chǎn)品中的應用。

進一步，所述真菌為紅色毛癬菌或白色念珠菌。

進一步，所述桑枝提取物的制備方法為：

(1)取桑枝烘干粉碎后過100目篩，獲得桑枝粉末；

(2)將步驟(1)中制得的桑枝粉末加入無水乙醇或甲醇中，經(jīng)提取獲得提取液，將所述提取液濃縮至浸膏，即得桑枝提取物ⅰ；

或?qū)⒉襟E(1)中制得的桑枝粉末加入石油醚中，經(jīng)提取獲得提取液，將所述提取液濃縮至浸膏，即得桑枝提取物ⅱ；將經(jīng)石油醚提取后的桑枝粉末加入乙酸乙酯、氯仿或丙酮中，經(jīng)提取獲得提取液，將所述提取液濃縮至浸膏，即得桑枝提取物ⅲ；將經(jīng)乙酸乙酯、氯仿或丙酮提取后的桑枝粉末加入正丁醇中，經(jīng)提取獲得提取液，將所述提取液濃縮至浸膏，即得桑枝提取物ⅳ；將經(jīng)正丁醇提取后的桑枝粉末加入水中，經(jīng)提取獲得提取液，將所述提取液濃縮至浸膏，即得桑枝提取物ⅴ。

進一步，步驟(2)中，所述桑枝粉末與無水乙醇或甲醇的質(zhì)量體積比為1mg：20ml。

進一步，步驟(2)中，所述桑枝粉末與石油醚的質(zhì)量體積比為1mg：20ml；所述經(jīng)石油醚提取后的桑枝粉末與乙酸乙酯、氯仿或丙酮的質(zhì)量體積比為1mg：20ml；所述經(jīng)乙酸乙酯、氯仿或丙酮提取后的桑枝粉末與正丁醇的質(zhì)量體積比為1mg：20ml；所述經(jīng)正丁醇提取后的桑枝粉末與水的質(zhì)量體積比為1mg：20ml。

進一步，步驟(2)中，所述提取具體為在350w下微波提取三次，每次30min。

進一步，所述桑枝萃取物的制備方法為：

(1)取桑枝烘干粉碎后過100目篩，獲得桑枝粉末；

(2)將步驟(1)中制得的桑枝粉末加入無水乙醇或甲醇中，經(jīng)提取獲得提取液，將所述提取液濃縮至浸膏，即得桑枝提取物??；將所述桑枝提取物ⅰ溶于水中，獲得桑枝提取物ⅰ水溶液，將所述桑枝提取物ⅰ水溶液加入石油醚中，經(jīng)萃取獲得萃取液，將所述萃取液濃縮至浸膏，即得桑枝萃取物?。粚⒔?jīng)石油醚萃取后的桑枝提取物ⅰ水溶液加入乙酸乙酯、氯仿或丙酮中，經(jīng)萃取獲得萃取液，將所述萃取液濃縮至浸膏，即得桑枝萃取物ⅱ；將經(jīng)乙酸乙酯、氯仿或丙酮萃取后的桑枝提取物ⅰ水溶液加入正丁醇中，經(jīng)萃取獲得萃取液，將所述萃取液濃縮至浸膏，即得桑枝萃取物ⅲ；將經(jīng)正丁醇萃取后的桑枝提取物ⅰ水溶液濃縮至浸膏，即得桑枝萃取物ⅳ。

進一步，步驟(2)中，所述桑枝粉末與無水乙醇或甲醇的質(zhì)量體積比為1mg：20ml。

進一步，步驟(2)中，所述桑枝提取物ⅰ水溶液與石油醚的體積比為1：1；所述經(jīng)石油醚萃取后的桑枝提取物ⅰ水溶液與乙酸乙酯、氯仿或丙酮的體積比為1：1；所述經(jīng)乙酸乙酯、氯仿或丙酮萃取后的桑枝提取物ⅰ水溶液與正丁醇的體積比為1：1。

進一步，步驟(2)中，所述提取具體為在350w下微波提取三次，每次30min。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明公開了桑枝提取物或萃取物在制備抗真菌感染產(chǎn)品中的應用，桑枝提取物或萃取物成分天然、安全性好，對紅色毛癬菌和白色念珠菌均具有良好的抗菌能力，能很好用于新型、高效、天然的抗真菌感染藥物的研發(fā)。其中，桑枝的乙酸乙酯萃取液對紅色毛癬菌和白色念珠菌的抗菌能力最好，對兩種菌的最小抑菌濃度分別為1mg/ml、0.5mg/ml。

附圖說明

為了使本發(fā)明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進行說明：

圖1為實施例2中不同濃度的樣液1-5對紅色毛癬菌的抑菌率圖。

具體實施方式

下面將對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件按照制造廠商所建議的條件。

本發(fā)明實施例中使用的材料及主要試劑如下：rpm-1640培養(yǎng)基(含l-谷酰胺，不含碳酸氫鈉，含ph指示劑)，購于上海士豐生物科技有限公司；二甲基亞砜(dmso)、mtt，購于上海生工生物工程有限公司；無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇，均為分析純，購于重慶川東化工集團有限公司；

桑枝(湖桑32號)，采自重慶市蠶業(yè)科學技術研究院桑樹資源圃；

紅色毛癬菌，編號為atcc28188，購買于上海士豐生物科技有限公司；

白色念珠菌，編號為cmcc(f)98001，購買于中國獸藥所。

實施例1

桑枝提取物和萃取物的制備

1、桑枝提取物的制備

(1)取無病蟲害桑枝，烘干粉碎后過100目篩，獲得桑枝粉末；

(2)將步驟(1)中制得的桑枝粉末加入無水乙醇中，在350w下微波提取三次，每次30min，收集每次的提取液并混合，將提取液濃縮至浸膏，即得桑枝提取物?。凰錾ＶΨ勰┡c無水乙醇的質(zhì)量體積比為1mg：20ml，將制得的桑枝提取物ⅰ溶于100％的二甲基亞砜制得濃度為100mg/ml的樣液1，存于-20℃冰箱備用。

2、桑枝萃取物的制備

(1)取無病蟲害桑枝，烘干粉碎后過100目篩，獲得桑枝粉末；

(2)將步驟(1)中制得的桑枝粉末加入無水乙醇中，在350w下微波提取三次，每次30min，收集每次的提取液并混合，將提取液濃縮至浸膏，即得桑枝提取物ⅰ，所述桑枝粉末與無水乙醇的質(zhì)量體積比為1mg：20ml；將所述桑枝提取物ⅰ溶于水中，獲得桑枝提取物ⅰ水溶液，按體積比1：1將所述桑枝提取物ⅰ水溶液加入石油醚中，經(jīng)萃取獲得萃取液，將所述萃取液濃縮至浸膏，即得桑枝萃取物ⅰ，將制得的桑枝萃取物ⅰ溶于100％的二甲基亞砜制得濃度為100mg/ml的樣液2，存于-20℃冰箱備用；按體積比1：1將經(jīng)石油醚萃取后的桑枝提取物ⅰ水溶液加入乙酸乙酯中，經(jīng)萃取獲得萃取液，將所述萃取液濃縮至浸膏，即得桑枝萃取物ⅱ，將制得的桑枝萃取物ⅱ溶于100％的二甲基亞砜制得濃度為100mg/ml的樣液3，存于-20℃冰箱備用；按體積比1：1將經(jīng)乙酸乙酯萃取后的桑枝提取物ⅰ水溶液加入正丁醇中，經(jīng)萃取獲得萃取液，將所述萃取液濃縮至浸膏，即得桑枝萃取物ⅲ，將制得的桑枝萃取物ⅲ溶于100％的二甲基亞砜制得濃度為100mg/ml的樣液4，存于-20℃冰箱備用；將經(jīng)正丁醇萃取后的桑枝提取物ⅰ水溶液濃縮至浸膏，即得桑枝萃取物ⅳ，將制得的桑枝萃取物ⅳ溶于100％的二甲基亞砜制得濃度為100mg/ml的樣液5，存于-20℃冰箱備用。

實施例2

桑枝提取物和萃取物對紅色毛癬菌的最小抑菌濃度(mic)檢測

用二倍稀釋法將實施例1中樣液1-5用rpm-1640培養(yǎng)基分別稀釋為2.000、1.000、0.500、0.250、0.125、0.063、0.031、0.015mg/ml八個濃度。取96孔細菌培養(yǎng)板，每孔加入100μl濃度為10⁶cfu/ml的紅色毛癬菌菌液及100μl各濃度的樣液，并設置空白對照(不含樣液的培養(yǎng)基+菌液)和溶劑對照(dmso溶液+菌液)，同時設置對照培養(yǎng)板(不加菌液)。28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)93h，通過肉眼觀察，得出各樣液最小抑菌濃度，結(jié)果見表1。然后將96孔培養(yǎng)板取出，每孔加入20μl5.0mg/ml的mtt試劑，28℃恒溫孵育3-4h后，取出96孔培養(yǎng)板，2500r/min離心5min，每孔吸出100μl上清液棄去，再加入100μl二甲亞砜，震蕩30min后再次離心，將上清液轉(zhuǎn)移至新96孔板中，酶標儀530nm下檢測吸光值，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)通過公式：抑制率(％)＝(1-測定孔od530nm值/空白對照孔od530nm值)×100計算其抑菌率，結(jié)果見表2，并繪制成圖，如圖1所示，由表2和圖1可知：各樣液對紅色毛癬菌的抑制效果均為濃度依賴型，桑枝提取物及其各萃取物對紅色毛癬菌具有一定的抑菌作用。其中，樣液3在濃度為1mg/ml時，能夠完全抑制紅色毛癬菌的生長，則其最小抑菌濃度(mic)為1mg/ml；其次是樣液1和樣液2，當濃度為1mg/ml時，其抑制率為83.10％和84.31％；樣液4和樣液5活性相對較差，但在濃度為1mg/ml時，也具有一定的抑制活性，其抑制率分別為50.98％和44.44％。

表1樣液1-5作用于紅色毛癬菌的最小抑菌濃度

注：樣液1為桑枝的無水乙醇提取液，樣液2為桑枝的石油醚萃取液，樣液3為桑枝的乙酸乙酯萃取液，樣液4為桑枝的正丁醇萃取液，樣液5為桑枝的水萃取液。

由表1可知，樣液1-5對紅色毛癬菌均具有抑菌作用，其中，樣液3對紅色毛癬菌的抑制活性最好，即桑枝的乙酸乙酯萃取物對紅色毛癬菌的抑制活性最好，最小抑菌濃度為1.00mg/ml，樣液1、樣液2、樣液4和樣液5對對紅色毛癬菌的最小抑菌濃度均大于1.00mg/ml。

表2不同濃度的樣液1-5對紅色毛癬菌的抑菌率

注：肩字母相同表示差異不顯著，肩字母不同表示差異顯著(p<0.01)，樣液1為桑枝的無水乙醇提取液，樣液2為桑枝的石油醚萃取液，樣液3為桑枝的乙酸乙酯萃取液，樣液4為桑枝的正丁醇萃取液，樣液5為桑枝的水萃取液。

實施例3

桑枝提取物和萃取物對白色念珠菌的最小抑菌濃度(mic)檢測

用二倍稀釋法將實施例1中樣液1-5用rpm-1640培養(yǎng)基分別稀釋為2.000、1.000、0.500、0.250、0.125、0.063、0.031、0.015mg/ml八個濃度。取96孔細菌培養(yǎng)板，每孔加入100μl濃度為10⁶cfu/ml的白色念珠菌菌液及100μl各濃度的樣液，并設置空白對照(不含樣液的培養(yǎng)基+菌液)和溶劑對照(dmso溶液+菌液)，同時設置對照培養(yǎng)板(不加菌液)。28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。經(jīng)測試發(fā)現(xiàn)樣液3對白色念珠菌的抑菌作用最好，即桑枝的乙酸乙酯萃取物對白色念珠菌的抑菌作用最好，其最小抑菌濃度為0.5mg/ml。

實施例4

桑枝提取物和萃取物對白色念珠菌的最小殺菌濃度檢測

在實施例3中最小抑菌濃度的基礎上，按照mic的試驗方法，將樣液3配置為2倍mic、4倍mic、8倍mic、16倍mic，取96孔細菌培養(yǎng)板，每孔加入100μl濃度為10⁶cfu/ml的白色念珠菌菌液，再加入100μl相應濃度的各樣液，并設置空白對照(不含樣液的培養(yǎng)基+菌液)和溶劑對照(dmso溶液+菌液)。28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，然后每孔取20μl菌液接種在新鮮的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)，無活菌生長的最小濃度即為最小殺菌濃度，經(jīng)測試發(fā)現(xiàn)樣液3，即桑枝的乙酸乙酯萃取物對白色念珠菌的最小殺菌濃度>1mg/ml。

本發(fā)明中，除了用無水乙醇制備桑枝提取物，還可用甲醇；除了用乙酸乙酯制備桑枝萃取物，還可用氯仿或丙酮。

最后說明的是，以上優(yōu)選實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了詳細的描述，但本領域技術人員應當理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權利要求書所限定的范圍。